JP5424353B2 - 硬組織再生治療用組成物 - Google Patents
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Description
本発明はＳ．ｍｕｔａｎｓ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）および／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎｕｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）を含む硬組織再生治療用組成物に関する。さらに詳しくは、象牙質および／または歯周組織の再生や、骨組織の再生用治療剤に有効成分として含まれる当該硬組織再生治療用組成物に関する。
従来から、Ｓ．ｍｕｔａｎｓはカリエス（虫歯）の原因菌、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは歯周病の原因菌とされてきた。そのため、カリエスや歯周病の治療や予防等のために、Ｓ．ｍｕｔａｎｓに対する殺菌活性を有し、かつ間葉系幹細胞の細胞増殖効果を有する塩基性抗菌ペプチド（例えば、特許文献１参照）や、ポリフェノールを有効成分として含有するＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの歯周組織への付着阻害剤（例えば、特許文献２参照）、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓより引き起こされる疾病および感染を治療または予防するための特定のアミノ酸を含む免疫原性ポリペプチド（例えば、特許文献３参照）等が開発されてきた。
しかし、Ｓ．ｍｕｔａｎｓやＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは、口腔内に常在する菌であり、存在しているからといって必ずしもカリエスや歯周病になるわけではなく、これらの細菌が低濃度感染することで、カリエスや歯周病が惹起されると考えられた。
臨床の現場において、カリエスが惹起された段階で、カリエスの進行とは逆に、象牙質が再生することが観察されている。これは、カリエスによって象牙質が融解され、象牙質のマトリックスに存在する増殖因子が象牙細管を通って象牙芽細胞に刺激を与えたことによって起こるものと考えられている。
このことから、本発明者らは、低濃度の細菌の感染によって、歯髄細胞、歯根膜細胞等の細胞の増殖が活発化され、これによって象牙質や歯周組織の再生が促進される可能性があると考え、これらの細菌を含む硬組織再生治療用組成物について検討を行った。
臨床の現場において、カリエスが惹起された段階で、カリエスの進行とは逆に、象牙質が再生することが観察されている。これは、カリエスによって象牙質が融解され、象牙質のマトリックスに存在する増殖因子が象牙細管を通って象牙芽細胞に刺激を与えたことによって起こるものと考えられている。
このことから、本発明者らは、低濃度の細菌の感染によって、歯髄細胞、歯根膜細胞等の細胞の増殖が活発化され、これによって象牙質や歯周組織の再生が促進される可能性があると考え、これらの細菌を含む硬組織再生治療用組成物について検討を行った。
象牙質や歯周組織の再生剤としては、水酸化カルシウムによる歯髄覆罩剤や、増殖因子による歯周組織再生剤が提供されているが、いずれにおいても１００％の成功率を得ることは難しく、まだ、改良すべき点が残されているのが現状である。そこで、新たな硬組織再生治療用組成物が提供されることが期待されている。
〔先行文献〕
特開２００５−２８１２２５号公報
特許第３８３７１７２号公報
特表２００７−５２９１９５号公報
〔先行文献〕
本発明は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物を提供することを課題とする。
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが高濃度で存在する場合には、カリエスや歯周病の原因菌として作用をするが、低濃度で存在する場合には、歯髄細胞の象牙芽細胞または骨芽細胞への分化を促進することを見出した。そこで、Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを低濃度含む硬組織再生治療用組成物を得て、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、次の（１）〜（８）の硬組織再生治療用組成物等に関する。
（１）Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物。
（２）Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが菌体破砕物である上記（１）に記載の硬組織再生治療用組成物。
（３）Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１００μｇ／ｍｌ未満である上記（１）または（２）に記載の硬組織再生治療用組成物。
（４）象牙質および／または歯周組織の再生に用いる上記（１）〜（３）のいずれかに記載の硬組織再生治療用組成物。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の硬組織再生治療用組成物を有効成分として含む歯髄覆罩剤。
（６）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の硬組織再生治療用組成物を有効成分として含む骨組織の再生用治療剤。
（７）Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む細胞の分化促進用組成物。
（８）Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む細胞のアルカリフォスファターゼ（以下、ＡＬＰとする）活性向上用組成物。
（１）Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物。
（２）Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが菌体破砕物である上記（１）に記載の硬組織再生治療用組成物。
（３）Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１００μｇ／ｍｌ未満である上記（１）または（２）に記載の硬組織再生治療用組成物。
（４）象牙質および／または歯周組織の再生に用いる上記（１）〜（３）のいずれかに記載の硬組織再生治療用組成物。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の硬組織再生治療用組成物を有効成分として含む歯髄覆罩剤。
（６）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の硬組織再生治療用組成物を有効成分として含む骨組織の再生用治療剤。
（７）Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む細胞の分化促進用組成物。
（８）Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む細胞のアルカリフォスファターゼ（以下、ＡＬＰとする）活性向上用組成物。
本発明の硬組織再生治療用組成物によって象牙質および／または歯周組織の再生を行うことで、カリエスや歯周病等のＳ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓよって引き起こされる疾病や感染を治療または予防することが可能となる。
本発明の「硬組織再生治療用組成物」は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓまたはこれらを組合せて含む組成物であり、骨，歯，毛髪，爪等の硬組織の再生に利用できるものであればいずれのものも含まれる。象牙質や歯周組織等の再生に利用できるものであることが特に好ましい。
本発明の「硬組織再生治療用組成物」に含まれるＳ．ｍｕｔａｎｓ、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは、「硬組織再生治療用組成物」として人体等に投与した場合に安全なものであれば、細菌の寄託機関等に保管されているものや市販されているもの等、いずれのものも用いることができる。また、患者由来のＳ．ｍｕｔａｎｓ、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを採取して、それ自体を含ませることもできる。
本発明の「硬組織再生治療用組成物」に含まれるこれらの細菌は、「硬組織再生治療用組成物」として効果があるものであれば、生菌でも、破砕等した死菌であっても良いが、安全面において死菌の方がより好ましい。
本発明の「硬組織再生治療用組成物」に含まれるこれらの細菌は、菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１００μｇ／ｍｌ未満となるように含まれることが好ましく、特に１０μｇ／ｍｌ以下の低濃度で含まれることが好ましい。
本発明の「硬組織再生治療用組成物」は、骨，歯，毛髪，爪等の硬組織の再生に用いることができるものであることが好ましく、特に歯髄細胞、歯根膜細胞等に作用し得る、象牙質、歯周組織またはこれらのいずれの再生にも用いることができるものであることが好ましい。
本発明の「硬組織再生治療用組成物」は、歯髄覆罩剤や骨組織の再生用治療剤の有効成分として用いることができる。
この「歯髄覆罩剤」としては、本発明の「硬組織再生治療用組成物」をそのまま用いたもの、または水酸化カルシウム等と組み合わせたもの等が挙げられる。また、「骨組織の再生用治療剤」としては、本発明の「硬組織再生治療用組成物」をそのまま用いたもの、またはコラーゲン、ＢＭＰやＦＧＦなどの増殖因子等と組み合わせたもの等が挙げられる。この「骨組織の再生用治療剤」は、骨組織の再生のために、ゲル状にして骨欠損部にシリンジにて注入する方法や、コラーゲンのスポンジなどに浸み込ませて骨欠損部に移植する方法等に用いることができる。
さらに、本発明の「硬組織再生治療用組成物」は、増殖因子等と組合せて、歯周組織再生剤とすることもできる。
これらの「歯髄覆罩剤」や「骨組織の再生用治療剤」等は薬剤としての形態は特に問わないが、一般に知られているゲル剤、保湿剤、増粘剤等と組合せて、軟膏剤、塗布剤として提供することもできる。
この「歯髄覆罩剤」としては、本発明の「硬組織再生治療用組成物」をそのまま用いたもの、または水酸化カルシウム等と組み合わせたもの等が挙げられる。また、「骨組織の再生用治療剤」としては、本発明の「硬組織再生治療用組成物」をそのまま用いたもの、またはコラーゲン、ＢＭＰやＦＧＦなどの増殖因子等と組み合わせたもの等が挙げられる。この「骨組織の再生用治療剤」は、骨組織の再生のために、ゲル状にして骨欠損部にシリンジにて注入する方法や、コラーゲンのスポンジなどに浸み込ませて骨欠損部に移植する方法等に用いることができる。
さらに、本発明の「硬組織再生治療用組成物」は、増殖因子等と組合せて、歯周組織再生剤とすることもできる。
これらの「歯髄覆罩剤」や「骨組織の再生用治療剤」等は薬剤としての形態は特に問わないが、一般に知られているゲル剤、保湿剤、増粘剤等と組合せて、軟膏剤、塗布剤として提供することもできる。
本発明の「分化促進用組成物」とは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含むものであり、細胞の分化を誘導し、または促進するものであればいずれのものも含まれる。例えば、歯髄細胞の象牙芽細胞または骨芽細胞への分化を促進するＳ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む組成物が挙げられる。
本発明の「ＡＬＰ活性向上用組成物」とは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含むものであり、細胞のＡＬＰ活性を向上するものであればいずれのものも含まれる。例えばヒト歯髄由来線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ ｄｅｎｔａｌ ｐｕｌｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：以下、ｈＤＰＦとする）のＡＬＰ活性を向上するＳ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む組成物が挙げられる。
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜硬組織再生治療用組成物の調製＞
１．Ｓ．ｍｕｔａｎｓを含む硬組織再生治療用組成物
以下のａ．〜ｄ．の工程によりＳ．ｍｕｔａｎｓを含む硬組織再生治療用組成物を調製した。
ａ．Ｔｏｄｄ Ｈｅｗｉｔ ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）に接種したＳ．ｍｕｔａｎｓ ＭＴ８１４８Ｒを、１０％ＣＯ２，１０％Ｈ２および８０％Ｎ２の嫌気条件下で、３７℃で２日間培養した。
ｂ．菌体を遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間、４℃）によって回収し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。
ｃ．超音波破砕機（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ ＵＣＤ−２００Ｔ，株式会社コスモバイオ）を用いて３０秒の超音波破砕と１分のインターバルで６０分間繰り返し菌体を破砕した。
ｄ．破砕抽出物を遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間、４℃）し、上清をＳ．ｍｕｔａｎｓ（菌体破砕物）を含む硬組織再生治療用組成物として用いた。
１．Ｓ．ｍｕｔａｎｓを含む硬組織再生治療用組成物
以下のａ．〜ｄ．の工程によりＳ．ｍｕｔａｎｓを含む硬組織再生治療用組成物を調製した。
ａ．Ｔｏｄｄ Ｈｅｗｉｔ ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）に接種したＳ．ｍｕｔａｎｓ ＭＴ８１４８Ｒを、１０％ＣＯ２，１０％Ｈ２および８０％Ｎ２の嫌気条件下で、３７℃で２日間培養した。
ｂ．菌体を遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間、４℃）によって回収し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。
ｃ．超音波破砕機（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ ＵＣＤ−２００Ｔ，株式会社コスモバイオ）を用いて３０秒の超音波破砕と１分のインターバルで６０分間繰り返し菌体を破砕した。
ｄ．破砕抽出物を遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間、４℃）し、上清をＳ．ｍｕｔａｎｓ（菌体破砕物）を含む硬組織再生治療用組成物として用いた。
２．Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物
以下のａ．〜ｄ．の工程によりＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物を調製した。
ａ．Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３３２７７を、ヘミン（５ｍｇ／ｍｌ）、メナジオン（０．５ｍｇ／ｍｌ）および１０％脱線維素ウマ血液を添加したトリプティックソイ培地（Ｔｒｉｐｔｉｃ Ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）に接種し、１０％ＣＯ２，１０％Ｈ２および８０％Ｎ２の嫌気条件下で、３７℃で２日間培養した。
ｂ．菌体を遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間、４℃）によって回収し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。
ｃ．超音波破砕機（Ｂｒａｓｏｎ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ，ＵＳＡ）を用いて出力１００Ｗ，３０秒の超音波破砕と１分間のインターバルで５分間繰り返し菌体を破砕した。
ｄ．破砕抽出物を遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間、４℃）し、上清をＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（菌体破砕物）を含む硬組織再生治療用組成物として用いた。
以下のａ．〜ｄ．の工程によりＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物を調製した。
ａ．Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３３２７７を、ヘミン（５ｍｇ／ｍｌ）、メナジオン（０．５ｍｇ／ｍｌ）および１０％脱線維素ウマ血液を添加したトリプティックソイ培地（Ｔｒｉｐｔｉｃ Ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）に接種し、１０％ＣＯ２，１０％Ｈ２および８０％Ｎ２の嫌気条件下で、３７℃で２日間培養した。
ｂ．菌体を遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間、４℃）によって回収し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。
ｃ．超音波破砕機（Ｂｒａｓｏｎ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ，ＵＳＡ）を用いて出力１００Ｗ，３０秒の超音波破砕と１分間のインターバルで５分間繰り返し菌体を破砕した。
ｄ．破砕抽出物を遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間、４℃）し、上清をＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（菌体破砕物）を含む硬組織再生治療用組成物として用いた。
［試験例１］
＜硬組織再生治療用組成物の検討＞
１．試料
１）硬組織再生治療用組成物
実施例１において調製した各硬組織再生治療用組成物における菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度をプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて調べ、菌体破砕物に含まれるタンパク質の最終濃度が１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌまたは０．０１μｇ／ｍｌとなるように調製して用いた。
２）リポポリサッカリド（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃａｒｉｄｅ：ＬＰＳ）
比較試料として大腸菌Ｏ５５が産生したＬＰＳを用いた。ＬＰＳ濃度が１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌまたは０．０１μｇ／ｍｌとなるように調製して用いた。
＜硬組織再生治療用組成物の検討＞
１．試料
１）硬組織再生治療用組成物
実施例１において調製した各硬組織再生治療用組成物における菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度をプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて調べ、菌体破砕物に含まれるタンパク質の最終濃度が１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌまたは０．０１μｇ／ｍｌとなるように調製して用いた。
２）リポポリサッカリド（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃａｒｉｄｅ：ＬＰＳ）
比較試料として大腸菌Ｏ５５が産生したＬＰＳを用いた。ＬＰＳ濃度が１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌまたは０．０１μｇ／ｍｌとなるように調製して用いた。
３）ｈＤＰＦ以下のａ．〜ｅ．の工程によりｈＤＰＦを調製した。
ａ．歯列矯正術を受けている３人の患者から、矯正治療中にｈＤＰＦが含まれている下顎の３番目の臼歯を抜歯しｈＤＰＦを採取した。
ｂ．歯髄組織を歯から分離し、１ｍｍ３以下の小片に細分化した。それから、６０Ｕ／ｍｌのディスパーゼＩＩ（合同酒精株式会社）および２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（和光純薬工業株式会社）を含むＨＢＳ溶液（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で、３７℃で２０分間酵素処理した。
ｃ．少量の組織を１０ｃｍ培養皿に入れ、１０％ＦＣＳ血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ，ＵＳＡ）、グルタミン（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１００μＭアスコルビン酸を添加したα−ＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社）を含む増殖培地で培養した。
ｄ．組織から這い出した細胞を培養し、３日ごとに培地を交換し、継代培養されたｈＤＰＦの形態を位相差顕微鏡で観察した。
ｅ．コンフレントになった細胞を０．０５％のトリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡで剥離し、継代培養を行い、２代目のｈＤＰＦを試験に用いた。
ａ．歯列矯正術を受けている３人の患者から、矯正治療中にｈＤＰＦが含まれている下顎の３番目の臼歯を抜歯しｈＤＰＦを採取した。
ｂ．歯髄組織を歯から分離し、１ｍｍ３以下の小片に細分化した。それから、６０Ｕ／ｍｌのディスパーゼＩＩ（合同酒精株式会社）および２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（和光純薬工業株式会社）を含むＨＢＳ溶液（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で、３７℃で２０分間酵素処理した。
ｃ．少量の組織を１０ｃｍ培養皿に入れ、１０％ＦＣＳ血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ，ＵＳＡ）、グルタミン（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１００μＭアスコルビン酸を添加したα−ＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社）を含む増殖培地で培養した。
ｄ．組織から這い出した細胞を培養し、３日ごとに培地を交換し、継代培養されたｈＤＰＦの形態を位相差顕微鏡で観察した。
ｅ．コンフレントになった細胞を０．０５％のトリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡで剥離し、継代培養を行い、２代目のｈＤＰＦを試験に用いた。
２．試験および結果
１）細胞増殖
細胞カウントキット−８（ＷＳＴ−８；Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて細胞増殖を測定した。即ち継代２代目のｈＤＰＦを１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１２ｗｅｌｌ）となるように培養皿に播種し、本発明の硬組織再生治療用組成物またはＬＰＳをそれぞれ添加した完全培地で培養を行った。また、硬組織再生治療用組成物またはＬＰＳを添加しないｈＤＰＦをコントロールとして、培養を行った。培養１４日目、２８日目の細胞数をＷＳＴ−８ｋｉｔ（キシダ化学株式会社）を用い、吸光度４５０ｎｍ（ＳｍａｒｔＳｐｅｃｋＴＭ ３０００，ＢＩＯ−ＲＡＤ）で測定後、細胞数を算定することで調べた。
その結果、Ｓ．Ｍｕｔａｎｓ またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物では、コントロールに比べて細胞の増殖が少なかった。特に、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物では、菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１００μｇ／ｍｌと高濃度のものにおいて、有意に細胞の増殖が少なかった。
ＬＰＳを用いた場合にはいずれもコントロールと同様に細胞が増殖したことから、本発明のＳ．Ｍｕｔａｎｓ またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物においてｈＤＰＦの増殖が抑制されたのは、菌体破砕液中のＬＰＳの関与によるものではないことが示唆された。
１）細胞増殖
細胞カウントキット−８（ＷＳＴ−８；Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて細胞増殖を測定した。即ち継代２代目のｈＤＰＦを１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１２ｗｅｌｌ）となるように培養皿に播種し、本発明の硬組織再生治療用組成物またはＬＰＳをそれぞれ添加した完全培地で培養を行った。また、硬組織再生治療用組成物またはＬＰＳを添加しないｈＤＰＦをコントロールとして、培養を行った。培養１４日目、２８日目の細胞数をＷＳＴ−８ｋｉｔ（キシダ化学株式会社）を用い、吸光度４５０ｎｍ（ＳｍａｒｔＳｐｅｃｋＴＭ ３０００，ＢＩＯ−ＲＡＤ）で測定後、細胞数を算定することで調べた。
その結果、Ｓ．Ｍｕｔａｎｓ またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物では、コントロールに比べて細胞の増殖が少なかった。特に、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物では、菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１００μｇ／ｍｌと高濃度のものにおいて、有意に細胞の増殖が少なかった。
ＬＰＳを用いた場合にはいずれもコントロールと同様に細胞が増殖したことから、本発明のＳ．Ｍｕｔａｎｓ またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物においてｈＤＰＦの増殖が抑制されたのは、菌体破砕液中のＬＰＳの関与によるものではないことが示唆された。
２）ＡＬＰ活性
継代２代目のｈＤＰＦを３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１２ｗｅｌｌ）となるように培養皿に播種し、本発明の硬組織再生治療用組成物またはＬＰＳをそれぞれ添加した増殖培地で培養を行った。また、硬組織再生治療用組成物またはＬＰＳを添加しないｈＤＰＦをコントロールとして、培養を行った。培養１４日目、２８日目のＡＬＰ活性を、ＳＩＧＭＡ−ＦＡＤＴ ｒ−ｎｉｔｏｒｏｐｈｅｎｙｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔａｂｌｅｔ ｓｅｔｓ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ）を用いて吸光度４０５ｎｍ（ＳｍａｒｔＳｐｅｃｋＴＭ ３０００，ＢＩＯ−ＲＡＤ）で酵素反応を調べることによって定量した。
継代２代目のｈＤＰＦを３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１２ｗｅｌｌ）となるように培養皿に播種し、本発明の硬組織再生治療用組成物またはＬＰＳをそれぞれ添加した増殖培地で培養を行った。また、硬組織再生治療用組成物またはＬＰＳを添加しないｈＤＰＦをコントロールとして、培養を行った。培養１４日目、２８日目のＡＬＰ活性を、ＳＩＧＭＡ−ＦＡＤＴ ｒ−ｎｉｔｏｒｏｐｈｅｎｙｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔａｂｌｅｔ ｓｅｔｓ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ）を用いて吸光度４０５ｎｍ（ＳｍａｒｔＳｐｅｃｋＴＭ ３０００，ＢＩＯ−ＲＡＤ）で酵素反応を調べることによって定量した。
その結果、図１に示したように、Ｓ．ｍｕｔａｎｓを含む硬組織再生治療用組成物では、菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１０μｇ／ｍｌのものが、コントロールまたは菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１００μｇ／ｍｌと高濃度であるものと比べて有意にＡＬＰ活性が高かった。菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌまたは０．０１μｇ／ｍｌのものもこれらに比べてＡＬＰ活性が高いことから、低濃度のＳ．ｍｕｔａｎｓを含む硬組織再生治療用組成物がｈＤＰＦに作用することで象牙芽細胞または骨芽細胞への分化を促進し、象牙質の再生に働くことが示唆された。
また、図２に示したように、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物を用いた場合には、菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が０．０１μｇ／ｍｌのものが、コントロールまたは菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１００μｇ／ｍｌと高濃度であるものと比べて有意にＡＬＰ活性が高かった。菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌまたは０．１μｇ／ｍｌのものもこれらに比べてＡＬＰ活性が高いことから、低濃度のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物も、ｈＤＰＦに作用することで象牙芽細胞または骨芽細胞への分化を促進し、象牙質の再生に働くことが示唆された。
また、図２に示したように、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物を用いた場合には、菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が０．０１μｇ／ｍｌのものが、コントロールまたは菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１００μｇ／ｍｌと高濃度であるものと比べて有意にＡＬＰ活性が高かった。菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌまたは０．１μｇ／ｍｌのものもこれらに比べてＡＬＰ活性が高いことから、低濃度のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物も、ｈＤＰＦに作用することで象牙芽細胞または骨芽細胞への分化を促進し、象牙質の再生に働くことが示唆された。
３）硬組織形成細胞マーカー遺伝子の発現確認
上記２．２）において、ＡＬＰ活性の増加がみられた菌体破砕物に含まれるタンパクの最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように調製したＳ．ｍｕｔａｎｓを含む硬組織再生治療用組成物、菌体破砕物に含まれるタンパクの最終濃度が０．０１μｇ／ｍｌとなるように調製したＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物をそれぞれ添加した増殖培地で、継代２代目のｈＤＰＦを１０日間培養し、硬組織形成細胞マーカーであるｂｏｎｅ ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＳＰ）のｍＲＮＡの発現を調べた。硬組織再生治療用組成物を添加しないｈＤＰＦをコントロールとした。
培養後の各細胞からＲＮＡを、トライゾール溶液（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってｃＤＮＡに変換した。その後、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ），と２０mＭ ｐｒｉｍｅｒｓ（配列表配列番号１、２）によって増幅し、ＢＳＰのｍＲＮＡの発現量を比較解析した。
上記２．２）において、ＡＬＰ活性の増加がみられた菌体破砕物に含まれるタンパクの最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように調製したＳ．ｍｕｔａｎｓを含む硬組織再生治療用組成物、菌体破砕物に含まれるタンパクの最終濃度が０．０１μｇ／ｍｌとなるように調製したＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物をそれぞれ添加した増殖培地で、継代２代目のｈＤＰＦを１０日間培養し、硬組織形成細胞マーカーであるｂｏｎｅ ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＳＰ）のｍＲＮＡの発現を調べた。硬組織再生治療用組成物を添加しないｈＤＰＦをコントロールとした。
培養後の各細胞からＲＮＡを、トライゾール溶液（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってｃＤＮＡに変換した。その後、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ），と２０mＭ ｐｒｉｍｅｒｓ（配列表配列番号１、２）によって増幅し、ＢＳＰのｍＲＮＡの発現量を比較解析した。
その結果、菌体破砕液を添加していない細胞においては、ＢＳＰの発現がみられなかったが、菌体破砕物に含まれるタンパクの最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように調製したＳ．ｍｕｔａｎｓを含む硬組織再生治療用組成物、または菌体破砕物に含まれるタンパクの最終濃度が０．０１μｇ／ｍｌとなるように調製したＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物を用いた場合には、図３に示すようにＢＳＰの発現が増加することが示された。
従って、この結果より、本発明のＳ．ｍｕｔａｎｓを含む硬組織再生治療用組成物およびＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物がｈＤＰＦに作用することで象牙芽細胞または骨芽細胞への分化を促進し、象牙質の再生に働くことが示唆された。
従って、この結果より、本発明のＳ．ｍｕｔａｎｓを含む硬組織再生治療用組成物およびＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物がｈＤＰＦに作用することで象牙芽細胞または骨芽細胞への分化を促進し、象牙質の再生に働くことが示唆された。
本発明の硬組織再生治療用組成物は象牙質および／または歯周組織の再生に働くことから、歯髄覆罩剤や骨組織の再生用治療剤の有効成分として利用することができる。
Claims (6)
- ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）および／またはポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎｕｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の菌体破砕物を含む硬組織再生治療用組成物であって、該菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が０．０１μｇ／ｍｌ以上１０μｇ／ｍｌ以下である硬組織再生治療用組成物。
- 象牙質および／または歯周組織の再生に用いる請求項１に記載の硬組織再生治療用組成物。
- 請求項１または２に記載の硬組織再生治療用組成物を有効成分として含む歯髄覆罩剤。
- 請求項１または２に記載の硬組織再生治療用組成物を有効成分として含む骨組織の再生用治療剤。
- ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）および／またはポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎｕｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の菌体破砕物を含むヒト歯髄由来線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ ｄｅｎｔａｌ ｐｕｌｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）の象牙芽細胞または骨芽細胞への分化促進用組成物であって、該菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が０．０１μｇ／ｍｌ以上１０μｇ／ｍｌ以下であるヒト歯髄由来線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ ｄｅｎｔａｌ ｐｕｌｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）の象牙芽細胞または骨芽細胞への分化促進用組成物。
- ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）および／またはポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎｕｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の菌体破砕物を含む細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性向上用組成物であって、該菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が０．０１μｇ／ｍｌ以上１０μｇ／ｍｌ以下であるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性向上用組成物。
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