ES2892974T3

ES2892974T3 - Composiciones que comprenden células madre mesenquimales y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2892974T3
Application number: ES16725382T
Authority: ES
Inventors: Denis Dufrane
Original assignee: Universite Catholique de Louvain UCL
Current assignee: Universite Catholique de Louvain UCL
Priority date: 2015-05-08
Filing date: 2016-05-09
Publication date: 2022-02-07
Anticipated expiration: 2036-05-09
Also published as: WO2016180789A1; CA2985272C; IL255480A; RU2017139096A3; ZA201707478B; RU2017139096A; IL255480B; BR112017024013A2; CN107810014B; CA2985272A1; AU2022241581A1; EP3090764A1; JP2018515211A; AU2020207792A1; CN107810014A; JP2021184828A; US20180126039A1; EP3294356A1; RU2758468C2; JP6966332B2

Abstract

Una composición que comprende una matriz biocompatible y una población de células madre mesenquimales, en donde dichas células madre mesenquimales se derivan de tejido adiposo, en donde dicha población de células madre mesenquimales es sustancialmente pura, en donde dichas células madre mesenquimales son indiferenciadas y en donde dicha población de células madre mesenquimales comprende menos del 25 % de fibroblastos.

Description

d e s c r ip c ió n

Composiciones que comprenden células madre mesenquimales y ^usosde las mismas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un producto biomédico y ^{su uso}para el tratamiento de lesiones de tejidos blandos. En particular, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden una población de células madre mesenquimales y una matriz biocompatible.

Antecedentes de la invención

Cada año, millones de personas buscan tratamiento médico para lesiones agudas ^opor ^usoexcesivo de los tejidos blandos, por ejemplo, lesiones en la piel (como heridas en la piel que no cicatrizan) ^oen los músculos (como heridas traumáticas ^oquirúrgicas). El proceso de cicatrización de la herida sigue un patrón preciso que incluye tres fases: la fase inflamatoria que consiste de la liberación de citocinas para mejorar la respuesta inflamatoria; la fase de reparación ^oproliferación caracterizada por la activación y proliferación de células progenitoras bajo la influencia de factores de crecimiento y citocinas y por angiogénesis; y la fase de remodelación ^omaduración caracterizada por tejido cicatricial y enlaces cruzados de colágeno con otro colágeno y con moléculas de proteína, lo que aumenta la resistencia a la tracción de la cicatriz.

Se propusieron varios enfoques de medicina regenerativa pero están limitados por ^susaplicaciones clínicas: la inyección local de factores de crecimiento permanece asociada con un rápido agotamiento de la concentración local, gradiente inadecuado y pérdida de bioactividad (Borselli y otros, Proc Nati Acad Sci U S ^a. 2010, 107:3287-3292); La implantación directa de una matriz extracelular descelularizada (que contiene VEGF y bFGF nativos) se asocia con la liberación incontrolada de factores de crecimiento y la falta de biocompatibilidad que se debe principalmente a los orígenes xenógenos (Keane y otros, Biomaterials. 20l2, 33: 1771-1781); y el trasplante de células musculares diferenciadas, por ejemplo, está limitado por un injerto celular bajo en la fase temprana después de la implantación por estrés hipóxico (Turner y Badylak, Cell Tissue Res. 2012, 347:759-774).

Luego se propusieron células madre para mejorar la remodelación del tejido muscular isquémico mediante una alta tasa de proliferación y autorrenovación, resistencia al estrés oxidativo ^ohipóxico (Camassola y otros, Methods Mol Biol Clifton NJ. 2012, 879:491-504), miogénesis, angiogénesis e inmunomodulación celular local (Hong y otros, Curr Opin Organ Transplant. 2010,15:86-91).

Además, se demostró previamente que las células madre sembradas en un producto tisular que contiene matriz de colágeno mejoran la reparación de heridas, en comparación con las células no madre sembradas en el mismo producto tisular que contiene matriz de colágeno (Lafosse y otros, Plástic and Reconstructive Surgery 2015, 136(2):279-95).

Estudios recientes describieron una armazón tridimensional sembrada con células madre mesenquimales, como se describe en el Solicitud de patente europea EP 2 374 485 y en la solicitud de patente de EE. UU. US 2013/0 121 973. Sin embargo, estas solicitudes de patente están dirigidas a células madre mesenquimales diferenciadas, en particular a fibroblastos. De manera similar, la solicitud de patente internacional WO 2014/150784 describió una composición para el tratamiento de las lesiones de tejidos blandos que comprende una matriz de colágeno y una suspensión celular que contiene células madre mesenquimales y células madre no mesenquimales. Sin embargo, estos sustitutos ^ocomposiciones no se analizaron en ^vivo, en particular en humanos.

Por tanto, todavía existe la necesidad de mejorar la eficacia de los tratamientos corrientes para las lesiones de tejidos blandos. L^osSolicitantes demostraron sorprendentemente que una población de células madre mesenquimales sustancialmente puras puede mejorar la reparación y regeneración en el sitio de la lesión en comparación con una población de células madre mesenquimales que no son sustancialmente puras.

El alcance de la protección está definido por las reivindicaciones.

Cualquiera referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a las composiciones de la presente invención para ^{su uso}en un método para el tratamiento del cuerpo humano ^oanimal.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a una composición que comprende una población de células madre mesenquimales sustancialmente puras y una matriz biocompatible, como se define en las reivindicaciones 1-6), y dicha composición para ^{su uso}en el tratamiento de lesiones de tejidos blandos en un sujeto que lo necesite (reivindicaciones 7-12).

Resumen de la invención

Esta invención se refiere a una composición que comprende una matriz biocompatible y una población de células madre mesenquimales (MSC), en donde dicha población de células madre mesenquimales es sustancialmente pura. La población de células madre mesenquimales de la invención comprende menos del 25 % de fibroblastos.

Las células madre mesenquimales de la invención no están diferenciadas.

Las células madre mesenquimales de la composición se derivan de tejido adiposo, con mayor preferencia del tejido adiposo subcutáneo.

De acuerdo con una modalidad, la matriz biocompatible de la invención es celular.

En una modalidad, la matriz biocompatible de la invención comprende colágeno.

En una modalidad, la matriz biocompatible de la invención es humana, porcina, bovina ^oequina.

De acuerdo con una modalidad, las células madre mesenquimales de la invención proceden del sujeto a tratar. La invención también se refiere a una composición que comprende una matriz biocompatible y una población de células madre mesenquimales como se describe anteriormente para ^{su uso}en el tratamiento de lesiones de tejidos blandos en un sujeto que lo necesite.

De acuerdo con una modalidad, el tejido blando a tratar en la invención se selecciona del grupo que comprende tejido cutáneo, tejido muscular, tejido dérmico, tejido tendinoso, tejido de ligamento, tejido de menisco y tejido de vejiga.

En una modalidad, la lesión de tejidos blandos es una herida aguda ^ocrónica.

De acuerdo con una modalidad, las lesiones de tejidos blandos a tratar se seleccionan del grupo que comprende desgarros ^oroturas de tejido blando, heridas cutáneas, quemaduras cutáneas, úlceras cutáneas, heridas quirúrgicas, enfermedades vasculares, enfermedades musculares, hernias y heridas por radiación. En una modalidad particular, la herida de la piel es una herida de diabético.

De acuerdo con una modalidad, la composición para ^usode la invención se administra por vía tópica ^opor implantación quirúrgica.

La invención también se refiere a un método para la preparación de una composición que comprende una matriz biocompatible y una población de células madre mesenquimales de acuerdo con la reivindicación 13.

Definiciones

En la presente invención los siguientes términos tienen los siguientes significados:

- "Células madre mesenquimales" ^oMSC, son células madre multipotentes que son capaces de diferenciarse en más de un tipo específico de tejido mesenquimal ^oconectivo incluyendo linajes osteogénicos, condrogénicos, adipogénicos, de estroma mielosupresor, miogénicos ^oneurogénicos. Las células madre mesenquimales se pueden aislar de tejidos que incluyen, sin limitación, tejido adiposo, médula ósea, tejido del cordón umbilical, gelatina de Wharton, fluido amniótico, placenta, sangre periférica, trompas de Falopio, estroma corneal, pulmón, músculo, piel, hueso, tejido dental, fluido premenstrual, prepucio e hígado fetal, y similares.

- "Célula madre mesenquimal de pases tardíos" se refiere a una célula que presenta una característica menos inmunogénica en comparación con una célula de un pase anterior. La inmunogenicidad de una célula madre mesenquimal corresponde al número de pases. Preferiblemente, la célula se pasa hasta al menos el cuarto pase, con mayor preferencia, la célula se pasará hasta al menos el sexto pase, y con la máxima preferencia, la célula se pasará hasta al menos el octavo pase.

- "Normoxia" se refiere a los niveles de oxígeno fisiológico ^otisular. En una modalidad de la invención, cultivo celular en normoxia, ^oen niveles fisiológicos de oxígeno, significa un nivel de oxígeno de aproximadamente 3 % a aproximadamente 6 %, preferiblemente a un nivel de oxígeno de aproximadamente 5 %.

- "Hipoxia" se refiere a niveles de oxígeno reducidos. En una modalidad de la invención, cultivo celular en hipoxia significa un nivel de oxígeno de aproximadamente 0 % a aproximadamente 1 %, preferiblemente a un nivel de oxígeno de aproximadamente 0,1 %.

- "Normoglucemia" se refiere a niveles normales de glucosa. En una modalidad de la invención, cultivo celular en normoglucemia significa una concentración de glucosa de aproximadamente 0,5 g/l a aproximadamente 1,5 g/l, preferiblemente a una concentración de glucosa de aproximadamente 1 g/l.

- "Hiperglucemia" se refiere a niveles elevados de glucosa. En una modalidad de la invención, cultivo celular en hiperglucemia significa una concentración de glucosa de aproximadamente 2 g/l a aproximadamente 10 g/l, preferiblemente de aproximadamente 3 g/l a aproximadamente 6 g/l, con mayor preferencia a una concentración de glucosa de aproximadamente 4,5 g/l.

- "Biocompatible" se refiere a la calidad de no tener efectos tóxicos o nocivos en el cuerpo, particularmente en un tejido blando. En una modalidad, la biocompatibilidad de un material se refiere a la capacidad de dicho material para realizar ^sufunción deseada sin provocar ningún efecto local ^osistémico indeseable en el sujeto, pero generando la respuesta celular o tisular beneficiosa más apropiada.

- "Matriz biocompatible", también conocida como matriz ^oarmazón, se refiere a una armazón tridimensional formada por material biocompatible.

- "Acelular", o "descelularizado", con referencia a una matriz biocompatible, se refiere a una matriz de la que se han eliminado sustancialmente todas las células endógenas, como, por ejemplo, al menos aproximadamente el 60 % de las células endógenas (en donde los porcentajes están con relación al número de células endógenas), preferentemente aproximadamente 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 % de células endógenas o más. La descelularización de la matriz puede evaluarse por el conteo células viables, por ejemplo, mediante tinción DAPI.

- "Tejido blando" se refiere a los tejidos que conectan, soportan ^orodean otras estructuras y órganos del cuerpo, sin ser hueso. En una modalidad el tejido blando incluye, sin limitación, tendones, ligamentos, fascia, piel, tejidos fibrosos, grasa y membranas sinoviales (que son tejido conectivo), músculos, nervios y vasos sanguíneos (que no son tejido conectivo). En otra modalidad, los tejidos blandos son tejidos del cuerpo excepto huesos, dientes, uñas, cabello y cartílago.

- "Sujeto" se refiere a un mamífero, preferiblemente un ser humano. En una modalidad, un sujeto puede ser un "paciente", es decir, un animal de sangre caliente, con mayor preferencia un ser humano, quién/el cual espera para recibir, o recibe atención médica o fue/es/será el objeto de un procedimiento médico, o se monitorea para el desarrollo ^ola curación de la lesión de tejidos blandos. En una modalidad, el sujeto es un adulto (por ejemplo, un sujeto mayor de 18 años). En otra modalidad, el sujeto es un niño (por ejemplo, un sujeto menor de 18 años). En una modalidad, el sujeto es masculino. En otra modalidad el sujeto es femenino.

- "Tratar" o "tratamiento" o "alivio" se refiere a la acción terapéutica tomada y la acción que se evita tomar con el propósito de mejorar la condición del paciente, en donde el objetivo es ralentizar (disminuir) ^oinvertir el progreso, o aliviar uno o más síntomas de las lesiones de tejidos blandos como, por ejemplo, herida no cerrada, desarrollo de fibrosis, falta de vascularización e inflamación. Un sujeto o mamífero se "trata" con éxito por una lesión de tejidos blandos si, después de recibir una composición de acuerdo con la presente invención, el paciente muestra una reducción observable y/o medible de o ausencia de uno o más de los siguientes: alivio hasta cierto punto, de uno ^omás de los síntomas que se asocian con las lesiones de tejidos blandos; morbilidad reducida; mortalidad reducida ^omejoría de la calidad de vida. L^osparámetros anteriores para evaluar el tratamiento exitoso y la mejoría en la lesión se pueden medir fácilmente mediante procedimientos de rutina familiares para un médico.

- "Proceso de pase", también conocido como subcultivo ^odivisión de células, se refiere a transferir una pequeña cantidad de células a un nuevo recipiente cuando las células están en confluencia ^ocasi, para prolongar la vida y/o expandir el número de células en el cultivo. En una modalidad, el pase 0 (P0) es el punto en el que las células se colocaron inicialmente en cultivo.

- "Alrededor de" y “Aproximadamente” como se usa en la presente cuando se refieren a un valor medible tal como una cantidad de un compuesto, dosis, tiempo, temperatura y similares, se entiende que abarcan variaciones del 20 %, 10 %, 5 %, 1 %, 0,5 %, o incluso 0,1 % de la cantidad especificada.

- "Y/^o" se refiere a y abarca todas y cada una de las combinaciones posibles de uno ^omás de los elementos enumerados que se asocian, así como también la ausencia de combinaciones cuando se interpreta de forma alternativa ("o").

- "Derivado" como se usa en la presente se refiere a cualquier fracción de una sustancia, derivado, subfamilia, etc., o mezclas de los mismos, solo o en combinación con otros derivados u otros ingredientes.

- "Aislado" como se usa en la presente significa que las células se colocan en condiciones distintas de ^suentorno natural.

Descripción detallada

Las poblaciones de células madre mesenquimales (MSC) descritas anteriormente comprenden otros tipos de células además de las células madre mesenquimales, en particular pueden comprender fibroblastos ^ose diferencian en parte en fibroblastos. El solicitante en la presente descripción demuestra que las células madre mesenquimales tienen la capacidad de sobrevivir y proliferar mejor en hipoxia y/o hiperglucemia que los fibroblastos. Además, las células madre mesenquimales tienen la capacidad de secretar más VEGF que los fibroblastos, en particular las células madre mesenquimales secretan más VEGF en condiciones de hipoxia e hiperglucemia (es decir, condiciones de heridas diabéticas) que en normoxia y normoglucemia (ver Ejemplo 2).

Los solicitantes también demuestran que las células madre mesenquimales sembradas en una matriz biocompatible pueden restaurar el tejido dérmico (ver Ejemplo 3) y pueden usarse para el tratamiento de músculo que se lesiona (ver Ejemplo 4).

Además, una población de MSC sembrada en una matriz biocompatible demostró la capacidad de sobrevivir bajo hipoxia y/o hiperglucemia, de mejorar la liberación de factores proangiogénicos mediante un mecanismo sensible al oxígeno y de reducir la cicatriz fibrótica. Estas propiedades podrían favorecer la reconstrucción del tejido blando, como, por ejemplo, en condiciones diabéticas.

Por consiguiente, esta invención se refiere a una composición que comprende una matriz biocompatible y una población de células madre mesenquimales (MSC).

La composición de la invención puede usarse en ingeniería y regeneración de tejidos en animales. La composición exacta de la invención puede variar de acuerdo con el uso que se desea. Modificaciones y otras modalidades de la invención serán evidentes para un experto en la técnica a la cual pertenece esta invención teniendo el beneficio de las enseñanzas presentadas en las descripciones anteriores y los dibujos que se asocian. Se debe entender que la invención no se limita a las modalidades específicas divulgadas y esas modificaciones y otras modalidades están destinadas a incluirse dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

En una modalidad, la composición de la invención es un producto biomédico.

De acuerdo con la descripción, la población de MSC puede comprender otros tipos de células además de MSC, tales como, por ejemplo, fibroblastos, macrófagos, células endoteliales, células dendríticas, osteoblastos, células madre hematopoyéticas, células madre de sangre de cordón, linfocitos o células asesinas naturales.

Las células pueden obtenerse de un donante (vivo o cadavérico) o derivarse de una cepa celular o línea celular establecida. Por ejemplo, se pueden recolectar células de un donante mediante el ^usode técnicas de biopsia estándar conocidas en la técnica.

En una modalidad, las MSC se obtienen de un donante humano.

En una modalidad, las MSC se obtienen de un donante humano, siempre y cuando no sean células madre embrionarias.

En una modalidad de la invención, la población de MSC es una población de MSC aislada.

La población de MSC es sustancialmente pura. Como se usa en la presente, el término "población de MSC sustancialmente pura" significa que la población de MSC comprende menos del 25 % de otros tipos de células vivas, en particular de fibroblastos. En una modalidad, la población de MSC sustancialmente pura de la invención comprende al menos aproximadamente 75 %, 80, 85, 9o, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de MSC, en donde los porcentajes están con relación al número total de células vivas.

En otra modalidad, la población de MSC sustancialmente pura de la invención comprende menos de aproximadamente 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ^o1% de fibroblastos, en donde los porcentajes están con relación al número total de células vivas.

De acuerdo con una modalidad, la población de MSC sustancialmente pura de la invención secreta a lo máximo 100 pg/ml de SDF-1^ci, preferentemente a lo máximo 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 pg/ml.

De acuerdo con una modalidad, la población de MSC sustancialmente pura de la invención secreta a lo máximo 50 pg/ml de SDF-1^ci, preferentemente a lo máximo 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ^o1 pg/ml, cuando la población de MSC se cultiva al menos 24 horas a aproximadamente 21 % de O2.

De acuerdo con otra modalidad, la población de MSC sustancialmente pura de la invención secreta a lo máximo 50 pg/ml de SDF-1^q, preferentemente a lo máximo 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 pg/ml, cuando la población de MSC se cultiva al menos 24 horas en niveles fisiológicos de oxígeno, preferentemente a aproximadamente 5 % de O2.

De acuerdo con otra modalidad, la población de MSC sustancialmente pura de la invención secreta a lo máximo 50 pg/ml de SDF-1^ci, preferentemente a lo máximo 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ^o1 pg/ml, cuando la población de MSC se cultiva al menos 24 horas en hipoxia, preferentemente a aproximadamente 0,1 % de O2.

De acuerdo con otra modalidad, la población de MSC sustancialmente pura de la invención secreta a lo máximo 100 pg/ml de SDF-1^ci, preferentemente a lo máximo 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ^o1 pg/ml de SDF-1^ci, cuando la población de MSC se cultiva al menos 24 horas en normoglucemia, preferentemente a una concentración de glucosa de aproximadamente 1 g/l de glucosa.

De acuerdo con otra modalidad, la población de MSC sustancialmente pura de la invención secreta a lo máximo 50 pg/ml de SDF-1^ci, preferentemente a lo máximo 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ^o1 pg/ml de SDF-1^ci, cuando la población de MSC se cultiva al menos 24 horas en hiperglucemia, preferentemente a una concentración de glucosa de aproximadamente 4,5 g/l.

En una modalidad, la población de MSC sustancialmente pura de la invención secreta a lo máximo 100 pg/ml, preferentemente a lo máximo 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ^o1 pg/ml de SDF-1^ci, cuando la población de MSC se cultiva al menos 24 horas a aproximadamente 21 % de O2 y a baja concentración de glucosa, preferentemente a aproximadamente 1 g/l de glucosa.

En otra modalidad, la población de MSC sustancialmente pura de la invención secreta a lo máximo 50 pg/ml, preferentemente a lo máximo 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ^o1 pg/ml de SDF-1^ci, cuando la población de MSC se cultiva al menos 24 horas a aproximadamente 21 % de O2 y a una alta concentración de glucosa, preferentemente a aproximadamente 4,5 g/l de glucosa.

En otra modalidad, la población de MSC sustancialmente pura de la invención secreta a lo máximo 100 pg/ml, preferentemente a lo máximo 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ^o1 pg/ml de SDF-1ci, cuando la población de MSC se cultiva al menos 24 horas en niveles fisiológicos de oxígeno, preferentemente a alrededor de 5 % O2 y a baja concentración de glucosa, preferentemente a aproximadamente 1 g/l de glucosa.

En otra modalidad, la población de MSC sustancialmente pura de la invención secreta a lo máximo 50 pg/ml, preferentemente a lo máximo 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ^o1 pg/ml de SDF-1^ci, cuando la población de MSC se cultiva al menos 24 horas en niveles fisiológicos de oxígeno, preferentemente alrededor de 5 % de O2, y a una alta concentración de glucosa, preferentemente a aproximadamente 4,5 g/l de glucosa.

En otra modalidad, la población de MSC sustancialmente pura de la invención secreta a lo máximo 100 pg/ml, preferentemente a lo máximo 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ^o1 pg/ml de SDF-1^ci, cuando la población de MSC se cultiva al menos 24 horas en hipoxia, preferentemente a alrededor de 0,1 % de O2 y a baja concentración de glucosa, preferentemente aproximadamente de 1 g/l de glucosa.

En otra modalidad, la población de MSC sustancialmente pura de la invención secreta a lo máximo 50 pg/ml, preferentemente a lo máximo 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ^o1 pg/ml de SDF-1ci, cuando la población de MSC se cultiva al menos 24 horas en hipoxia, preferentemente a alrededor de 0,1 % de O2, y a una alta concentración de glucosa, preferentemente a aproximadamente 4,5 g/l de glucosa.

En una modalidad, la población de MSC sustancialmente pura de la invención secreta al menos 200 pg/ml de VEGF, preferentemente al menos alrededor de 250, 260, 270, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289 o 290 pg/ml de VEGF, cuando la población de MSC se cultiva al menos 24 horas en hipoxia, preferentemente a alrededor de 0,1 % de O2 e hiperglucemia, preferentemente a una concentración de glucosa de aproximadamente 4,5 g/l.

En otra modalidad, la población de MSC sustancialmente pura de la invención secreta al menos aproximadamente 90 pg/ml de VEGF, preferentemente al menos aproximadamente 95, 100, 105, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 188, 119 o 120 pg/ml de VEGF, cuando la población de MSC se cultiva al menos 24 horas en niveles fisiológicos de oxígeno, preferentemente a alrededor de 5 % de O2 e hiperglucemia, preferentemente a una concentración de glucosa de aproximadamente 4,5 g/l.

En otra modalidad, la población de MSC sustancialmente pura de la invención secreta al menos aproximadamente 160 pg/ml de VEGF, preferentemente al menos aproximadamente 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169 ^o170 pg/ml de VEGF, cuando la población de MSC se cultiva al menos 24 horas en niveles fisiológicos de oxígeno, preferentemente a alrededor de 5 % de O2 y normoglucemia, preferentemente a una concentración de glucosa de aproximadamente 1 g/l.

En una modalidad, la población de MSC sustancialmente pura de la Invención secreta a lo máximo 50 pg/ml de SDF-1a, preferentemente a lo máximo 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ^o1 pg/ml de SDF-1a; y al menos aproximadamente 200 pg/ml de VEGF, preferentemente al menos aproximadamente 250, 260, 270, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289 ^o290 pg/ml de VEGF, cuando la población de MSC se cultiva al menos 24 horas en hipoxia, preferentemente a alrededor de 0,1 % de O2 e hiperglucemia, preferentemente a una concentración de glucosa de aproximadamente 4,5 g/l.

En otra modalidad, la población de MSC sustancialmente pura de la invención secreta a lo máximo 50 pg/ml de SD F-1^q, preferentemente a lo máximo 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ^o1 pg/ml de SDF-1a; y al menos aproximadamente 90 pg/ml de VEGF, preferentemente al menos aproximadamente 95, 100, 105, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 188, 119 ^o120 pg/ml de VEGF, cuando la población de MSC se cultiva al menos 24 horas en niveles fisiológicos de oxígeno, preferentemente aproximadamente a 5 % de O2, e hiperglucemia, preferentemente a una concentración de glucosa de aproximadamente 4,5 g/l.

En otra modalidad, la población de MSC sustancialmente pura de la invención secreta a lo máximo 100 pg/ml de SD F-1^q, preferentemente a lo máximo 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ^o1 pg/ml de SDF-1a; y al menos aproximadamente 160 pg/ml de VEGF, preferentemente al menos aproximadamente de 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169 ^o170 pg/ml de V E ^gF, cuando la población de MSC se cultiva al menos 24 horas en niveles fisiológicos de oxígeno, preferentemente a alrededor de 5 % de O2, y en normoglucemia, preferentemente a una concentración de glucosa de aproximadamente 1 g/l de glucosa.

De acuerdo con una modalidad, la población de MSC se cultiva en normoxia, preferentemente aproximadamente a 21 % de O2, y en normoglucemia, preferentemente aproximadamente 1 g/l de glucosa, hasta al menos 1, 2, 3 ^o4 pases antes de medir el nivel de expresión de SDF-1a y/o VEGF. De acuerdo con una modalidad, la población de MSC se cultiva hasta la confluencia de las MSC antes de medir el nivel de expresión de SDF-1a y/o VEGF. En otra modalidad, la población de MSC se cultiva hasta al menos aproximadamente 80, 85, 90, 95, 99 ^o100 % de confluencia de MSC antes de medir el nivel de expresión de SDF-1a y/o VEGF.

Las células madre mesenquimales son indiferenciadas ^ono diferenciadas, es decir las MSC no se diferencian en un tipo celular, en particular en fibroblastos.

MSC puede aislarse de tejidos que se seleccionan del grupo que comprende tejido adiposo, médula ósea, sangre del cordón umbilical, gelatina de Wharton (como, por ejemplo, gelatina de Wharton que se encuentra dentro del cordón umbilical), fluido amniótico, placenta, sangre periférica, trompa de Falopio, estroma corneal, pulmón, músculo, piel, hueso, tejido dental e hígado fetal ^osimilares. Las MSC de la invención se aíslan de tejido adiposo. Las MSC de la invención son células madre adiposas (denominadas ASC ^oAMSC).

En una modalidad, las MSC se aíslan de cualquier tejido animal de sangre caliente, preferentemente de tejidos humanos, porcinos, bovinos ^oequinos, con mayor preferencia de tejidos humanos. En una modalidad particular, las MSC son A ^sC humanas.

En una modalidad, las células son células en cultivo, preferentemente son líneas celulares y/o se derivan de células primarias, es decir células aisladas directamente del tejido. En una modalidad, las células se recuperan de una muestra de un individuo, obtenida por ejemplo mediante biopsia. Preferentemente, la etapa de recuperar la muestra de un individuo no es parte del método de la presente invención.

El aislamiento de células madre mesenquimales se puede lograr mediante cualquier método aceptable de los que conoce un experto en la técnica. L^osejemplos de métodos para aislar MSC incluyen, pero no se limitan a, digestión por colagenasa, tripsinización ^ocultivo de explantes.

En una modalidad particular, las células madre mesenquimales se aíslan del tejido adiposo mediante digestión del tejido, por ejemplo, mediante colagenasa.

En una modalidad, las MSC de la invención pueden transfectarse de forma estable ^otransitoria ^otransducirse con un ácido nucleico de interés mediante el ^usode una estrategia de vector plásmido, viral ^oalternativa adecuada. L^osácidos nucleicos de interés incluyen, pero no se limitan a, aquellos que codifican productos génicos que mejoran la producción de componentes de la matriz extracelular que se encuentran en el tipo de tejido que se va a reparar. De acuerdo con una modalidad de la invención, después del aislamiento, la población de MSC se cultiva en cualquier medio de cultivo que se diseña para soportar el crecimiento de las células y que conoce cualquier experto en la técnica. Como se usa en la presente, dicho medio de cultivo se denomina "medio de proliferación" ^o"medio de crecimiento". Ejemplos de medio de crecimiento incluyen, sin limitación, MEM, DMEM, CMRL, IMDM, RPMI 1640, FGM ^oFGM-2, medio 199/109, HamF10/HamF12 ^oMcCoy 5A, preferentemente DMEM ^oRPMI.

En una modalidad, el medio de cultivo puede comprender además cualquier factor suplementario. L^osejemplos de factores suplementarios incluyen, pero no se limitan a, FBS; lisado de plaquetas; glicina; aminoácidos, tales como glutamina, asparagina, ácido glutámico, ácido aspártico, serina, prolina o alanina, preferentemente la configuración L de los aminoácidos; y antibióticos, como estreptomicina ^openicilina.

De acuerdo con una modalidad, la población de MSC se cultiva en condiciones de cultivo estándar. Como se usa en la presente, "condiciones de cultivo estándar" significa a una temperatura de 37 °C y en 5 % de CO2.

La población de MSC de la invención no se diferencia en un tejido específico. En consecuencia, en una modalidad, la población de MSC de la invención no se cultiva en condiciones para inducir la diferenciación, como, por ejemplo, en un medio de diferenciación. En una modalidad particular, la población de MSC de la invención no se cultiva en medio de diferenciación osteogénica, medio de diferenciación muscular o medio de diferenciación dérmico.

En una modalidad, se obtiene una población de MSC sustancialmente pura al cultivar la población de MSC hasta al menos 3 pases, preferentemente en normoxia y normoglucemia.

En una modalidad, la población de MSC puede congelarse, preferentemente al menos después del 3er pase. Como ejemplo, la población de células puede congelarse y almacenarse en nitrógeno líquido o a cualquier temperatura, preferentemente de aproximadamente -0 °C a -196 °C, siempre que las células puedan usarse como células madre después de la descongelación de la misma. En una modalidad, la población de MSC puede descongelarse y expandirse además para obtener células frescas.

En una modalidad, la matriz biocompatible se forma por material biológico biorreabsorbible. Como se usa en la presente, el término "biorreabsorbible" significa que el material biológico se puede volver a asimilar, disolver o absorber en el cuerpo y no requiere eliminación mecánica ^omanual.

En una modalidad, la matriz biocompatible de la invención está formada por un material que proporciona un soporte estructural para el crecimiento y propagación de las células. En una modalidad, la matriz biocompatible comprende un material natural o sintético, o un derivado químico del mismo, que se selecciona del grupo que comprende agar/agarosa, alginatos quitosano, condroitín sulfato, colágeno, elastina o péptidos similares a elastina (ELP), fibrinógeno, fibrina, fibronectina, gelatina, proteoglicanos de heparán sulfato, ácido hialurónico, polianhídridos, ácido poliláctico (PLA), poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), óxido de polietileno/polietilenglicol (PEO/PEG), poli (alcohol vinílico) (PVA), polímeros a base de fumarato como, por ejemplo poli (fumarato de propileno) (PPF) ^opoli (fumarato de propileno-co-etilenglicol) (P(PF-^co-EG)), oligo (poli(etilenglicol) fumarato) (OPF), poli (n-isopropilacrilamida) (PNI^pPAA^it), poli (aldehido guluronato) (PAG), polianhídridos, poli (n-vinil pirrolidona) (PNVP), geles de oligopéptidos autoensamblables y/o cualquier otro material hidrogel adecuado como portador de células para complementar el crecimiento de tejidos. En una modalidad particular, la matriz biocompatible de la invención comprende colágeno, tal como, por ejemplo, colágeno tipo I.

De acuerdo con una modalidad, la matriz biocompatible de la invención se deriva de cualquier tejido de colágeno. L^osejemplos de tejidos de colágeno incluyen, pero no se limitan a, piel, dermis, tendón, ligamento, músculo, amnios, menisco, submucosa del intestino delgado, válvula cardiaca, vaso y vejiga. En una modalidad particular, la matriz biocompatible de la invención se deriva de tendón, preferiblemente de fascia lata.

En una modalidad, la matriz biocompatible se recupera de un individuo. En una modalidad, la matriz biocompatible se recupera de un ser humano. En otra modalidad, la matriz biocompatible se recupera de un animal no humano. Dicha matriz biocompatible está disponible comercialmente. Entre los ejemplos de matrices biocompatibles disponibles comercialmente se incluyen, pero no se limitan a, Integra® (Integra LifeSciences Corporation), Matriderm® (Skin & Health Care), Alloderm® (Life Cell) y Puramatrix® (3-D Matrix Medical Technology). Preferentemente, la etapa de recuperar la matriz biocompatible de un individuo no forma parte del método de la presente invención.

En una modalidad de la invención particular, la matriz biocompatible se deriva del tendón de la fascia lata humana. En una modalidad, la matriz biocompatible de la invención tiene una inmunogenicidad baja ^onula. En una modalidad, la matriz biocompatible se procesa, por cualquier medio biológico, químico y/o físico para reducir ^suinmunogenicidad. Después de un proceso para reducir la inmunogenicidad, la matriz biocompatible de la invención es menos inmunogénica en comparación con la matriz biocompatible sin procesar del mismo tipo.

En una modalidad, para reducir la inmunogenicidad la matriz biocompatible se procesa para eliminar membranas celulares, ácidos nucleicos, lípidos y componentes citoplasmáticos. Después del proceso para reducir la inmunogenicidad, la matriz biocompatible comprende intactos los componentes típicamente asociados con la matriz, tales como, por ejemplo, colágeno, elastinas, glicosaminoglicanos y proteoglicanos.

En una modalidad, la matriz biocompatible se procesa para reducir la inmunogenicidad. En una modalidad, la matriz biocompatible de la invención es al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % menos inmunogénica que la matriz biocompatible no procesada del mismo tipo. Los parámetros para evaluar la inmunogenicidad de una matriz se pueden medir fácilmente mediante procedimientos rutinarios familiares para un médico.

L^osejemplos de procesos para reducir la inmunogenicidad Incluyen, pero no se limitan a, descelularización de la matriz biocompatible y ruptura celular de la matriz biocompatible.

En una modalidad, la matriz biocompatible de la invención se procesa con un método de ruptura celular. L^osejemplos de métodos de ruptura celular incluyen, pero no se limitan a, crioconservación, ciclos de congelación/descongelación y exposición a radiación.

En otra modalidad, la matriz biocompatible de la invención se procesa con un método de descelularización. Como se usa en la presente, "un método de descelularización" significa un método para eliminar células endógenas de la matriz biocompatible mediante el ^usode medios físicos, químicos ^obioquímicos. L^osejemplos de medios incluyen, pero no se limitan a, enzimas tales como proteasas y/o nucleasas; productos químicos tales como ácidos, bases, detergentes iónicos, detergentes no iónicos, tensioactivos y/o detergentes bipolares; agentes desengrasantes como acetona; y/o liofilización.

En una modalidad, la matriz biocompatible de la invención es acelular. En una modalidad, la matriz biocompatible comprende a lo máximo aproximadamente 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 , 1 % ^omenos de células endógenas, en comparación con una matriz biocompatible del mismo tipo que no ha sido sometida a la eliminación de células endógenas.

La descelularización se puede cuantificar de acuerdo con cualquier método de los que conoce un experto en la técnica. L^osejemplos de métodos para cuantificar la descelularización incluyen, pero no se limitan a, la tinción con 40,6-diamidino-fenilindol (DAPI), ^ola medición de la concentración de ^aD ⁿen la matriz biocompatible que se procesó, en comparación con la matriz biocompatible antes del procesamiento ^ocon una matriz biocompatible del mismo tipo que no se procesó.

En una modalidad preferida, la matriz biocompatible es una matriz de colágeno acelular, preferentemente una matriz de colágeno acelular humano (HACM).

En una modalidad, la matriz biocompatible se prepara para obtener una matriz que no comprende residuos químicos detectables, como, por ejemplo, acetona ^oH2O2 y menos de aproximadamente un 10 % de humedad residual, preferentemente menos de un 8 %. Tal preparación de la matriz biocompatible puede realizarse mediante cualquier método aceptable de los que conoce un experto en la técnica. A ^{s í}, en una modalidad de la invención, la matriz biocompatible no comprende residuos químicos, como, por ejemplo, acetona ^oH202y menos de aproximadamente un 10 % de humedad residual, preferentemente menos de un 8 %.

En otra modalidad, la matriz biocompatible se esteriliza para evitar la transmisión de enfermedades infecciosas, como, por ejemplo, el VIH, I^osvirus de la hepatitis C y B (VHC, VHB) e infecciones bacterianas. L^osejemplos de métodos de esterilización incluyen, pero no se limitan a, productos químicos, calor, radiación UV y ionizante, como irradiación gamma.

En una modalidad, la matriz biocompatible y la población de MSC de la invención son de la misma especie. En otra modalidad, la matriz biocompatible y la población de MSC de la invención son de diferentes especies. En otra modalidad, la matriz biocompatible y la población de MSC de la invención son del mismo sujeto donante, que puede ser, ^ono el sujeto receptor. En otra modalidad, la matriz biocompatible y la población de MSC de la invención son de diferentes sujetos, ya sea uno ^oninguno, puede ser el sujeto receptor.

La población de células madre mesenquimales se incuba con la matriz biocompatible. Como se usa en la presente, el término "incubado" significa que la población de células madre mesenquimales entra en contacto con la matriz biocompatible.

En una modalidad, la población de células madre mesenquimales puede sembrarse sobre la matriz biocompatible. En otra modalidad, la población de células madre mesenquimales puede sembrarse dentro de la matriz biocompatible. En otra modalidad, la población de células madre mesenquimales puede sembrarse sobre y dentro de la matriz biocompatible.

En una modalidad, las células de la composición se pueden sembrar en cualquier arreglo. Por ejemplo, las células pueden distribuirse homogéneamente por toda la matriz biocompatible ^odistribuirse en zonas, regiones ^ocapas definidas dentro de la matriz biocompatible.

La siembra de las células se puede realizar preferentemente bajo condiciones adecuadas de temperatura, pH, fuerza iónica y pureza para mantener la viabilidad celular.

En una modalidad, la población de MSC se cultiva hasta al menos el pase 2, 3, 4 ^o5 antes de incubarse con la matriz biocompatible. Como se usa en la presente, el término "cultivado hasta al menos el pase 4" significa que la población de células se separa y se transfiere a un nuevo recipiente hasta al menos 4 veces. En una modalidad particular, la población de MSC se cultiva hasta el pase 4 antes de incubarse con la matriz biocompatible.

En una modalidad, las células madre mesenquimales Incubadas con la matriz biocompatible son células madre mesenquimales de pases tardíos.

En una modalidad, la población de MSC se pasa cuando la población de MSC alcanza aproximadamente el 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 o 100 % de confluencia.

En otra modalidad, la población de MSC se cultiva durante al menos 24 horas, preferentemente durante al menos 36, 48, 60 ^o72 horas antes de incubarse con la matriz biocompatible. En otra modalidad, la población de MSC se cultiva durante al menos 1 día, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 días antes de incubarse con el matriz biocompatible.

En algunas modalidades, la matriz biocompatible se incuba con la población de MSC en placas de 12 o 24 pocilios, ^oen matraces de cultivo celular de 25 cm2, 75 cm2 ^o150 cm2

En una modalidad, la población de MSC se cuenta e inicialmente se incuba con la matriz biocompatible a una densidad de al menos 0,5^x105, 1^x105, 2^x105 ^o3^x105 células por pocilio. En otra modalidad, la población de MSC se incuba inicialmente con la matriz biocompatible a una densidad de aproximadamente 0,5^x105 a aproximadamente 5^x105 células/pocillo (por pocilio), preferentemente de aproximadamente 1^x105 a aproximadamente 4^x105 células/pocillo, con mayor preferencia de aproximadamente 2^x105 a aproximadamente 3^x105 células/pocillo. En una modalidad preferida, la población de MSC se incuba inicialmente con la matriz biocompatible a una densidad de aproximadamente 2^x105 células por pocilio.

En una modalidad, la población de MSC se cuenta e inicialmente se incuba con la matriz biocompatible a una densidad de al menos 1^x104, 2,5^x104, 5^x104 ^u8 ^x104 células por cm2 de platos ^oplacas de cultivo. En otra modalidad, la población de MSC se incuba inicialmente con la matriz biocompatible a una densidad de aproximadamente 1^x104 a aproximadamente 15^x104 células/cm2 de platos ^oplacas de cultivo, preferentemente de aproximadamente 2,5^x104 hasta aproximadamente 12,5 ^x104 células/cm2, con mayor preferencia de aproximadamente 5^x104 a aproximadamente 8^x104 células/cm2. En una modalidad preferida, la población de MSC se incuba inicialmente con la matriz biocompatible a una densidad de aproximadamente 5^x104 células por cm2 de platos ^oplacas de cultivo.

En una modalidad, la población de MSC se cuenta e inicialmente se incuba con la matriz biocompatible a una densidad de al menos 0,25^x105, 0,5^x105, 1^x105 ^o1,5^x105 células por cm2 de platos ^oplacas de cultivo. En otra modalidad, la población de MSC se incuba inicialmente con la matriz biocompatible a una densidad de aproximadamente 0,25^x105 a aproximadamente 2,5^x105 células/cm2 de platos ^oplacas de cultivo, preferentemente de aproximadamente 0,5^x105 a aproximadamente 2^x105 células/cm2, con mayor preferencia de aproximadamente 1^x105 a aproximadamente 1,5^x105 células/ m2 En una modalidad preferida, la población de MSC se incuba inicialmente con la matriz biocompatible a una densidad de aproximadamente 1^x105 células por cm2 de platos ^oplacas de cultivo.

En una modalidad, la incubación de la matriz biocompatible con la población de células madre mesenquimales de la invención se realiza en un medio de cultivo como se describió anteriormente. En algunas modalidades, la incubación se realiza a 37 °C en 5 % de CO2.

En una modalidad, la composición se cultiva una vez que la población de MSC entra en contacto con la matriz biológica. En una modalidad, la composición de la invención se cultiva hasta la confluencia de las MSC. En otra modalidad, la composición de la invención se cultiva hasta al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 ^o100 % de confluencia de MSC.

En otra modalidad, la composición de la invención se cultiva durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 días después de poner en contacto la población de MSC y la matriz biológica. En otra modalidad, la composición de la invención se cultiva durante más de 30 días. En otra modalidad, la composición de la invención se cultiva de 3 a 30 días, de 5 a 25 días, de 5 a 20 días, de 5 a 15 días o de 5 a 10 días.

En una modalidad, después del cultivo, la composición de la invención se lava para eliminar el medio de cultivo. En una modalidad particular, la composición se lava con solución salina tamponada con fosfato (PBS).

De acuerdo con una modalidad, la composición de la invención secreta a lo máximo 100 pg/ml de SDF-1^ci, preferentemente a lo máximo 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ^o1 pg/ml, cuando la composición se cultiva al menos 24 horas en hipoxia, preferentemente a aproximadamente 0,1 % de O2.

De acuerdo con otra modalidad, la composición de la invención secreta a lo máximo 100 pg/ml de SDF-1^ci, preferentemente como máximo 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ^o1 pg/ml de SDF-1ci, cuando la composición se cultiva al menos 24 horas en normoglucemia, preferentemente a una concentración de glucosa de aproximadamente 1 g/l de glucosa.

De acuerdo con otra modalidad, la composición de la invención secreta a lo máximo 50 pg/ml de SDF-1ci, preferentemente a lo máximo 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ^o1 pg/ml de SDF-1^ci, cuando la composición se cultiva al menos 24 horas en hiperglucemia, preferentemente a una concentración de glucosa de aproximadamente 4,5 g/l.

En una modalidad, la composición de la invención secreta al menos 200 pg/ml de VEGF, preferentemente al menos aproximadamente 250, 260, 270, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 299 o 290 pg/ml de VEGF, cuando la composición se cultiva al menos 24 horas en hipoxia, preferentemente a aproximadamente 0,1 % de O2 y en hiperglucemia, preferentemente a una concentración de glucosa de aproximadamente 4,5 g/l.

En otra modalidad, la composición de la invención secreta al menos aproximadamente 90 pg/ml de VEGF, preferentemente al menos aproximadamente 95, 100, 105, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 ^o120 pg/ml de VEGF, cuando la composición se cultiva al menos 24 horas en niveles fisiológicos de oxígeno, preferentemente a aproximadamente 5 % de O2 y en hiperglucemia, preferentemente a una concentración de glucosa de aproximadamente 4,5 g/l.

En otra modalidad, la composición de la invención secreta al menos aproximadamente 160 pg/ml de VEGF, preferentemente al menos aproximadamente 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169 o 170 pg/ml de VEGF, cuando la composición se cultiva al menos 24 horas en niveles fisiológicos de oxígeno, preferentemente a aproximadamente 5 % de O2 y en normoglucemia, preferentemente a una concentración de glucosa de aproximadamente 1 g/l.

En una modalidad, la composición de la invención secreta como máximo 50 pg/ml de SDF-1ci, preferentemente a lo máximo 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ^o1 pg/ml de SDF-1^ci; y al menos aproximadamente 200 pg/ml de VEGF, preferentemente al menos aproximadamente 250, 260, 270, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 299 ^o290 pg/ml de VEGF, cuando la composición se cultiva al menos 6 horas en hipoxia, preferentemente a aproximadamente 0,1 % de O2 y en hiperglucemia, preferentemente a una concentración de glucosa de aproximadamente 4,5 g/l.

En otra modalidad, la composición de la invención secreta a lo máximo 50 pg/ml de SDF-1^ci, preferentemente a lo máximo 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ^o1 pg/ml de SDF-1^ci; y al menos aproximadamente 90 pg/ml de VEGF, preferentemente al menos aproximadamente 95, 100, 105, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 ^ol2o pg/ml de VEGF, cuando la composición se cultiva al menos 6 horas en niveles fisiológicos de oxígeno, preferentemente a aproximadamente 5 % de 02y en hiperglucemia, preferentemente a una concentración de glucosa de aproximadamente 4,5 g/l.

En otra modalidad, la composición de la invención secreta a lo máximo 100 pg/ml de SDF-1ci, preferentemente a lo máximo 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ^o1 pg/ml de SDF-1^q; y al menos aproximadamente 160 pg/ml de VEGF, preferentemente al menos aproximadamente 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169 o 170 pg/ml de VEGF, cuando la composición se cultiva al menos 24 horas en niveles fisiológicos de oxígeno, preferentemente a aproximadamente 5 % de O2 y en normoglucemia, preferentemente a una concentración de glucosa de aproximadamente 1 g/l de glucosa.

De acuerdo con una modalidad, la composición de la invención se cultiva hasta la confluencia de la población de MSC antes de medir el nivel de expresión de SDF-1a y/o VEGF. En otra modalidad, la composición se cultiva hasta al menos aproximadamente 80, 85, 90, 95, 99 ^o100 % de confluencia de la población de MSC antes de medir el nivel de expresión de SDF-1a y/o VEGF.

En una modalidad, la composición de la invención es un dispositivo (como, por ejemplo, un dispositivo médico), una película, una estructura tridimensional, un vendaje, un injerto compuesto, un sustituto de tejidos blandos, una composición farmacéutica y similares.

En una modalidad, componentes adicionales, que sean de carácter hormonal, proteico, ácido nucleico, lipídico y/o carbohidrato, se pueden añadir a la composición de la invención en cualquier cantidad que permita que el componente que se añade sea un efector de adherencia positivo o negativo, crecimiento, diferenciación, proliferación, vascularización, injerto y modelaje tridimensional de la población de MSC en la composición de la invención. Ejemplos de tales componentes adecuados para usar en la composición incluyen, pero no se limitan a los de origen natural, variantes o fragmentos de inmunoestimuladores, inmunosupresores y/o adyuvantes inmunológicos tales como citocinas, linfocinas, monocinas, factores de crecimiento de células madre, linfotoxinas, factores hematopoyéticos, factores estimulantes de colonias (LCR), interferones (IFN), hormona paratiroidea, tiroxina, insulina, proinsulina, relaxina, prorrelaxina, hormona estimulante del folículo (FSH), hormona estimulante del tiroides (TSH), hormona luteinizante (LH), factor de crecimiento hepático, prostaglandina, factor de crecimiento de fibroblastos, prolactina, lactógeno placentario, proteína OB, factor de crecimiento transformante (TGF), TGF-q, TGFр, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), eritropoyetina, trombopoyetina, factor de necrosis tumoral ( TNF), T N F-^ci, TNF-p, sustancia inhibidora Mulleriana, péptido asociado a gonadotropina de ratón, inhibina, activina, factor de crecimiento endotelial vascular, integrina, interleucina (IL), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), interferón-a, interferón-p, interferón-y, factor SI, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 IL-21, IL-25, LIF, kit-ligando, FLT-3, angiostatina, trombospondina, endostatina, LT, corticosteroides, ciclosporina, metotrexato y similares y si alguno de dichos componentes es específico ^oinespecífico. L^osmétodos para producir variantes se conocen bien en la técnica y pueden incluir, por ejemplo, realizar cambios conservadores de aminoácidos ^omediante mutagénesis y ensayar la variante resultante para determinar la funcionalidad requerida. En una modalidad, pueden estar presentes componentes adicionales en la composición de la invención en cualquier cantidad para proporcionar con la adición de este componente características mejoradas de ^{uso o}manipulación, sin una alteración significativa de la estabilidad ^oforma de la composición de la invención. L^osejemplos de dichos componentes adecuados para usar en la composición incluyen, pero no se limitan a, antisépticos, antibióticos, antivirales, antioxidantes, anestésicos, plastificantes, conservantes, medio de crecimiento celular y/o crioprotectores. La presente invención se refiere a un método para la preparación de una composición de acuerdo con la reivindicación 13.

La presente descripción también se refiere a un método para la preparación de una composición que comprende una matriz biocompatible y una población de células madre mesenquimales que comprende:

a. aislar células madre mesenquimales (MSC), preferentemente células madre adiposas,

b. obtener una población de MSC sustancialmente pura, e

^с. incubar la población de MSC con una matriz biocompatible.

En la presente descripción, el método para la preparación de una composición que comprende una matriz biocompatible y una población de células madre mesenquimales comprende incubar una población de MSC sustancialmente pura con una matriz biocompatible.

En la presente descripción, el método para la preparación de una composición que comprende una matriz biocompatible y una población de células madre mesenquimales comprende:

a. aislar células madre mesenquimales (MSC),

b. obtener una población de MSC que comprenda menos del 25 % de fibroblastos, e

^c. incubar la población de MSC con una matriz biocompatible.

En la presente descripción, el método para la preparación de una composición que comprende una matriz biocompatible y una población de células madre mesenquimales comprende incubar una población de MSC que comprende menos del 25 % de fibroblastos con una matriz biocompatible.

En la presente descripción, el método para la preparación de una composición que comprende una matriz biocompatible y una población de células madre adiposas comprende:

a. aislar las células madre adiposas (ASC),

b. obtener una población de ASC sustancialmente pura, e

^c. incubar la población de ASC con una matriz biocompatible que contiene colágeno.

En otra modalidad, el método para la preparación de una composición que comprende una matriz biocompatible y una población de células madre adiposas puede comprender incubar una población de ASC sustancialmente pura con una matriz biocompatible que contiene colágeno.

En una modalidad, el método para la preparación de una composición que comprende una matriz biocompatible y una población de células madre adiposas puede comprender:

a. aislar las células madre adiposas (ASC),

b. obtener una población de ASC que comprenda menos del 25 % de fibroblastos, e

En otra modalidad, el método para la preparación de una composición que comprende una matriz biocompatible y una población de células madre adiposas, puede comprender incubar una población ASC que comprende menos del 25 % de fibroblastos con una matriz biocompatible que contiene colágeno.

Otro aspecto de la presente invención es la composición de la invención como se describió anteriormente para tratar, ^opara usar para tratar, lesiones de tejidos blandos en un sujeto que lo necesite.

En una modalidad, las lesiones de tejidos blandos pueden resultar, por ejemplo, de una enfermedad, trauma ^ofalla del tejido para desarrollarse normalmente.

En una modalidad, los tejidos blandos que pueden tratarse con la composición de la invención se seleccionan del grupo que comprende tejido cutáneo, tejido muscular, tejido dérmico, tejido tendinoso, tejido de ligamento, tejido de menisco, tejido valvular cardíaco, tejido vascular, mucosa gástrica, tejido timpánico, amnios y tejido de vejiga.

En una modalidad, la composición de la invención es para tratar, ^opara usar para tratar, una lesión cutánea. En otra modalidad, la composición de la invención es para tratar, ^opara usar para tratar, una lesión muscular.

En una modalidad, las lesiones de tejidos blandos que puede tratarse con la composición se selecciona del grupo que comprende heridas cutáneas, quemaduras cutáneas, úlceras cutáneas, enfermedades musculares (tales como, por ejemplo, enfermedades musculares inflamatorias, enfermedades musculares neurogénicas, enfermedades musculares miogénicas, distrofias musculares, miopatías congénitas ^omiastenia grave), hernias, heridas quirúrgicas (como, por ejemplo, heridas posoperatorias) ^oenfermedades vasculares (como, por ejemplo, enfermedades arteriales periféricas, aneurismas aórticos abdominales, enfermedades de la carótida, enfermedades venosas ^olesiones vasculares).

En una modalidad, la composición de la invención es para tratar, ^opara usar para tratar, una herida cutánea, una quemadura cutánea ^ouna úlcera cutánea. En una modalidad particular, la composición es para tratar, ^opara usar para tratar, una úlcera cutánea debida a drepanocitosis. En otra modalidad, la composición es para tratar, ^opara usar para tratar, una úlcera cutánea debida a vasculitis. En otra modalidad, la composición es para tratar, ^opara usar para tratar, una herida diabética, como por ejemplo una úlcera diabética. En otra modalidad, la composición es para tratar, ^opara usar para tratar, una radionecrosis. En otra modalidad, la composición de la invención es para tratar, ^opara usar para tratar, una enfermedad muscular.

En una modalidad, la lesión blanda es una herida aguda (es decir, antes de aproximadamente 2-4 días después de la lesión). En otra modalidad, la lesión blanda es una herida subaguda (es decir, entre aproximadamente 2-4 días y 6 semanas después de la lesión). En otra modalidad, la lesión blanda es una herida en una etapa tardía (es decir, aproximadamente 6 semanas después de la lesión). En otra modalidad, la lesión blanda es una herida crónica. En una modalidad, una herida crónica se define por la imposibilidad de lograr la curación completa después de 3 meses. En otra modalidad, la lesión blanda es una herida que no cicatriza.

En otra modalidad, la composición de la presente descripción proporciona un ex vivo modelo para estudiar una lesión de tejidos blandos de acuerdo con los aspectos anteriores.

En una modalidad, el sujeto está afectado por al menos una lesión de tejidos blandos como se describió en la presente descripción anteriormente. En una modalidad, el sujeto es diabético. En una modalidad, al sujeto se le diagnostica diabetes, tal como, por ejemplo, diabetes tipo I, diabetes tipo II, diabetes gestacional, diabetes autoinmunitaria latente, diabetes tipo 1,5, diabetes lipoatrófica, diabetes de inicio en la madurez del joven, diabetes neonatal (por ejemplo, diabetes neonatal permanente ^odiabetes neonatal transitoria), prediabetes, diabetes inducida por esteroides. De acuerdo con una modalidad, el sujeto al que se administra la composición padecía Diabetes Mellitus Tipo I ^oDiabetes Mellitus Tipo II.

En una modalidad, el sujeto no se trató previamente con otro tratamiento para lesiones de tejidos blandos. En otra modalidad, el sujeto recibió previamente al menos un tratamiento para lesiones de tejidos blandos. Ejemplos de otros tratamientos para tratar lesiones de tejidos blandos incluyen, pero no se limitan a, cierre de heridas con suturas, grapas ^ocinta adhesiva ^opegamento, medicamentos antiinflamatorios, drenaje de la infección, cirugía, autoinjertos de piel, terapia de ultrasonido, oxigenoterapia hiperbárica, cuidados de enfermería, aplicación tópica de factores de crecimiento y spray de células de queratinocitos.

En una modalidad, la matriz biocompatible de la invención es xenogénica para el sujeto al que se administra la composición. Un ejemplo no limitante es una matriz biocompatible porcina y un sujeto humano.

En otra modalidad, la matriz biocompatible de la invención es alogénica para el sujeto al que se administra la composición. Un ejemplo no limitante es una matriz biocompatible humana y un sujeto humano.

En una modalidad, la población de MSC de la Invención es xenogénica para el sujeto al que se administra la composición, es decir de un miembro de una especie diferente. En otra modalidad, la población de MSC de la invención es alogénica para el sujeto al que se administra la composición, es decir de un miembro no genéticamente idéntico de la misma especie. En otra modalidad, la población de MSC de la invención es singénica para el sujeto al que se administra la composición, es decir genéticamente idéntica ^oestrechamente relacionada, para minimizar el rechazo del trasplante de tejido. La población de MSC singénica incluye aquellas que son autógenas (es decir, del sujeto a tratar) e isogénicas (es decir, un sujeto genéticamente idéntico pero diferente, por ejemplo, de un gemelo idéntico).

En una modalidad, la matriz biocompatible y la población de MSC de la invención son ambas xenogénicas para el sujeto al que se administra la composición. En otra modalidad, al menos una de la matriz biocompatible y la población de MSC de la invención es alogénica para el sujeto al que se administra la composición. En otra modalidad, la matriz biocompatible y la población de MSC de la invención son ambas alogénicas para el sujeto al que se administra la composición.

En una modalidad, la composición de la presente descripción se puede administrar al sujeto de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica. L^osejemplos de métodos de administración incluyen, pero no se limitan a, implantación (tal como, por ejemplo, implantación quirúrgica), aplicación tópica, inyección y trasplante con otro tejido. En una modalidad, la composición de la invención se administra por vía tópica al sujeto. En otra modalidad, la composición de la invención se administra por implantación quirúrgica al sujeto. En otra modalidad, la composición de la presente descripción se inyecta al sujeto.

En una modalidad, la composición de la invención se administra al sujeto en el sitio de la lesión de tejidos blandos. En algunas modalidades, la composición de la invención se configura para la forma y/o tamaño del tejido a tratar. En algunas modalidades, la composición de la invención cambia de tamaño antes de administrarse al sujeto a la forma y/o tamaño del tejido a tratar.

La invención también se refiere a un método para tratar una lesión de tejidos blandos, que comprende administrar una composición como se describió anteriormente. En una modalidad, la composición se administra por vía tópica ^opor implantación quirúrgica. En una modalidad, la composición se administra en el sitio de la lesión de tejidos blandos.

En una modalidad, el método para tratar una lesión de tejidos blandos comprende administrar la composición de la invención a un sujeto que lo necesite. En una modalidad particular, el método para tratar una lesión de tejidos blandos comprende administrar la composición de la invención en un sujeto diabético.

Otro objetivo de la presente invención es un método para potenciar ^omejorar el cierre de una herida, tal como, por ejemplo, una herida cutánea que no cicatriza. La invención también se refiere a un método para promover la regeneración de tejidos blandos, como, por ejemplo, la regeneración dérmica ^ola regeneración muscular.

Otro aspecto de la invención es un método para promover ^opotenciar la angiogénesis, preferentemente en el sitio de una lesión de tejidos blandos. Otro aspecto de la invención es un método para promover ^opotenciar la síntesis de tejido de granulación, preferentemente en el sitio de una lesión de tejidos blandos. Otro aspecto más de la invención es un método para reducir la cicatriz fibrótica, preferentemente en el sitio de una lesión de tejidos blandos. La invención también se refiere a un método para reducir la necrosis de tejidos blandos, tal como, por ejemplo, la necrosis del músculo esquelético.

Otro objeto de la presente invención es un método para r la eficacia de un autoinjerto, tal como, por ejemplo, un autoinjerto de piel, que comprende administrar una composición de la invención antes de realizar el autoinjerto. En una modalidad, la mejoría de la eficacia de un autoinjerto está asociada con una reducción de ulceraciones (frecuencia y tamaño).

Otro objetivo de la descripción es un método para revisar el efecto de un compuesto sobre la composición de la invención, en donde dicho método comprende poner en contacto el compuesto con la composición de la invención y determinar el efecto del compuesto sobre las células presentes en la composición.

L^osejemplos de determinación del efecto del compuesto sobre las células presentes en la composición incluyen, pero no se limitan a, secreción de KGF para remodelación epidérmica y V E G ^fpara angiogénesis dérmica, ambos para regeneración de la piel; secreción de V E G ^f, IGF-1, HGF, FGF y ^tGF-P implicada en la activación, proliferación y diferenciación de células progenitoras, para la regeneración del músculo esquelético; y secreción de VEGF en función de la oxigenación del tejido.

Otro objetivo de la descripción es un método para revisar el efecto de un compuesto sobre la formación de la película, estructura tridimensional, vendaje, injerto compuesto ^osustituto de tejido blando de la invención, en donde dicho método comprende poner en contacto el compuesto con la composición de la invención y determinar el efecto del compuesto sobre la formación de la película, estructura tridimensional, vendaje, injerto compuesto ^osustituto de tejido blando de la invención.

L^osejemplos de determinación del efecto del compuesto sobre la formación de la película, estructura tridimensional, vendaje, injerto compuesto ^osustituto de tejido blando de la invención incluyen, pero no se limitan a, recolonización in vitro de células madre puras de una armazón 3D y propagación in vitro de células madre para la recuperación de la superficie de la armazón.

Otro objetivo de la descripción es un método para revisar el efecto terapéutico de un compuesto sobre la lesión de tejidos blandos como se describe aquí anteriormente, en donde dicho método comprende:

- poner en contacto el compuesto con una composición de la invención obtenida con MSC del sujeto a tratar ^ode un sujeto que tiene la patología ^oafección a tratar, y

- determinar el efecto terapéutico del compuesto sobre la composición de la invención para determinar si el compuesto puede usarse para tratar una lesión de tejidos blandos en un paciente que lo necesite.

Los ejemplos de la determinación del efecto terapéutico del compuesto sobre la composición de la invención incluyen, pero no se limitan a, la secreción selectiva del perfil de los factores de crecimiento en función del tejido de la herida, tal como KGF para la regeneración epidérmica de la piel; y la capacidad de las células madre puras (obtenidas de sujetos diabéticos ^ono diabéticos) para curar una herida cutánea diabética.

Otro objetivo de la descripción es una prueba ^ouna prueba de potencia para determinar si la composición de la invención es adecuada para ser usado en el tratamiento de una lesión de tejidos blandos, en donde:

- la composición de la invención se prepara como se describió anteriormente,

- se analiza la composición o película, estructura tridimensional, vendaje, injerto compuesto o sustituto de tejido blando de la invención para determinar si presenta al menos una característica del tejido blando a tratar.

L^osejemplos de determinación de al menos una característica de los tejidos blandos a tratar incluyen, pero no se limitan a, el aumento de la secreción de VEGF a partir de células madre puras en una composición 3D en hipoxia. Breve descripción de las figuras

Figura 1 es un gráfico que muestra la cuantificación de la proteína total extraída de la fascia lata en las diferentes etapas del método de descelularización.

Figura 2 es un conjunto de gráficos que muestran la cuantificación de los factores de crecimiento SDF-1 alfa (A), VEGF (B), bFGF (C) e IGF (D) extraídos de la fascia lata en las diferentes etapas del método de descelularización. Figura 3 es un gráfico que muestra la cuantificación del ADN total extraído de la fascia lata antes y después del método de descelularización.

Figura 4 es un gráfico que muestra la cuantificación de la proteína total extraída de los tejidos dérmicos en las diferentes etapas del método de descelularización.

Figura 5 es un conjunto de gráficos que muestran la cuantificación de los factores de crecimiento SDF-1 alfa (A), VEGF (B) y bFGF (C) extraídos de tejidos dérmicos en las diferentes etapas del método de descelularización.

Figura 6 es un gráfico que muestra la cuantificación del ADN total extraído de los tejidos dérmicos antes y después del método de descelularización.

Figura 7 es un gráfico que muestra la cuantificación de la proteína total extraída del hueso esponjoso en las diferentes etapas del método de descelularización.

Figura 8 es un conjunto de gráficos que muestran la cuantificación de los factores de crecimiento SDF-1 alfa (A), VEGF (B), bFGF (C) e IGF (D) extraídos del hueso esponjoso en las diferentes etapas del método de descelularización.

Figura 9 es un gráfico que muestra la cuantificación del ADN total extraído del hueso esponjoso antes y después del método de descelularización.

Figura 10 es un gráfico que muestra la cuantificación de la proteína total extraída del hueso cortical en las diferentes etapas del método de descelularización.

Figura 11 es un conjunto de gráficos que muestran la cuantificación de los factores de crecimiento SDF-1 alfa (A), VEGF (B) y bFGF (C) extraídos del hueso cortical en las diferentes etapas del método de descelularización.

Figura 12 es un gráfico que muestra la cuantificación del ADN total extraído del hueso cortical antes y después del método de descelularización.

Figura 13 es una fotografía que muestra ASC y DF en medio de proliferación (A) y en medio de diferenciación osteogénica (B).

Figura 14 es un gráfico que muestra la proliferación celular de ASC y DF de acuerdo con el número de pases.

Figura 15 es un histograma que muestra la supervivencia celular de ASC y DF en medio de proliferación sin FBS, al 0,1 ^o5%O2.

Figura 16 es un conjunto de histogramas que muestran la secreción de KGF (A), la secreción de b-FGF (B), la secreción de IGF-1 (C) y la secreción de ^hG^f(D) de 5 diluciones diferentes de ASC/DF en medio de proliferación con 4,5 g/l de glucosa, al 0,1 ^o5 % de O2.

Figura 17 es un conjunto de histogramas que muestran la secreción de VEGF (A) y la secreción de SDF-1a (B) de 5 diluciones diferentes de ASC/DF en medio de proliferación con 4,5 g/l de glucosa, al 0,1 % de O2.

Figura 18 es un conjunto de histogramas que muestran la secreción de VEGF (A) y la secreción de SDF-1a (B) de 5 diluciones diferentes de ASC/DF en medio de proliferación con 4,5 g/l de glucosa, al 5 % de O2.

Figura 19 es un histograma que muestra la secreción de SDF-1a de 5 diluciones diferentes de ASC/DF en medio de proliferación con 4,5 g/l de glucosa, al 21 % de O2.

Figura 20 es un conjunto de histogramas que muestran la secreción de VEGF (A) y la secreción de SDF-1a (B) de 5 diluciones diferentes de ASC/DF en medio de proliferación con 1 g/l de glucosa, al 0,1 % de O2.

Figura 21 es un conjunto de histogramas que muestran la secreción de VEGF (A) y la secreción de SDF-1a (B) de 5 diluciones diferentes de ASC/DF en medio de proliferación con 1 g/l de glucosa, al 5 % de O2.

Figura 22 es un histograma que muestra la secreción de SDF-1a de 5 diluciones diferentes de ASC/DF en medio de proliferación con 1 g/l de glucosa, al 21 % de O2.

Figura 23 es un conjunto de gráficos que muestran las secreciones de VEGF (A), SDF-1o (B) y KGF (C) de AMSC, fibroblastos dérmicos (FD) y queratinocitos (K^c) a 1 g/l de glucosa y al 5 % de O2 (gris claro) ^o0,1 % O2 (gris oscuro).

Figura 24 es un conjunto de gráficos que muestran las secreciones de VEGF (A), SDF-1o (B) y KGF (C) de AMSC, fibroblastos dérmicos (FD) y queratinocitos (K^c) al 5 % de O2 y a una concentración de glucosa de 1 g/l (gris claro) ^o4.5 g/l (gris oscuro).

Figura 25 es un conjunto de gráficos que muestran las secreciones de VEGF (A), SDF-1o (B) y KGF (C) de AMSC, fibroblastos dérmicos (FD) y queratinocitos (K^c) en condiciones físicas (5 % O2 y 1 g/l de glucosa, gris claro) y en condiciones de heridas diabéticas (0,1 % O2 y 4,5 g/l de glucosa, gris oscuro).

Figura 26 es un conjunto de gráficos que muestran las secreciones de VEGF de AMSC (A) y fibroblastos dérmicos (B), de donantes humanos diabéticos ^ono diabéticos, en 0,1 % de O2 y 1 g/l de glucosa (0,1 % nmglc), en 0,1 % O2 y 4,5 g/l de glucosa (0,1 % Hglc), en 5 % O2 y 1 g/l de glucosa (5 % nmglc) y en 5 % O2 y 4,5 g/l de glucosa (5 % Hglc).

Figura 27 es un conjunto de gráficos que muestran las secreciones de KGF de AMSC (A) y fibroblastos dérmicos (B), de donantes humanos diabéticos ^ono diabéticos, en 0,1 % O2 y 1 g/l de glucosa (0,1 % nmglc), en 0,1% O2 y 4.5 g/l de glucosa (0,1% Hglc), en 5 % O2 y 1 g/l de glucosa (5 % nmglc) y en 5 % O2 y 4,5 g/l de glucosa (5 % Hglc). Figura 28 es una fotografía que muestra la diferenciación del linaje mesenquimatoso de ASC: las capacidades de diferenciación condrogénica y adipogénica se demostraron mediante tinción con rojo alizarina (deposición de calcio) (A), tinción con azul alcián (deposición de glicosaminoglicano) (B) y rojo aceite (gotitas de lípidos intracelulares) (C), respectivamente (aumento ^x20).

Figura 29 es un gráfico que muestra la propagación (A) y la adhesión (B) de ASC en HACM en comparación con ASC en una placa de pocilios de plástico.

Figura 30 es una fotografía que muestra análisis histológicos y macroscópicos 1 mes y 3 meses después de la implantación del injerto compuesto (HACM ASC) y el armazón solo (HACM, control) en ratas desnudas.

Figura 31 es un gráfico que muestra la secreción de VEGF por ASC durante la normoxia (21 % O2) ^ohipoxia (0,1 % O2).

Figura 32 es un gráfico que muestra la densidad de los vasos (recuento de vasos/2,56 cm2) de la dermis de ratas desnudas 1 mes después de la implantación subcutánea de HACM ASC en comparación con HACM solo (p=0,002; se analizaron cinco regiones de interés en el portaobjetos).

Figura 33 es una fotografía que muestra la evolución clínica del paciente 1 que padece radionecrosis.

Figura 34 es una fotografía que muestra la evolución clínica del paciente 1 (A), 2 (B) y 3 (C) antes del implante (1), en el momento del implante (2) y después de 22, 4 y 2 meses (paciente 1, 2 y 3 respectivamente) (3).

Figura 35 es un gráfico que muestra las concentraciones de proteína C reactiva (PCR) y fibrinógeno en el momento de la implantación y después de 3, 13 y 28 días.

Figura 36 es una fotografía que muestra la macrohistología con tinción tricrómica de Masson del tejido del lecho de la herida el día 0 (A) y el día 56 (B) después de la implantación en el paciente 1.

Figura 37 es un gráfico que muestra un análisis histomorfométrico semicuantitativo de VEGF y factor VIII (A) y de CD3 y CD68 (B) antes (gris claro) y después (gris oscuro) de la implantación en el paciente 1.

Figura 38 es un conjunto de fotografías que muestran la evolución del cierre de la herida del autoinjerto de piel solo (A), autoinjerto de piel después del injerto compuesto HACM implantación de ASC (B) y autoinjerto de piel después del implante de ^hA ^cM solo (C) en el paciente 2; en el día 0, macroscópicamente (1) y a nivel del tejido de la dermis (2), y en la duración máxima del cierre de la herida (28 días, 65 días y 16 días respectivamente) (3).

Figura 39 es un gráfico que muestra la supervivencia de BM-MSC y ASC en hipoxia (0,1 % O2), con relación a la normoxia (21 % O2).

Figura 40 es un conjunto de gráficos que muestran la secreción de VEGF (A), FGF-beta (B), IGF-1 (C), TGF-beta (D) y HGF (E) de BM -M ^sC y ASC en normoxia (21 % O2) e hipoxia (0,1 % O2). L^osresultados se expresan como la media±SEM.

Figura 41 es un gráfico que muestra la propagación celular de BM-MSC y ASC en e1HACM (triángulos y cuadrados respectivamente) en comparación con la propagación celular en el pocilio de plástico (línea recta) (*^p<0,05).

Figura 42 es un gráfico que muestra el crecimiento celular de BM-MSC y ASC en e1HACM (triángulos y cuadrados respectivamente) en comparación con la propagación celular en el pocilio de plástico (línea recta) (*§ ^p<0,05).

Figura 43 es un conjunto de gráficos de angiogénesis (A) y grosor de fibrosis (B) de necrosis muscular tratada con HACM recelularizado con ASC ^oBM-MSC, ^ocon HACM ^soío. L^osresultados se presentan como una relación en comparación con la necrosis muscular sin tratar (simulación).

Figura 44 es un gráfico que muestra la angiogénesis del injerto explantado, HACM recelularizado con ASC ^ocon BM-MSC, ^oHACM ^soío, 30 días después de la implantación (^p<0,05).

e je m p l o s

La presente invención se ilustra además mediante los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1: Bioactividad de matrices descelularizadas

Material y métodos

Descelularización de tejidos humanos

La fascia lata humana y los tejidos dérmicos se obtuvieron de acuerdo con los estándares comunes de la Asociación Europea de Trasplante Musculoesquelético (EAMST, Viena, 1997).

La fascia lata humana se trató en acetona absoluta por hasta 24 horas, en éter durante 15 horas, luego en etanol 70° por hasta 8 horas. Entre cada etapa, el tejido se lavó intensamente en un flujo continuo de agua desmineralizada. Luego la fascia lata humana se trató con una combinación de NaOH 1 N y NaCI durante 1 hora, y con H2O215 % por hasta 8 horas. El tejido además se lavó intensamente con agua desmineralizada hasta 68 horas. El tejido dérmico humano se trató en éter durante 8 horas, luego en etanol a 70° por hasta 16 horas y se lavó con agua desmineralizada durante 7 horas. Luego el tejido dérmico humano se trató con una combinación de NaOH 1 N y NaCI durante 1 hora, a continuación, se lavó con agua desmineralizada durante 16 horas, y luego se trató con H2O215 % por hasta 15 horas. El tejido además se lavó intensamente con agua desmineralizada hasta 16 horas. El hueso esponjoso humano se obtuvo de la tibia y el hueso cortical del calcáneo.

El tratamiento de los tejidos óseos (hueso esponjoso y cortical) se inició con una centrifugación para eliminar la médula y la sangre. Después de la centrifugación, los trasplantes se cortaron y se limpiaron con agua desmineralizada. A continuación, los tejidos óseos se trataron en acetona por hasta 68 horas a lo que siguió un lavado durante 5 horas. Subsecuentemente los tejidos óseos se trataron con una combinación de NaOH 1 N y NaCI durante 1 hora, a continuación, se lavó con agua desmineralizada durante 3 horas, y luego se trató con H2O215 % por hasta 15 horas. El tejido además se lavó intensamente con agua desmineralizada hasta 72 horas.

En cada etapa del método de descelularización se tomó una muestra para la extracción de proteínas. Además, el ADN total se cuantificó en tejidos nativos, es decir, antes de la descelularización, y en tejidos descelularizados, es decir, al final del método de descelularización.

Extracción y purificación de proteínas

Las proteínas de la fascia lata humana y los tejidos dérmicos se extrajeron de acuerdo con el protocolo de Wolf y otros. (Biomaterials. 2012, 33(10):2916-2925). En resumen, se incubaron 300 mg de tejido con 5 ml detampón ureaheparina, pH 7,4 (urea 2 M, tris 50 mM, heparina 5 mg/ml, N-etilmaleimidas 10 mM, benzamidina 5 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM) bajo agitación por hasta 24 horas a una temperatura de 4 °C. Después de una centrifugación a una velocidad de 3000 g durante 30 min, se retiró el sobrenadante y se trató según el mismo protocolo de extracción. El segundo sobrenadante se purificó mediante cromatografía de exclusión y se cuantificó mediante ELISA.

Las proteínas de los tejidos óseos humanos se extrajeron de acuerdo con el protocolo de Pietrzal y otros. (Radiat Oncol. 2007, 2(1):5). En resumen, los huesos esponjosos y corticales se trituraron mecánicamente para obtener un polvo de hueso. Se incubaron 300 mg de peso húmedo de polvo de hueso con 5 ml de una solución que comprendía guanidina 4 M y benzamidina 5 mM por hasta 24 horas a una temperatura de 4 °C. A continuación, se añadieron 5 ml de tampón Tris-HCI y se incubaron durante 5 horas a 4 °C. Después de una centrifugación durante 10 min, se eliminó el sobrenadante, se purificó por cromatografía de exclusión y se cuantificó mediante ELISA.

La determinación de proteína total se llevó a cabo con el kit de ensayo BCA de acuerdo con las instrucciones del proveedor.

Para cada muestra, los niveles de factores de crecimiento se cuantificaron mediante kits de ELISA.

Resultados

Para la fascia lata humana y los tejidos dérmicos, la cuantificación de la proteína total muestra una disminución de los niveles de proteína con respecto al método de descelularización (Figuras 1 y 4). Para los tejidos óseos, tanto esponjosos como corticales, la proteína total disminuye en cada etapa del tratamiento, antes de un aumento en la última etapa (Figuras 7 y 10). Esto podría deberse a la irradiación gamma que promovería interacciones de hidrógeno y/o formación de enlaces disulfuro entre fragmentos de proteínas degradadas.

L^osresultados de la cuantificación de citocinas también indican una fuerte disminución de los niveles de factores de crecimiento durante el tratamiento (Figuras 2, 5, 8 y 11). En particular, los niveles de VEGF e IGF disminuyeron fuertemente en cada etapa del método de descelularización (Figuras 2B y D, 5B, 8B y D, y 11B). N^ose encontraron PDGFBB ni BMP2 en los tejidos.

Para todos los tejidos que se analizaron, la cuantificación del ADN también muestra una disminución severa del ADN presente en la matriz descelularizada en comparación con el ADN en los tejidos nativos (Figuras 3, 6, 9 y 12). L^osresultados indican una eliminación del 82 % de la cantidad de ADN para la fascia lata, el 35 % para el tejido dérmico, el 69 % para el hueso esponjoso y el 65 % para el hueso cortical.

En conjunto, estos resultados muestran una fuerte degradación de las proteínas, en particular la degradación de las citocinas y la eliminación del ADN. Por tanto, las matrices descelularizadas obtenidas mediante el método de la invención son material inerte y podrían administrarse a pacientes sin temor al rechazo ^oaparición de una nueva patología.

Ejemplo 2: Secreción de factores de crecimiento ASC

Materiales y métodos

Este estudio se realizó de acuerdo con las directrices del Ministerio de Salud Belga. Todos los procedimientos se aprobaron por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina (Université Catholique de Louvain) para la obtención de tejidos y el estudio clínico (B40320108280). Todos los materiales se obtuvieron de Lonza (Verviers, Suiza), Sigma-Aldrich (S^íL^ouís, MO, EE. UU.) ^oInvitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU.) a menos que se indique de cualquier otra manera.

Aislamiento y cultivo de ASC y DF

Una recolección combinada de tejido adiposo humano (media: 7,4 g) y dérmico (media: 1,5 cm2) se realizó en 8 pacientes (tabla 1 ) que se sometieron a cirugía plástica electiva tras consentimiento informado y revisión serológica, por lipoaspiración mediante el ^usode técnica de Coleman y biopsia de piel, respectivamente. Las muestras de piel y tejido adiposo se mantuvieron en condiciones estériles durante un máximo de 60 minutos a 4 °C antes del aislamiento de células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) y fibroblastos dérmicos (DF).

Tabla 1: Características de Ios donantes de ASC/DF acoplados

Donante 1 2 3 4 5 6 7 8 Edad 19 44 40 62 56 46 45 41 (años)

Sexo f f f f f f f f Indica- Mamo- Abdomi- Mamoplas- Lat. Abdomino- Mamo- Mamo- Mamoción plastia noplastia tia Colgajo plastia plastia plastia plastia clínica dorsal

El tejido adiposo se digirió con colagenasa (1/2 p/v) en un baño de agua a 37 °C durante 60 minutos. La colagenasa se inactivó en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que se suplementó con suero bovino fetal al 10 %. El tejido que se recogió se centrifugó durante 10 minutos a 1500 rpm a temperatura ambiente. El precipitado se suspendió en un medio de proliferación compuesto por DMEM que se suplementó con suero bovino fetal al 10 %, L-glutamina (2 mM) y antibióticos (100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina y 1 pl/ml de anfotericina B) y se filtró a través de un tamiz de malla de 500 pm. La suspensión recolectada se sembró luego en frascos de cultivo de 25 cm2 con medio de proliferación.

Los DF se aislaron por extracción de biopsias dérmicas desepidermiadas, se trituraron en fragmentos de 2 mm ^x2 mm y se colocaron en pocilio de plástico. Se añadió un pequeño volumen del medio de proliferación para evitar el desprendimiento de la superficie plástica.

Después de 24 horas de incubación a 37 °C y 5 % CO2, los medios de proliferación se reemplazaron. Este pase inicial de las células primarias se denomina pase 0. Las piezas dérmicas se eliminaron de la placa de cultivo cuando las células adherentes eran visibles en la superficie de plástico que rodeaba los fragmentos de tejido. Las células se mantuvieron en medio de proliferación (que se cambió 2 veces/semana) hasta el pase 4, después de tripsinizaciones secuenciales. Se cultivaron células de 3 donantes hasta el pase 15 para estudiar el perfil de proliferación en condiciones de cultivo estándar (37 °C, 21 %02, 5 % CO2, 4,5 g/l de glucosa).

Caracterización del perfil de marcador de membrana

En el pase 4, ASC y DF se caracterizaron para marcadores de superficie celular estándar (CD44, CD45, CD73, CD90, CD105, stro-1, CD106, CD146, CD166, CD19, CD31, CDIIb, CD79^q, CD13, HLA-DR, CD14, CD34) [Dominici y otros, Cytotherapy. 2006; 8(4):315-317; Bourin y otros, Cytotherapy. 2013; 15:641-648] mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACScan; B^dBiosciences, San J^osé, CA).

Brevemente, las ASC se tiñeron con cantidades saturantes de anticuerpos monoclonales: anti-Stro-1, anti-CD90, anti-CD106, anti-CD105, anti-CD146, anti-CD166, anti-CD44, anti-CD19, anti-CD45 (panel de anticuerpos marcadores de células madre mesenquimales humanas, R&D System, Mineápolis, MN, EE. UU.), anti-CD44 (PE, anti CD44 humano en ratón, BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.), anti-CD73 (FITC, anti-CD73 humano en ratón, BD Bioscience), anti-CD31 (FITC, anti-humano en ratón, Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-CDllb (FITC, anti-humano en ratón, Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-CD79a (PE, anti-humano en ratón, Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-CD13 (FITC, anti-humano en ratón, Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-HLA-DR (FITC, anti-humano en ratón, Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-CD14 (FITC, anti-humano en ratón, Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-CD34 (PE, anti-humano en ratón, Abcam, Cambridge, Reino Unido). Se analizaron al menos 10 000 eventos controlados mediante citometría de flujo con el software CellquestPro. Los resultados se expresan en intensidad de fluorescencia media (MFI) y se expresan como porcentaje de células positivas (umbral: 95 % del isotipo).

Capacidad de diferenciación

Se analizaron ASC y DF en el pase 4 en medios específicos para evaluar la capacidad de diferenciación hacia el linaje osteogénico. La diferenciación se evaluó mediante tinción con rojo de alizarina después de cultivar la célula durante 3 semanas en medio de diferenciación específico (medio de proliferación que se suplementó con dexametasona (1 |^jM), ascorbato de sodio (50 jg/ml) y dihidrofosfato de sodio (36 mg/ml) [Qu y otros, ln Vitro Cell Dev Biol Anim. 2007; 43:95-100]. La diferenciación osteogénica se confirmó mediante tinción para fosfato cálcico con rojo de alizarina después de la fijación con formalina. Además, se realizó inmunohistoquímica para la osteocalcina para confirmar el fenotipo óseo.

Impacto de la tensión de oxígeno y el suero fetal bovino (FBS) en la proliferación celular: Ensayo EdU

La capacidad de proliferación celular se analizó mediante la medición directa de la síntesis de ADN mediante la incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina mediante el uso del kit de ensayo de citometría de flujo Click-iT® EdU Alexa Fluor® 488 (Life Technology, Waltham, MA, EE. UU.). Se sembraron ASC (n=3) y DF (n=3) en placas de cultivo de 21,5 cm2 a una densidad de 5000 células/cm2 y se cultivaron durante 24 horas en FBS al lo %, 21 % O2. La proliferación celular se detuvo al reemplazar el medio de proliferación por el mismo, sin FBS, durante 24 horas. Las células finalmente se colocaron durante 48 horas en las condiciones específicas: 0,1 % O2, 5 % O2 y 21 % O2 en medio de proliferación que se suplementó con FBS al 1 % o FBS al 5 % y se añadió EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina, un análogo de nucleósido de timidina y que se incorporó al ADN durante la síntesis activa de ADN). Después de la revelación con Alexa Fluor® 488, las células positivas se contaron mediante citometría de flujo (FACScan; BD Biosciences, San Jóse, CA).

Perfil de secreción del factor de crecimiento

Después de la tripsinización, se contaron las células (después del pase 3) y se obtuvieron 5 diluciones progresivas: 100 % ASC 0 % DF; 75 % ASC 25 % DF; 50 % ASC 50 % DF; 25 % ASC 75 % DF; y 0 % ASC 100 % DF, y se sembraron en placas de cultivo de 12 pocilios con células a una densidad que conduzca a aproximadamente 80 % a 95 % de confluencia por triplicado para la incubación en cámaras hipóxicas (Modular Incubator Chamber MIC-IOI; Billups-Rothenberg, Del Mar, CA, EE. UU.) a 0,1 % de O2 y 5 % O2, correspondientes al ambiente altamente hipóxico y la tensión tisular de oxígeno, respectivamente. Las células se expusieron (para cada dilución y tensión de oxígeno) a medios de proliferación normoglucémicos (1 g/L) o hiperglucémicos (4,5 g/L). Después de la incubación durante 24 horas en estas condiciones controladas; los sobrenadantes de cultivos celulares se recolectaron individualmente y se almacenaron a -20 °C para la cuantificación además del factor de crecimiento mediante un ensayó inmunoabsorbente ligado a enzimas (V^eGF, HGF, IGF-1, SDF-1^oy FGF básico mediante el kit de ELISA Quantikine; R&D System, Mineápolis, MN, EE. UU.). La viabilidad celular se evaluó inmediatamente después del estrés hipóxico mediante una solución de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5- (3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS; Promega, Leiden, Holanda) ensayó. Las pruebas de estrés hipóxico/glucémico y las cuantificaciones del factor de crecimiento se realizaron por triplicado y duplicado, respectivamente. L^osresultados se expresan en picogramos por milímetro.

Análisis estadístico

Se usaron la prueba de Kolmogorov de una muestra y los gráficos QQ para evaluar la distribución normal de valores. Las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos (con distribución normal) se analizaron mediante la prueba t pareada y el análisis de varianza unidireccional con la prueba post hoc de Bonferroni. Las pruebas estadísticas se realizaron con PASW 18 (SPSS; IBM, Nueva York, NY, EE. u U.); p<0,05 se consideró significativo. Resultados

Los perfiles de marcadores de superficie no permiten la distinción entre las dos poblaciones de células (Tabla 2).

Tabla 2: Caracterización de marcadores de superficie de ASC y DF humanos

% de células % de células positivas ASC positivas DF Marcadores de células mesenquimales (estromales)

CD13 99,06 99,86

CD44 95,53 99,97

CD73 93,78 99,86

CD90 98,63 100,00

CD105 96,86 99,78

CD166 60,74 96,51

Marcadores de MSC derivados de la médula ósea

CD106 5,41 2,83

Stro-1 4,03 5,73

CD146 7,16 33,91

Marcadores de células endoteliales

CD31 5,59 5,41

Marcadores de linaje hematopoyétlco

CD14 6,75 28,27

CD45 5,15 0,62

CDIIb 5,80 8,65

CD34 5,53 0,54

Antígenos leucocItarlos humanos

h la -dr 6,52 1,65

CD19 4,51 2,05

CD79^ci5,10 0,37

ASC y DF fueron positivos (>90 % de células positivas) para marcadores de células mesenquimales (CD13, CD44, CD73, CD90, CD105, CD166), negativos para endoteliales (CD31), células estromales derivadas de la médula ósea (CD106, Stro- 1, CD146) y marcadores hematopoyéticos (CD14, CD45, CDIIb, CD34), y para HLA-DR, CD79a y CD19. Después del cultivo en medios de diferenciación específicos (Figura 13), se demostró la capacidad de diferenciación osteogénica para ambos ASC y DF mediante tinción con rojo de alizarina e inmunohistoquímica de osteocalcina.

ASC y DF tuvieron un perfil de proliferación similar hasta el pase 15 (Figura 14, NS).

La viabilidad de ASC y DF no se vio afectada significativamente después de 24 horas de cultivo al 0,1 % O2 y 5 % O2 sin FBS (Figura 15). Al 5 % O2, la viabilidad de DF se redujo en comparación con ASC (87,04 % de supervivencia de ASC, ^p<0,05).

El estudio de la secreción de HGF, IGF-1, bFGF y KGF (al 0,1 % y al 5 % de O2, 4,5 g/l de glucosa) de las diluciones secuenciales de ASC y DF no demostró ninguna curva significativa (Figura 16).

Sin embargo, para VEGF y SD F-1^ci, se observaron regresiones lineales después de la "contaminación" de ASC por DF. De hecho, el nivel de secreción de SDF-1a disminuye al aumentar la proporción de ASC. Este resultado se encuentra en diferentes condiciones de tensión de oxígeno (21 %, 5 % ^o0,1 %) ^ode concentraciones de glucosa (1 g/l ^o4,5 g/l) (Figuras 17 a 22). Además, en condiciones de cultivo con niveles de glucosa alta y al 0,1 % de O2 y 5 % O2 el nivel de secreción de VEGF aumenta al aumentar la proporción de ASC (Figuras 17A y 18A). Las mismas mediciones en condiciones de glucosa baja demostraron regresiones lineales significativas para la secreción de VEGF al 5 % de O2 (Figura 20A).

Las relaciones se invirtieron ya que el DF liberó niveles más altos de SDF-1a y el VEGF se produjo en tasas más altas por ASC, lo que permitió la medición de la proporción de células (pureza de ASC).

Ejemplo 3: Comportamiento de ASC en hipoxia e hiperglucemia

Materiales y métodos

Este estudio se realizó de acuerdo con las directrices del Ministerio de Salud Belga. Todos los procedimientos se aprobaron por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina (Université Catholique de Louvain).

Aislamiento y cultivo de ASC, DF y queratinocitos

L^osDF se aislaron por extracción de biopsias dérmicas desepidermiadas, se trituraron en fragmentos de 2 mm ^x2 mm y se colocaron en pocilio de plástico. Se añadió un pequeño volumen del medio de proliferación para evitar el desprendimiento de la superficie plástica.

L^osqueratinocitos se adquirieron de ATCC (PC S-200-011) y se cultivaron con un Kit de Crecimiento de Queratinocitos (ATCC, PCS-200-040 ™), de acuerdo con las instrucciones del proveedor.

Después de 24 horas de incubación a 37 °C y 5 % CO2, los medios de proliferación se reemplazaron. Este pase inicial de las células primarias se denomina pase 0. Las piezas dérmicas se eliminaron de la placa de cultivo cuando las células adherentes eran visibles en la superficie de plástico que rodeaba los fragmentos de tejido. Las células se mantuvieron en medio de proliferación (que se cambió 2 veces/semana) hasta el pase 4, después de tripsinizaciones secuenciales.

Perfil de secreción del factor de crecimiento

Después de la tripsinización, las células (después del pase 4) se sembraron en placas de cultivo de 12 pocilios con células a una densidad que conduzca a aproximadamente 80 % a 95 % de confluencia por triplicado para la incubación en cámaras hipóxicas (Modular Incubator Chamber MIC-101; Billups-Rothenberg, Del Mar, CA, EE. UU.) a 0,1% de O2 y 5 % O2, correspondientes al ambiente altamente hipóxico y la tensión tisular de oxígeno, respectivamente. Las células se expusieron (para cada dilución y tensión de oxígeno) a medios de proliferación normoglucémicos (1 g/L) ^ohiperglucémicos (4,5 g/L). Después de la incubación durante 24 horas en estas condiciones controladas; los sobrenadantes del cultivo celular se recolectaron individualmente y se almacenaron a -20 °C para la cuantificación además del factor de crecimiento mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (VEGF, SDF-1^oy KGF mediante el kit de ELISA Quantikine; R&D System, Mineápolis, MN, EE. UU.). Las pruebas de estrés hipóxico/glucémico y las cuantificaciones del factor de crecimiento se realizaron por triplicado y duplicado, respectivamente. L^osresultados se expresan en picogramos por milímetro.

Análisis estadístico

Se usaron la prueba de Kolmogorov de una muestra y los gráficos QQ para evaluar la distribución normal de valores. Las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos (con distribución normal) se analizaron mediante la prueba t pareada y el análisis de varianza unidireccional con la prueba post hoc de Bonferroni. Las pruebas estadísticas se realizaron con PASW 18 (SPSS; IBM, Nueva York, NY, EE. ^uU.); ^p<0,05 se consideró significativo. Resultados

Cuando las células están expuestas a condiciones hipóxicas, es decir, al 0,1 % de O2, secretan niveles más altos de VEGF que en tensiones fisiológicas de O2, es decir, al 5 % O2 (Figura 23A). Solo los queratinocitos muestran un aumento significativo de la expresión de SDF-1a y KGF en la hipoxia en comparación con la normaxia, sin embargo, los niveles permanecen muy bajos (Figuras 23B y C).

Las ASC cultivadas en hiperglucemia, es decir, a 4,5 g/ i de glucosa, muestran una ligera disminución de la secreción de VEGF en comparación con la normoglucemia (1 g/l), mientras que la secreción de fibroblastos por VEGF desciende en más del 70 % (Figura 24A). L^osniveles de expresión de SDF-1a disminuyen tanto en ASC como en fibroblastos, y la secreción de KGF es sustancialmente similar para todos los tipos de células (Figuras 24B yC).

En hipoxia e hiperglucemia, que corresponde a condiciones de heridas diabéticas, ASC secreta significativamente más VEGF que en normoxia y normoglucemia (283,94 pg/ml al 0,1 % O2 y 4,5 g/l de glucosa, en comparación con 171,13 pg/ml al 5 % de O2 y 1 g/l de glucosa; Figura 25^a). L^osfibroblastos, en comparación, secretan niveles más bajos de VEGF en hipoxia e hiperglucemia que en normoxia y normoglucemia.

Estos resultados muestran que las ASC secretan más factor de crecimiento VEGF que los fibroblastos en hipoxia, en hiperglucemia y en hipoxia e hiperglucemia. Además, las condiciones de las heridas diabéticas conducen a una mayor secreción de ^vE ^gF por ASC en comparación con las condiciones fisiológicas. Por lo tanto, ASC puede liberar VEGF para promover la neoangiogénesis en un entorno diabético y, en consecuencia, puede promover la reparación de heridas diabéticas.

Además, el perfil de secreción de VEGF por ASC de donantes humanos no diabéticos o de donantes humanos diabéticos es similar (Figura 26A). En particular, la secreción de VEGF de ASC de donantes humanos diabéticos es tan alta ^omás alta que la secreción de VEGF de ASC de donantes humanos no diabéticos. En comparación, los fibroblastos de donantes humanos diabéticos secretan menos VEGF que los fibroblastos de donantes humanos no diabéticos (Figura 26B).

En comparación con la secreción de VEGF, la secreción de KGF de ASC de donantes humanos no diabéticos es diferente a la de ASC de donantes humanos diabéticos (Figura 27A). Además, se encuentran perfiles de secreción de KGF similares para ASC y para fibroblastos, ya sea de donantes humanos no diabéticos o de donantes humanos diabéticos (Figura 27).

Juntos, estos resultados muestran que las MSC de un sujeto diabético también pueden liberar VEGF para promover la neoangiogénesis y, en consecuencia, pueden promover la reparación de una herida, como una herida diabética. Por tanto, la población de MSC de la invención puede derivar de un tejido del sujeto a tratar.

Ejemplo 4: Regeneración dérmica

Materiales y métodos

Todos los procedimientos se aprobaron por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina (Université Catholique de Louvain) para la obtención de tejidos y el estudio clínico (B40320108280) y por el Comité de Ética local para el Cuidado Animal para estudios preclínicos y humanos.

ASC Humano

Aislamiento y caracterización

Las ASC humanas se recolectaron por lipoaspiración mediante el ^usode la técnica de Coleman (Coleman, Clin Plast Surg. 2001; 28:111-119) en ocho pacientes durante cirugía plástica electiva (dermolipectomía abdominal (n=3) o mamoplastia (n=5), media de 6,2 g (1,4-14,6 g)) de tejido adiposo y tras consentimiento informado y revisión serológica.

El tejido adiposo se digirió con colagenasa GMP (0,075 g; Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemania) en un baño de agua a 37 °C durante 60 minutos. Después de la digestión del tejido, las células se recolectaron después de la centrifugación y se mantuvieron en medio de proliferación hasta el pase 4 (^omás para el estudio genético) después de tripsinizaciones secuenciales, para obtener una población de As C pura (>90 % de ASC después de 4 pases). Las células se caracterizaron por perfiles de marcadores de membrana (CD44, CD45, CD73, CD90, CD105, CD34, CD14, CD11b, CD79ci, CD19, HLA-DR) (Dominici y otros, Cytotherapy 2006;8(4):315-317) por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACScan; BD Biosciences, San Jóse, CA) y se analizó en medios específicos para evaluar la capacidad de diferenciación mesenquimatosa (adipogénesis, condrogénesis, osteogénesis) (Schubert y otros, Biomaterials. 2011; 32:8880-8891; Cuí y otros, Biomaterials. 2009; 30:2683-2693). También se sembraron ASC en placas de cultivo de 12 pocilios para la incubación en cámaras hipóxicas (Modular Incubator Chamber MIC-101; Billups-Rothenberg, Del Mar, CA, EE. UU.) durante 72 horas a niveles de 0,1 % (entorno altamente hipóxico como se ve en tejidos necróticos) ^o21 % O2 (normoxia atmosférica, condiciones nórmales de cultivo) respectivamente. Después de la incubación, los sobrenadantes del cultivo celular se recolectaron individualmente y se almacenaron a -20 °C para la cuantificación de VEGF (kit de ELISA Quantikine VEGF; R&D System, Mineápolis, MN, EE. UU.).

La viabilidad celular se evaluó mediante una solución de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5- (3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS; Promega, Leiden, Países Bajos) (Vériter y otros, Biomaterials 2011; 32:5945-5956). E^{x vivo} estabilidad genética de ASC

La estabilidad citogenética se estudió mediante análisis de cariotipo e hibridación in situ fluorescente (FISH) después de diferentes pases para evaluar la seguridad oncogénica del componente celular del vendaje biológico. L^oscromosomas en metafase se obtuvieron de ASC de cinco donantes de acuerdó con protocolos estándar. Brevemente, las células cultivadas en la fase de crecimiento exponencial después de los pases 1, 4, 10, 12 y 16 se procesaron durante 4 horas con 0,02 pg/ml de Colcemid (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células recolectadas de los matraces después de la tripsinización se incubaron durante 30 minutos a 37 °C en KCl hipotónico 0,055 M y se fijaron en metanol: ácido acético glacial 3:1. La recolección de cromosomas y la preparación de portaobjetos en metafase se realizaron de acuerdó con los procedimientos estándar (Duhoux y otros, PL^oS ONE 2011;6: e26311).

Se analizaron de once a 20 metafases de bandas G de tripsina inversa-Wright (GTW) y se informaron I^oscariotipos de acuerdo con el Sistema Internacional de Nomenclatura Citogenética Humana de 2013 (ISCN 2013). El análisis FISH se realizó de acuerdo con protocolos estándares (Vériter y otros, Biomaterials. 2011; 32:5945-5956) para detectar aneuploidías de I^oscromosomas 5, 7, 8 y 18 mediante el ^usode sondas TelVysion 5q (SpectrumOrange), CEP7/D7Z1 (SpectrumGreen ^oSpectrumOrange), CEP8/D8Z2 (SpectrumOrange ^oSpectrumGreen) y CEP18/D18Z1 (SpectrumGreen) (Abbot Molecular, Ottignies/Louvain-Ia-Neuve, Bélgica). Se contaron doscientos núcleos para el pase 1, el pase 4 y el pase 16, se contaron 120 núcleos para el pase 10 y se contaron 73 núcleos para el pase 12 (I^osumbrales se calcularon con el empleo de la ley Beta con un intervalo de confianza del 99,9 %). Desarrollo del apósito biológico

En el pase 4, se comparó la capacidad de ASC para adherirse y propagarse en la matriz de colágeno acelular humano (Dufrane y otros, Biomaterials 2008;29:2237-2248) (HACM: fascia lata humana alogénica descelularizada liofilizada, del Banco de Tejidos, Hospital Universitario Saint L^uc, Bruselas, Bélgica) y en pocilios de plástico como control. La adhesión celular se evaluó mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM), como ya se describió (Bacallao y Stelzer, Methods Cell B ^íoI. 1989; 31:437-452).

Brevemente, se sembraron ASC humanos en la fascia lata procesada en 24 pocilios a una densidad de 2 ^x105 células/pocillo. Cada 2 días hasta el día 15 y cada 3 días hasta el día 30 después de la siembra, I^osHACM se lavaron en solución salina tamponada con fosfato para eliminar el medio, y luego se sumergieron en calceína acetilmetil ésteres 2 pM (AM; Molecular Probes Europe BV, Leiden, Holanda) durante aproximadamente 3 horas para examinarse por CLSM. El área celular total cubierta, el perímetro celular y el factor de forma [(área/perímetro2) * 4n] se determinaron mediante el ^usodel software de adquisición y análisis Scion Image Beta 4,02n (Scion Corporation, Torrance, CA).

Para evaluar la seguridad y la eficacia oncológica del vendaje biológico in vivo, se implantaron por vía subcutánea piezas (10 mm * 10 mm) del apósito biológico y de la armazón sola en ratas desnudas (n=10; Charles River Laboratories International, Wilmington, MA, EE. UU.).

Bajo anestesia general (isoflurano 3 %), se elevó un colgajo triangular en cada zona paravertebral para crear dos bolsas subcutáneas, lo que permitió la colocación de I^osinjertos (HACM ASC en el lado derecho y HACM ^soI^oen el lado izquierdo). Se aplicó una lesión térmica (necrosis dérmica) en el lado interno de cada colgajo para reproducir el ambiente hipóxico de la herida. El vendaje biológico (HACM ASC) se implantó con las células en contacto con la dermis quemada del lado derecho, mientras que el HACM ^soI^ose implantó en el área paravertebral izquierda. L^oscolgajos se cerraron con suturas no absorbibles después de la colocación de cinco a ocho cristales de ftalocianina de litio (cristales de LiPC) para permitir además una medición del curso de la oxigenación intratisular posterior a la implantación.

La oximetría de resonancia paramagnética electrónica (espectrómetro EPR; Magnettech, Berlín, Alemania) fue usada para seguir el curso de la PO2 intra-tisular y evaluar la capacidad del injerto compuesto para mejorar la oxigenación del tejido en ratas desnudas. El PO2 en la dermis lesionada se estudió semanalmente durante hasta 4 semanas después de la implantación bajo anestesia gaseosa (isoflurano). L^osresultados se expresaron como porcentaje de oxigenación tisular el día 6 después de la implantación.

Después de 1 mes (n=5) ^o3 meses (n=5) de la implantación, se realizó la escisión completa del injerto más I^ostejidos que lo rodean para análisis macroscópico e histológico (tinción hematoxilina-eosina y tricrómica de Masson para el desarrollo de tumores locales y angiogénesis).

Aplicación clínica para la reconstrucción dérmica

El vendaje biológico se propuso para tres pacientes con heridas que no cicatrizaban (Tabla 3). Se recolectó tejido graso peri-umbilical (22 g, 8 g y 21 g, respectivamente) (mediante el ^usode la técnica de Coleman bajo anestesia local) para el aislamiento y cultivo en línea de ASC de acuerdo con las recomendaciones de Buenas Prácticas de Fabricación.

Tabla 3: Características de I^ospacientes

En el pase 3, las ASC se trlpslnlzaron, se resuspendieron en DMEM y se cargaron en HACM liofilizado (correspondiente al pase 4). El vendaje biológico se obtuvo cuando ASC cubrió más del 90 % de1HACM. Finalmente, el injerto compuesto se enjuagó con CMRL (Mediatec, Manassas, VA, EE. UU.) y se trasladó al quirófano para ^suimplantación (ASC que se cargó en la parte superior del HACM).

En estos tres pacientes, el desbridamiento de la herida se realizó mediante hidrocirugía antes de la implantación para asegurar un lecho de la herida mínimamente contaminado. El injerto compuesto se cortó a un tamaño ideal y se orientó con la capa de células directamente en contacto con la superficie de la herida y se fijó con suturas no absorbibles. Se siguieron los parámetros inflamatorios (Proteína C reactiva, fibrinógeno), así como la evolución clínica e histológica. Se aplicaron y cambiaron vendajes vaselinados diariamente. Se realizaron biopsias antes y después del implante para inmunohistoquímica e histomorfometría para estudiar la reacción inflamatoria, la angiogénesis y la remodelación tisular (CD3/CD68, VEGF/factor VIII y tricrómica de Masson, respectivamente). Análisis estadístico

Se usaron la prueba de Kolmogorov-Smirnov de una muestra y los gráficos QQ para evaluar la distribución normal de valores. Las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos (con distribución normal) se analizaron mediante la prueba t pareada y el análisis de varianza unidireccional con la prueba post hoc de Bonferroni. Las pruebas estadísticas se realizaron con Systat versión 8,0 (Cranes Software International, Bangalore, India) ^oPASW 18 (SPSS; IBM, Nueva York, NY, EE. UU.); ^p<0,05 se consideró significativo.

Resultados

Seguridad ex vivo e in vivo de ASC HACM

Las ASC en el paso 4 se caracterizaron por un perfil de marcador de superficie de células estromales mesenquimales: CD44+ (>95 % de las células), CD73+ (>90 %), CD90+ (>95 %), CD105+ (>95 %), CD45-(<5 %), CD34-(<7 %), CD14-(<7 %), CDIIb-(<7 %), CD 79^q- (<7 %),, CD19-(<5 %) y HLA-DR-(<7 %) (Tabla 4), y marcas positivas de mineralización, deposición hialina y vacuolas lipídicas.

Tabla 4: Fenotipo de marcador de membrana que se caracterizó por citometría de flujo de ASC no diferenciado

Las ASC también se caracterizaron en medios específicos para evaluar la capacidad de diferenciación mesenquimal (adipogénesis, condrogénesis, osteogénesis) (Figura 28).

Un día después de la siembra, la mayoría de las ASC aparecieron circulares (media del factor de forma: 0,93 ± 0,13) en ambos soportes celulares, con una cobertura superficial media de 4,8 % (no significativa).

Entre los días 3 y 18 después de la siembra, se encontró un área de expansión celular significativamente mayor para los pocilios de plástico en comparación con HACM (^p< 0,005). La cobertura total de la superficie se encontró en HACM 1 semana más tarde que en los pocilios de plástico. Se encontró un retraso similar para la propagación de ASC (factor de forma) en H AC ^men comparación con el pocilio de plástico (p< 0,005) (Figura 29). La cobertura se retrasó, pero se alcanzó el mismo crecimiento celular en el HACM que en el pocilio de plástico.

L^os ex vivo el estudio de seguridad no reveló aberraciones cromosómicas estructurales clónales en los cariotipos de ASC en el pase1, pase 4 y pases avanzados (pases 10, 12 ^o16). En todos los pases, se detectaron tetrasomías limítrofes (1,5-5,5 %) para al menos dos cromosomas analizados mediante análisis FISH en células en interfase (corte: 4,5 %). Esta técnica también reveló un clon con sospecha de monosomía 7 en el 15 % de las células en interfase en el pase 16. Estas células aneuploides no parecen tener una ventaja proliferativa porque no se detectan en las células en metafase.

L^osanálisis macroscópicos y microscópicos no encontraron ningún desarrollo de tumor local en el tejido explantado de ratas inmunodeprimidas (meses 1 y 3 después de la implantación) (Figura 30).

Eficacia ex vivo e in vivo de ASC HACM (Vendaje Biológico)

La viabilidad celular después de 72 horas de incubación a 0,1 % de tensión de O2 se comparó con la del 21 % de tensión de O2 (p = 0,034). La hipoxia no tuvo un impacto deletéreo en la viabilidad de ASC y se encontró una secreción significativamente mayor de VEGF en condiciones hipóxicas (0,1 % de tensión de O2) en comparación con 21 % de tensión de O2 (^p< 0,001; n=8) (Figura 31).

La oxigenación dérmica en el día 6 (para cada receptor individual) se consideró como línea de base después de la lesión dérmica. La relación de la tensión de oxígeno en la dermis profunda (después de la lesión térmica) fue significativamente mayor con HACM más ASC que con HACM solo (^p<0,05 en los días 13, 21 y 27 después de la implantación). Se encontró una densidad de vasos significativamente mayor en la dermis reconstituida con HACM más ASC en comparación con la dermis en contacto con HACM solo (p = 0,002) (Figura 32).

Aplicación clínica

L^osASC al final del Pase 3 se tripsinizan y luego se siembran en el HACM para obtener el Pase 4 en la armazón de colágeno. El implante se obtuvo cuando el 90 % de la superficie HACM se cubrió con ASC (5,8 * 105 células por cm2). La fabricación completa del vendaje, desde el aislamiento celular hasta la entrega, se logró en una media de 133 días (Tabla 5).

Tabla 5: Tiempo para la producción con grado clínico del vendaje biológico

Después de la implantación, la incorporación inicial del injertó se produjo el día 3, seguida de la reabsorción progresiva de la matriz de colágeno, que se completó aproximadamente el día 28 después de la implantación, dejando tejido de granulación bien vascularizado en la superficie del lechó de la herida (Figura 33).

En el paciente 1, el cierre completo de la herida se logró el día 60 después de la Implantación y se mantiene (más de 22 meses). En los pacientes 2 y 3, se realizaron autoinjertos de piel sobre el tejido de granulación vascularizado 6 semanas después de la implantación de ASC. L^osautoinjertos de piel se integraron completamente después de 3 días (primera abertura del vendaje) y se asociaron con el alivio del dolor; los cuidados diarios de enfermería se suspendieron a los 6 y 3 meses del implante en los pacientes 2 y 3, respectivamente (Figura 34). En estos dos pacientes se produjo la recurrencia de ulceraciones, lo que probablemente se debió a las etiologías sistémicas de las heridas (drepanocitosis y vasculitis).

Aunque se produjo un aumento significativo de la proteína C reactiva y el fibrinógeno 1 semana después de la implantación, no se observó inflamación crónica; se produjo una disminución a los valores basales 1 mes después de la cirugía (Figura 35).

L^osresultados de la biopsia posimplantación revelaron tejido vascularizado bien organizado en comparación con la fuerte fibrosis antes de la implantación del vendaje (Figura 36). Se encontraron aumentos significativos en VEGF (p<0,001) y factor VIII (^p<0,05) en los tejidos después de la implantación (Figura 37A). Se encontró un reclutamiento macrofágico significativo después de la implantación (^p<0,05), sin modificación de la infiltración de linfocitos (Figura 37B). El HACM solo (sin células) no proporcionó efectos beneficiosos en el paciente 2 (Figura 38).

Juntos, estos resultados demuestran que ASC en HACM puede soportar la restauración de la fisiología para la curación dérmica; ASC puede sobrevivir en un entorno altamente hipóxico y liberar VEGF para promover la neoangiogénesis, la síntesis de tejido de granulación y, en consecuencia, la evolución de la curación.

Ejemplo 5: Regeneración del músculo esquelético

Materiales y métodos

Todos los materiales se obtuvieron de Lonza (Basilea, Suiza), Sigma-Aldrich (St. L^ouI^s, MO, EE. UU.) ^oInvitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU.) a menos que se especifique de cualquier otra manera. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética para el Cuidado Animal local de la Université Catholique de Louvain (2013/UCL/MD/022).

Aislamiento y caracterización de BM-MSC y ASC

Cerdos Landrace Bélgica (hembras, peso <100 kg, edad menor de 6 meses; Rattlerow Seghers Ltd, Lokeren, Bélgica) se usaron como donantes para BM-MSC y ASC.

Se recolectó la BM heparinizada y se mezcló con un volumen doble de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de la centrifugación a 45 ^og durante 10 min, las células se resuspendieron a 107 células/ml, y la suspensión celular se colocó en capas sobre una columna Ficoll-Hypaque (densidad 1,077; Lymphoprep, Nycomed, Oslo, Noruega) y se centrifugó durante 30 min a 1250 g. Las células mononucleares se recogieron de la interfaz y se lavaron en PBS a 450 g durante 10 min. Las células se colocaron en matraces de cultivo en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que se suplementó con suero bovino fetal (FBS) que se inactivó por calor al 10 % y antibióticos (Véritery otros, Biomaterials. 2011; 32:5945-5956).

L^ostejidos adiposos (media, 15 g) se lavaron tres veces con NaCI al 9 %, se cortaron en una placa de Petri para eliminar los vasos y el tejido conjuntivo fibroso, y se colocaron en colagenasa (0,075 g; Sigma-Aldrich) reconstituida en solución salina equilibrada de Hank (con iones calcio y magnesio) en un baño de agua con agitación a 37 °C con agitación continua durante 60 min. Después de la digestión, la colagenasa se inactivó en DMEM que se suplementó con FBS al 10 % que se inactivó por calor, L-glutamina (2 mM) y antibióticos (penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 mg/ml). El tejido que se recolectó se centrifugó durante 10 min a 450 g a temperatura ambiente. A continuación, el precipitado se resuspendió en medio de proliferación (MP) hecho de DMEM que se suplementó con FBS al 10 % y antibióticos (penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 mg/ml). Después de la filtración a través de un tamiz de malla de 500 mm, el tejido se centrifugó durante 10 min a 450 g a temperatura ambiente y luego se resuspendió en medio MP. Este pase inicial de las células primarias se denominó pase 0 (PO). Después de 24 a 48 h de incubación a 37 °C en 5 % de CO2, los cultivos se lavaron con PBS y se mantuvieron en medio MP hasta el pase 4 (P4) y luego se diferenciaron en medios específicos (Schuberty otros, Biomaterials. 2011; 32:8880-8891).

La clasificación de células activadas por fluorescencia (se analizaron al menos 1O OOO eventos mediante citometría de flujo con el software CellquestPro; FACScan, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) confirmó el linaje de células madre mesenquimales al revelar un cambio positivo de la intensidad de fluorescencia media para CD44, CD73, anticuerpos CD9O y CD1O5 (BD Pharmigen, BD Biosciences) conjugados con ficoeritrina (PE), mientras que la expresión del antígeno CD45 fue negativa. Por el contrario, las células mononucleadas de sangre periférica (control negativo) demostraron tinción positiva para CD45 y tinción negativa para CD44, CD73, CD9O y CD1O5. En P4, las diferenciaciones celulares hacia los fenotipos adiposo, osteogénico y condrogénico se confirmaron mediante tinción con aceite rojo, rojo Alizarina y azul alcián, respectivamente.

Impacto ex vivo de la hipoxia en BM-MSC y ASC

ASC y BM-MSC se sembraron en placas de cultivo de 12 pocilios y se incubaron en cámaras hipóxicas (Modular Incubator Chamber MIC-101; Billups-Rothenberg, Del Mar, CA, EE. UU.) de acuerdo un protocolo descrito anteriormente (Schubert y otros, Biomaterials. 2011; 32:8880-8891). Las células se incubaron durante 72 h a 0,1 % y 21 % de O2 niveles en relación con un ambiente altamente hipóxico y normoxia atmosférica, respectivamente. Después de 72 h en cada condición, los sobrenadantes del cultivo celular se recolectaron individualmente, se centrifugaron y se almacenaron a -20 °C para la cuantificación posterior del factor de crecimiento.

La cuantificación de VEGF, IGF-1, FGF, HGF y TGF-pl se logró mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA Quantikine Kit; R&D System, Mineápolis, MN, EE. UU.). Las muestras no se diluyeron y se siguieron las instrucciones del proveedor. La densidad óptica de cada pocilio se midió mediante un espectrofotómetro Multiskan EX Labsystems (Thermo Scientific, Breda, Países Bajos) que se ajustó a 450 nm con una longitud de onda de corrección ajustada a 690 nm. Las liberaciones de factores de crecimiento se expresaron mediante una relación entre hipoxia y normoxia.

La viabilidad celular también se evaluó en condiciones normóxicas e hipóxicas mediante un ensayo de proliferación celular MTS (MTS; Promega, Leiden, Países Bajos) como se describió anteriormente (Schubert y otros, Biomaterials.

2011; 32:8880-8891). Después de la incubación, se midió la densidad óptica de cada pocilio mediante un espectrofotómetro Multiskan EX Labsystems (Thermo Scientific) que se ajustó a 450 nm con una longitud de onda de corrección ajustada a 690 nm.

Matriz de colágeno acelular humano (HACM)

La fascia lata de los donantes que se seleccionaron se obtuvo de acuerdo con la legislación europea y belga relativa a los materiales del cuerpo humano después de una revisión de donantes de tejido humano basada en la historia clínica, pruebas serológicas y ensayos microbiológicos. El tendón de la fascia lata humana se preparó como se describe mediante el ^usode un proceso que se desarrolló por el Banco de Tejidos de1Hospital Universitario Saint-L^uc(Bruselas, Bélgica) para obtener un H^aCM que no contiene residuos químicos (acetona/H202) y que contiene menos del 5 % de humedad residual. Se esterilizó mediante irradiación gamma a 25 000 Gy (Sterigenics, Fleurus, Bélgica). Luego los aloinjertos se almacenaron a temperatura ambiente (Dufrane y otros, Biomaterials. 2008, 29:2237-2248).

El proceso de descelularización (del HACM) se evaluó primero mediante tinción con 40,6-diamidino-2-fenilindol (^dA ^pI; 1 | jg/ml) (Abbot Molecular Inc. EE. UU.) en láminas fijadas con paraformaldehído (4 %) de HACM nativos (n=4) y procesado (n=4) de donantes separados. Las secciones de tejidos se observaron mediante el ^usode un microscopio de fluorescencia (Zeiss, Zaventem, Bélgica) con cámara Infinity y programa de visualización Delta P ^íx. En segundo lugar, el aislamiento de ADN se realizó con QlAamp kit® DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) en muestras de parafina de igual volumen de una matriz nativa congelada (n=4) y una matriz postprocesada (n=4). La concentración de ADN se midió por fluorometría con un fluorómetro Qubit ™ (Invitrogen) con una longitud de onda ajustada a 260 nm. L^osresultados se expresaron en jg/ml de solución de aislamiento de ADN.

Adhesión y propagación ex vivo de MSC en el HACM

Al final del pase 3 (P3), la capacidad celular de MSC para propagarse en e1HACM se comparó con la de las células cultivadas en pocilios de plástico (como control). La adhesión celular en la armazón se evaluó mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM) como ya se describió (Dufrane y otros, Biomaterials. 2002, 23:2979-2988).

La adhesión celular y la propagación (en pocilio de plástico y HACM) fueron estudiadas por CLSM entre el día 1 y el día 30 después de la siembra. Ambos ^mS ^cse sembraron en HACM y en grupos de 24 pocilios a una densidad de 2 ^x105 células/pocillo. Después de la siembra, del día 1 al día 30, I^osinjertos compuestos se retiraron del medio de cultivo, se lavaron en PBS para eliminar el medio, y se sumergieron en calceína acetilmetil ésteres (AM) 2 mm (Molecular Probes Europe BV, Leiden, Holanda) durante aproximadamente 3 h. Luego, I^osinjertos (células más HACM) se unieron a un portaobjetos mediante ei ^usode pegamento de cianoacrilato y se examinaron en el CLSM (Bio-Rad MRC 1024) mediante el ^usouna lente de aire * 10 y la línea de longitud de onda de excitación de 488 nm de un láser de iones de argón. Las células vivas se distinguieron por la presencia de actividad esterasa intracelular ubicua determinada por la conversión enzimática de la calceína ^aM permeable a la célula virtualmente no fluorescente, a la calceína intensamente fluorescente. En el mismo se observó proliferación celular en el pocilio de plástico.

Un día antes del día 30, se extrajo el medio. L^ospocilios se enjuagaron con PBS y se sumergieron en calceína AM. El área total de la célula y el perímetro de la célula se determinaron mediante el ^usodel software de adquisición y análisis Scion Image Beta 4,02. Puesto que la propagación indujo cambios en la forma de la célula, el factor de forma [(área/perímetro2) *4n] también se calculó en función del sustrato y el tiempo.

Propiedades mecánicas de I^osinjertos compuestos (HACM plus MSC)

El impacto de la recelularización ex vivo del HACM por MSC se evaluó mecánicamente. La prueba de resistencia mecánica uniaxial se realizó en muestras por triplicado de fascia lata humana nativa (n=5), HACM liofilizado rehidratado (n=4), HACM solo (sin MSC) que se incubó 4 semanas en medio de cultivo (n=4), y HACM recelularizado con MSC (después de 4 semanas de incubación; n=4). Las pruebas mecánicas se realizaron mediante el ^usode un sistema de tracción Instron con el software Instron bluehill (Modelo 5600; Instron, Cantón, MA, EE. UU.) con una prueba de carga hasta el falló a una tasa de elongación de 4 mm ^xmin-1. La distancia entre los dos agarres fue de 26,5 mm para cada prueba. Las muestras se cortaron a una longitud constante de 45 mm y un anchó de 15 mm. Se registró el grosor de cada muestra. Se registró el comportamiento de la carga de alargamiento de las matrices y los modos de falló. Las propiedades estructurales de las matrices fueron representadas por rigidez (Nm ^xm-1) y carga límite (N). La rigidez (k) se calculó como k = AF/AL, dónde F es la fuerza aplicada sobre el cuerpo y L es el desplazamiento que se produce por la fuerza a lo largó del mismo gradó de libertad (por ejemplo, el cambió de longitud de un resorte que se estira). Estos parámetros se compararon entre cada grupo experimental.

Eficacia in vivo del injertó compuesto HACM más MSC

Se desarrollaron dos modelos experimentales de defecto muscular esquelético para ratas desnudas (n=20; Charles River Laboratories International, Wilmington, MA, EE. UU.) que pesaban 200-300 g (5-8 semanas de edad). La anestesia fue inducida y mantenida por inhalación de isoflurano (Abbvie, Wavre, Bélgica) para realizar una incisión abdominal longitudinal para exponer la musculatura esquelética de la pared abdominal.

1. Defecto muscular de electrocoagulación

En cada animal (n=6), cuatro áreas de necrosis de 16 mm2 se crearon por electrocoagulación en el músculo parietal abdominal. L^osdefectos electrocoagulados fueron cubiertos por: MSC más HACM (dos zonas, células en contacto directo con el área de necrosis); HACM solo (una zona); y simulación (sin injertó, una zona). L^osimplantes se colocaron directamente en estrechó contacto con el defecto mediante cuatro puntadas 5,0 Prolene®. L^osanimales recibieron injertos compuestos hechos de HACM más ASC (n=3) ^oBM-MSC (n=3). L^osinjertos compuestos se implantaron después de un período de 21 a 28 días de incubación de MSC en e1HACM.

2. Defecto muscular de grosor total de la pared abdominal

Un defecto de grosor total (1,5 ^x2,5 cm2) se realizó en la pared muscular abdominal (n=14 ratas desnudas), lo que dio lugar a la exposición de los órganos internos. L^osdefectos se trataron mediante injertó compuesto (HACM más ASC, n=4; HACM más BM-MSC, n=4) ^oHACM solo (n=6).

En ambos modelos, la piel se cerró mediante el ^usode una sutura no reabsorbible para el recubrimiento del sitió de implantación. Se sacrificaron las ratas desnudas el día 30 del postoperatorio mediante inyección intracardíaca de T61 (Intervet, Boxmeer, Países Bajos) bajó anestesia general. Luego se realizó la explantación del injertó y los implantes se procesaron para histomorfometría.

La integración del injertó se evaluó macroscópicamente para la reacción inflamatoria, la integración del injertó, la remodelación de los tejidos, la adhesión a los órganos internos y la aparición de hernias en el modelo de defecto de grosor total.

Se realizó un análisis de histomorfometría 4 semanas después de la implantación para evaluar la angiogénesis y la remodelación de los tejidos. L^osimplantes se fijaron inmediatamente durante la noche en formaldehído al 4 % y se embebieron en parafina. Se montaron secciones seriadas (5 pm de grosor) sobre vidrió y se secarón durante 12 h a 37 °C. Se realizó tinción con hematoxilina y eosina y tinción tricrómica de Masson para evaluar el proceso de proliferación y remodelación vascular. Adicionalmente, se estudió la recolonización muscular mediante inmunotinción para distrofina (diluida a 1:450 y revelada por el anticuerpo monoclonal anticonejo EnVision; Abcam, Cambridge, Reinó Unido).

La remodelación del tejido se cuantificó histomorfológicamente (en el modelo de electrocoagulación) al medir la distancia entre el músculo intacto nativo y el implante (HACM ^opiel para HACM sin ^ocon MSC y simulación, respectivamente) después de la tinción con Masson a un aumentó de ^x12,5 dentro de una escala micrométrica estándar. Se analizaron un mínimo de cinco regiones de interés (R O I^s) en cada portaobjeto. La remodelación del tejido se calculó mediante una relación entre el grosor que se obtuvo con HACM (solo ^ocon MSC) y la simulación. En el modelo de defecto de la pared abdominal, se realizó una tinción con distrofina para estudiar la recolonización muscular del implante.

La densidad vascular se estudió al contar los vasos con un aumentó de ^x25 dentro de una cuadrícula estándar que representa una superficie de 0,16 mm,2 en portaobjetos con tinción tricrómica de Masson. Se analizaron un mínimo de cinco RO I^sen cada portaobjeto.

Análisis estadístico

Se usaron la prueba de Kolmogorov-Smirnov de una muestra y I^osgráficos QQ para asegurar la distribución normal de valores. L^osresultados se expresaron como medias ± DE a menos que se indique de cualquier otra manera. Las diferencias estadísticamente significativas entre I^osgrupos experimentales se analizaron mediante el ^usode la prueba t de Student ^oel análisis de varianza unidireccional con una prueba post hoc de Bonferroni. Las pruebas estadísticas se realizaron con PASW 18 (SPSS; Westlands Centre, Quarry Bay, Hong Kong). Las diferencias se consideraron significativas para ^p<0,05.

Resultados

Impacto de la hipoxia en la liberación del factor de crecimiento MSC para la regeneración muscular

En hipoxia (en comparación con normoxia), se encontró una tasa de supervivencia significativamente mejor para ASC en comparación con BM-MSC con 1 ⁱ9,5±6,1 % ^vs86,8±1,5 % de viabilidad celular, respectivamente (^p<0,05; Figura 39). Se obtuvo emisiones significativamente más altas de FGF y VEGF para AMSC en comparación con BM-MSC al 0,1 % y 21 % O2 (^p<0,05) (Figura 40, A y B). Además, la hipoxia mejoró la liberación de VEGF para ASC (+37 %; ^p<0,05) sin ningún impacto en BM-MSC.

Una cantidad significativamente menor de IGF se secretó por ASC en comparación con BM-MSC en hipoxia, así como también en normoxia (^p<0,005). N^ose encontró un impacto significativo de la tensión de oxígeno en la liberación de TGF y HGF para ambas M ^sC (Figura 40, D y E).

Adhesión y propagación de MSC en el HACM

La descelularización de HACM se confirmó por primera vez mediante la detección de núcleos fluorescentes raros después de la tinción con DAPI en matrices procesadas en comparación con matrices nativas (datos que no se muestran). N^ose midió la detección de ADN con el fluorómetro Qubit (<0,01 pg/ml en comparación con una media de 1,45 pg/ml encontrada en cuatro fascias lata nativas independientes).

Se observó una propagación óptima (con alargamiento celular por un factor de forma cercano a 0) en el pocilio de plástico el día 13 tanto para ASC como para BM-MSC (0,22±0,001). Se observó un retraso significativo para obtener la máxima propagación celular en el HACM después de 27 y 30 días para ASC (0,31±0,03) y BM-MSC (0,48±0,02), respectivamente. Se encontró una propagación de MSC significativamente menor entre I^osdías 5 y 18 (en comparación con el pocilio de plástico; ^p<0,05; Figura 41). Además, se encontró una diferencia significativa en la propagación de MSC (ASC versus BM-MSC) entre 11 y 30 días después de la siembra en e1HACM (^p<0,05; Figura 41).

La recuperación total del pocilio de plástico se obtuvo dentro de las 2 semanas posteriores a la incubación con ambos orígenes de MSC, que se retrasó en HACM en I^osdías 21 y 30 para ASC y BM-MSC, respectivamente (p<0,05). El porcentaje de área de recuperación de HACM fue significativamente menor en comparación con el de recuperación del pocilio plástico entre el día 3 y el día 18 y entre el día 3 y el día 27 tanto para ^aS ^ccomo para BM-MSC, respectivamente (^p<0,05). Se obtuvo un retraso significativo de la recuperación de HACM con BM-MSC en comparación con ASC entre I^osdías 13 y 28 después de la incubación (^p<0,05) (Figura 42).

Eficacia in vivo del injerto compuesto HACM más MSC

1. Defecto muscular de electrocoagulación

A las 4 semanas después de la implantación, la angiogénesis fue significativamente mayor en las áreas tratadas con ASC y HACM en comparación con BM-MSC y HACM y con HACM ^soI^o(434±108 % frente a 215±13 % frente a 144±57 % con relación a la simulación; p< 0,001) (Figura 43A).

Después de 4 semanas, macroscópicamente se encontró una mejor integración del músculo esquelético con el injerto compuesto (HACM más MSC) en comparación con HACM ^soI^o, como se confirmó por hematoxilina y eosina y tricrómico de Masson, con una fibrosis residual significativamente menor (relación en comparación con la simulación) para ASC ^oBM-MSC más HACM en comparación con HACM ^soI^o(23±9 % y 24±10 % frente a 49±17 %, respectivamente; ^p<0,05). N^ose encontraron diferencias entre ASC y BM-MSC (Figura 43B).

2. Defecto muscular de grosor total de la pared abdominal

N^ose observó incidencia de hernia abdominal sin ninguna adherencia intra-abdominal con órganos abdominales con HACM ^soI^{o o}cuando se suplementó con MSC. Aunque se detectaron algunas células de distrofina positivas cerca del borde de la sutura para cada receptor con HACM y MSC, no se encontraron células positivas en el núcleo del implante abdominal. A las 4 semanas después de la implantación, la angiogénesis mejoró significativamente en el implante hecho de ASC y HACM en comparación con BM-MSC más HACM y HACM ^soI^o(21,4±1,0 frente a 11,2±2,3 frente a 11,8±3,1 vasos/cuadrilla; ^p<0,05) (Figura 44).

Un injerto compuesto hecho de ASC demostró la capacidad de las células madre adiposas para sobrevivir bajo hipoxia ex ^vivo , la capacidad de obtener una liberación celular óptima mediante una armazón de matriz de colágeno descelularizado, la capacidad de mejorar la liberación de factores proangiogénicos por un mecanismo sensible al oxígeno, la capacidad de reclutamiento vascular in vivo durante la fase de estrés temprano después del trasplante y, finalmente, la capacidad de reducir la cicatriz fibrótica en comparación con una armazón libre de células. Todas estas propiedades podrían promover la regeneración del músculo esquelético.

Además, estos resultados demostraron que ASC ejerce mejor ex ^vivo y en ^vivo acciones proangiogénicas con control preciso en hipoxia cuando BM-MSC ejercen acciones antifibróticas específicas. E1HACM es una armazón ideal para la adhesión, propagación y liberación de células de MSC, que permanecen como requisitos mecánicos para la necrosis del músculo esquelético y los defectos de tamaño crítico.

Claims

r e iv in d ic a c io n e s

1. Una composición que comprende una matriz biocompatible y una población de células madre mesenquimales, en donde dichas células madre mesenquimales se derivan de tejido adiposo, en donde dicha población de células madre mesenquimales es sustancialmente pura, en donde dichas células madre mesenquimales son indiferenciadas y en donde dicha población de células madre mesenquimales comprende menos del 25 % de fibroblastos.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dichas células madre mesenquimales se derivan de tejido adiposo subcutáneo.

3. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ^o2, en donde dicha matriz biocompatible es acelular.

4. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha matriz biocompatible comprende colágeno.

5. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha matriz biocompatible es humana, porcina, bovina ^oequina.

6. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde las células madre mesenquimales se originan a partir del sujeto a tratar.

7. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para ^{su uso}en el tratamiento de una lesión de tejidos blandos en un sujeto que lo necesite.

8. La composición para ^{su uso}de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho tejido blando se selecciona del grupo que comprende tejido cutáneo, tejido muscular, tejido dérmico, tejido tendinoso, tejido de ligamento, tejido de menisco y tejido de vejiga.

9. La composición para ^{su uso}de acuerdo con la reivindicación 7 ^u8, en donde dicha lesión de tejidos blandos es una herida aguda ^ocrónica.

10. La composición para ^{su uso}de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde dicha lesión de tejidos blandos se selecciona del grupo que comprende desgarros ^oroturas de tejido blando, heridas cutáneas, quemaduras cutáneas, úlceras cutáneas, heridas quirúrgicas, enfermedades vasculares, enfermedades musculares, hernias y heridas por radiación.

11. La composición para ^{su uso}de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicha herida cutánea es una herida diabética.

12. La composición para ^{su uso}de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde dicha composición se administra por vía tópica ^opor implantación quirúrgica.

13. Un método para la preparación de una composición que comprende una matriz biocompatible y una población de células madre mesenquimales, que comprende incubar una población de células madre mesenquimales sustancialmente pura con una matriz biocompatible, en donde dichas células madre mesenquimales se derivan de tejido adiposo, en donde dichas células madre mesenquimales son indiferenciadas y en donde dicha población de células madre mesenquimales comprende menos del 25 % de fibroblastos.