CN113876687B - 一种改善肌肤生理特性的活性肽与胎盘干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用 - Google Patents

一种改善肌肤生理特性的活性肽与胎盘干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113876687B
CN113876687B CN202111376134.XA CN202111376134A CN113876687B CN 113876687 B CN113876687 B CN 113876687B CN 202111376134 A CN202111376134 A CN 202111376134A CN 113876687 B CN113876687 B CN 113876687B
Authority
CN
China
Prior art keywords
exosome
skin
centrifuging
cell
active peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111376134.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN113876687A (zh
Inventor
张冬久
钟春秀
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Saier Regenerative Medicine Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Beijing Saier Regenerative Medicine Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Saier Regenerative Medicine Biotechnology Co ltd filed Critical Beijing Saier Regenerative Medicine Biotechnology Co ltd
Priority to CN202111376134.XA priority Critical patent/CN113876687B/zh
Publication of CN113876687A publication Critical patent/CN113876687A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113876687B publication Critical patent/CN113876687B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/50—Placenta; Placental stem cells; Amniotic fluid; Amnion; Amniotic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/59—Mixtures
    • A61K2800/592—Mixtures of compounds complementing their respective functions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation

Abstract

本发明涉及一种改善肌肤生理特性的活性肽与胎盘干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用。本发明通过提供一种高效促进胎盘干细胞外泌体的分泌方法制备得到了高活性的外泌体，所述外泌体导入活性肽之后，能够显著的促进成纤维细胞的增殖以及皮肤损伤的修复，促进成纤维增殖便能够恢复和保持年轻状态的皮肤弹性和光泽，防止皱纹的产生，具有较好的应用前景。

Description

一种改善肌肤生理特性的活性肽与胎盘干细胞外泌体在药品 或化妆品中的应用
技术领域
本发明涉及化妆品和药物领域，更具体的涉及一种改善肌肤生理特性的活性肽与胎盘干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用。
背景技术
随着生活水平提高和科学技术进步，人类的寿命不断增加，老龄化现象也日趋严重。皮肤作为人体的外部器官，与环境有着直接接触，更易受到外部侵袭损伤，造成干燥、皱纹、下垂、色斑等老化现象。皮肤老化有一系列成因，包括内在的细胞增殖和修复能力衰退，以及外部的环境损伤。随着研究手段的不断更新，研究者们对于产生皮肤老化的作用机制也有了更为清晰的认知，包括随着年龄增加而产生的生理代谢变化如何导致皮肤结构的改变，外部的刺激通过何种途径造成皮肤损伤。在此基础上，可以更有针对性地开发抗衰老活性物质，特应性地抑制或阻断某种老化反应过程，实现靶向抗衰老作用。
皮肤由于自身代谢和受紫外辐射等因素，会产生自由基，形成氧化应力。正常情况下，皮肤会产生天然抗氧化物质来阻止活性氧对细胞的损伤，但当皮肤自身的抗氧化能力不足以抵抗活性氧应力时，过剩的活性氧应力会造成细胞损伤，如导致蛋白质、脂质乃至DNA的降解，从而使皮肤失去弹性，产生皱纹。为了平衡氧化应力，由外而内地为肌肤补充抗氧化物质以及激发自身的抗氧化物质的产生都是十分有效的途径。活性氧应力除了对细胞产生直接损伤外，还会激发身体内的炎症因子，从炎症途径造成细胞老化和损伤。炎症因子一方面可以减少胶原蛋白合成前体骨胶原的合成，造成胶原蛋白的结构异常和破坏，降低胶原蛋白的含量；另一方面，通过增加基质金属蛋白酶的合成、提高酶活力以及促进抑制剂失活来维持高含量的基质金属蛋白酶，实现其对细胞外基质的降解。尽管已知细胞增殖能力的衰退和丧失是皮肤老化的重要内在因素，但如何增加细胞的增殖能力，也是在近几年随着干细胞研究的深入才逐渐开始发起的新兴领域。在研究过程中发现，生长因子在皮肤重组、修复和重建上具有很大的作用，可促进角质生成细胞和成纤维细胞的增殖，也可促进其他由于老化导致增殖活力降低的细胞的生长，增加表皮的厚度。
近年来，干细胞治疗逐渐成为皮肤损伤修复的新途径。研究表明，MSCs能够促进皮肤创面愈表皮细胞和成纤维细胞在皮肤创伤修复过程中扮演重要角色，参与创伤修复的激活、增生和再上皮化、创口收缩、组织重建、细胞外基质沉积等多个生理过程。已有体外研究表明，干细胞在局部微环境的影响下可直接分化为皮肤创伤修复所需细胞系，如表皮细胞系、成纤维细胞系、内皮细胞系，同时干细胞可以分泌生长因子，促进表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞的增殖和迁移，进而促进皮肤创伤愈合。而胎盘间充质干细胞因其来源丰富，易于采集，且在特定的诱导条件下可以向中胚层、外胚层、内胚层细胞分化，较易在体外培养、诱导和扩增，临床应用不存在免疫排斥、不涉及伦理问题等，其在动物实验与临床应用方面都取得很打进展。干细胞可以分泌一种囊泡，即外泌体，是细胞之间相互作用的一个重要载体，当外泌体输入至衰老个体中，可被吞噬，而外泌体身上拥有诸多功能蛋白，功能蛋白可改变衰老细胞。临床试验表明干细胞外泌体具备抗衰、修复的作用，目前已有相关护肤产品上市。
多肽可以促进胶原蛋白的分泌，对应护肤品在消除眼纹等皱纹上有较好的效果。目前，活性生物多肽具有安全稳定、易溶于水、易吸收、分子量小等优点，同时具有清除自由基、抗氧化、抗衰老等多种生物活性，不仅能够促进皮肤细胞的增殖，还可以为皮肤提供营养，延缓皮肤老化，促进皮肤创伤修复，因此被广泛应用于皮肤化妆品和抗衰老化妆品中。但是多肽也存在稳定性较差、细胞穿透力较差以及在组织里蓄积也较差等问题，
为了保持年轻的肌肤状态，越来越多的消费者开始使用具有抗衰老功效的化妆品，但是目前将外泌体和活性肽一起使用用于皮肤抗衰老治疗药物或者化妆品的应用变得迫在眉睫。
发明内容
本发明涉及一种胎盘干细胞外泌体用于改善皮肤生理特性。
在本发明的一个实施方案中，干细胞外泌体为1×104-1×106天外泌体存在。
另外一方面，本发明提供一种胎盘干细胞外泌体的制备方法。具体包括如下步骤：
胎盘间充质干细胞的分离：剪取胎盘绒毛膜面1～2cm厚的组织，剪成1mm×1mm×1mm的碎块，用PBS漂洗至无色，用0.25％胰蛋白酶与0.2％胶原酶IV37℃水浴消化1h，振荡后静置1min，使液体自然分为三层，吸取中间层悬液于离心管中，加入PBS，摇匀后700r/min离心5min，弃上清，加入3mL间充质干细胞培养液(87％DMEM，10％胎牛血清(FBS)，1％L-谷氨酰胺，1％青链霉素)重悬沉淀，700r/min离心5min，弃上清。加入适量培养液混匀，转入细胞培养瓶中，37℃，5％CO2，培养箱中培养细胞生长至80％时，进行胰酶消化传代。传代时，以0.25％胰蛋白酶消化3～4min，加细胞培养液终止消化，700r/min离心10min，弃消化液，加入细胞培养液吹打混匀，收集细胞悬液，接种于细胞培养瓶，置于37℃，5％CO2培养箱中以培养液：87％DMEM，10％胎牛血清(FBS)，1％L-谷氨酰胺，1％青链霉素，进行培养。
取制备的胎盘干细胞，细胞融合生长至85％时，换外泌体促分泌培养基(15％AGS、0.5％人参总皂苷加84.5％DMEM/F12)培养60h，收集细胞上清液。300×g离心10min，去除死细胞和大的细胞碎片，2000×g离心10min，去除死细胞和细胞碎片，10000×g/min离心30min去除细胞碎片较大的囊泡，0.22μm针头滤器过滤，去除微泡及可能存在的凋亡小体。用20mL空针将上清液转移至超速离心管中，106×g离心70min，去除上清液，收集沉淀，得到粗提取的外泌体，106×g离心70min，去除上清液，用100μL PBS溶解沉淀，得到较纯的外泌体。
本发明另外一方面，提供一种具有促进皮肤损伤修复的多肽，所述多肽能够促进人成纤维细胞的增殖，同时，还具有促进皮肤伤口修复的功能。本领域都比较明了，促进成纤维细胞增殖，能够恢复和保持年轻状态的皮肤弹性和光泽，减轻皱纹的产生。
本发明另外提供一种导入了多肽的外泌体，具体的，为将外泌体溶解在含有50mM海藻糖的PBS缓冲液中；将SEQ ID NO：1的活性肽也加入到上述缓冲液中，混匀后转入电转杯中进行电转，电击条件为电压400V，电容175μF，41Tim电转杯进行电转。随后用倒置离心超滤膜过滤，除去游离和非特异性结合的多肽，即得到导入了多肽的外泌体。
在本发明的一个实施方案中，所述导入了多肽的干细胞外泌体具有特应性皮肤损伤修复改善效果，可以制备成为化妆品或者药品、药物。
在本发明的一个实施例中，化妆品为护肤液，皮肤软化剂，一种洗剂，一种乳液，保湿洗剂，一种营养洗剂，按摩霜，营养霜，霜保湿剂，护手霜，粉底霜，香精，营养精华素，包装，肥皂，清洁泡沫，清洁液，清洁霜，身体乳液，身体清洗剂，面部清洗剂，治疗剂，美容乳液，包装化妆品，软膏，凝胶，搽剂，溶液，贴剂和喷雾制剂中的任意一种。
另外，本发明提供了干细胞来源的外泌体，所述外泌体包含作为活性成分用于预防或治疗皮肤损伤修复的药物组合物。
在本发明的一个实施方案中，用于皮肤损伤的的组合物是化妆品组合物或可以是本发明的外用剂。例如，化妆品组合物可以是乳膏或洗剂。
在本发明的一个实施方案中，用于皮肤损伤修复的组合物中，其中干细胞的外泌体能够促进皮肤损伤快速修复。
另一方面，在本发明的一个实施方案中，皮肤外用组合物用于皮肤损伤修复和/或在化妆品组合物的情况下，本发明的效果通常在不会对该成分的化妆品或皮肤外用制剂产生不利影响的范围内，例如，根据本领域的需要，可以适当地混合增湿剂，抗氧化剂，油性组分，紫外线吸收剂，乳化剂，表面活性剂，增稠剂，醇，粉末组分，着色剂，水性组分，水，各种皮肤营养物等。
另外，在本发明的一个实施方案中和/或皮肤外用制剂的化妆品组合物，其效果(改善皮肤状况等)不损害常用的皮肤改善剂和/或可混合使用。例如，衍生自本发明干细胞的外体水凝胶，透明质酸，透明质酸盐(例如透明质酸钠等)，或至少一种支持在透明质酸凝胶上的物质可以是相同的或不同的。在本发明的一个实施方案和/或化妆品组合物中的皮肤外用制剂中，但不限于水凝胶的类型，胶凝聚合物优选是通过分散本发明的水凝胶获得的多元醇。胶凝聚合物是Pluronic，纯化琼脂，琼脂糖，结冷胶，海藻酸，卡拉胶，决明子胶，黄原胶，半乳甘露聚糖，葡甘露聚糖，果胶，纤维素，瓜尔豆胶和刺槐豆胶以及选自1和2种物质中的至少一种，其中多元醇包括乙二醇，丙二醇，1，3-丁二醇，异丁烯二醇，二丙二醇，山梨醇，木糖醇和甘油，还可以存在至少一种选自1的物质。
在本发明的一个实施方案中，可以包括通常使用的皮肤外用制剂和/或化妆品成分的化妆品组合物和/或皮肤外用制剂，所述化妆品成分包括例如抗氧化剂，稳定剂，增溶剂，维生素，色素和调味剂，例如常规的佐剂和载体。此外，可以无任何困难地根据本领域技术人员适当地选择每种制剂中的皮肤外用制剂和/或化妆品组合物，化妆品组合物或皮肤外用制剂的其它组分和/或预期用途和种类。
有益效果
本发明通过提供一种高效促进胎盘干细胞外泌体的分泌方法制备得到了高活性的外泌体，所述外泌体导入活性肽之后，能够显著的促进成纤维细胞的增殖以及皮肤损伤的修复，促进成纤维增殖便能够恢复和保持年轻状态的皮肤弹性和光泽，防止皱纹的产生，具有较好的应用前景。
附图说明
图1 280nm的紫外吸收情况结果图
图2伤口面积结果图
图3TNF－α表达量结果图
具体实施方式
下面结合具体实施例介绍本发明的技术方案。下述实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，无特别要求，都是本领域技术人员容易获得的常规材料。
实施例1胎盘干细胞的制备
胎盘间充质干细胞的分离：剪取胎盘绒毛膜面1～2cm厚的组织，剪成1mm×1mm×1mm的碎块，用PBS漂洗至无色，用0.25％胰蛋白酶与0.2％胶原酶IV37℃水浴消化1h，振荡后静置1min，使液体自然分为三层，吸取中间层悬液于离心管中，加入PBS，摇匀后700r/min离心5min，弃上清，加入3mL间充质干细胞培养液(87％DMEM，10％胎牛血清(FBS)，1％L-谷氨酰胺，1％青链霉素)重悬沉淀，700r/min离心5min，弃上清。加入适量培养液混匀，转入细胞培养瓶中，37℃，5％CO2，培养箱中培养细胞生长至80％时，进行胰酶消化传代。传代时，以0.25％胰蛋白酶消化3～4min，加细胞培养液终止消化，700r/min离心10min，弃消化液，加入细胞培养液吹打混匀，收集细胞悬液，接种于细胞培养瓶，置于37℃，5％CO2培养箱中以培养液：87％DMEM，10％胎牛血清(FBS)，1％L-谷氨酰胺，1％青链霉素，进行培养。
胎盘间充质细胞干细胞特异性抗原的鉴定选取处于指数生长期的第三代的胎盘间充质细胞，用0.25％胰蛋白酶消化后，收集细胞悬液于离心管中，调整细胞浓度为1×105μL；取6只试管，每管分别加15μL鼠抗人单克隆抗体CD29-PE、CD44-FITC、CD105-FITC、CD34-FITC、CD106-FITC，以鼠抗人IgG2a-FITC、IgG1-PE作为阴性对照，再分别加入150μL细胞悬液混匀，室温避光放置10min，之后再用PBS洗2次，流式细胞仪检测，Cellquest软件获取与分析。结果显示，第三代的胎盘间充质干细胞的CD44阳性率为99.2％，CD29的阳性率为99.3％，CD105的阳性率为99.0％，不表达CD34和CD106(小于1％)表明分离制备得到了胎盘间充质细胞干细胞。
实施例2高活性胎盘间充质细胞干细胞外泌体的制备
取实施例1制备的胎盘干细胞，细胞融合生长至85％时，换外泌体促分泌培养基(15％AGS、0.5％人参总皂苷加84.5％DMEM/F12)培养60h，收集细胞上清液。300×g离心10min，去除死细胞和大的细胞碎片，2000×g离心10min，去除死细胞和细胞碎片，10000×g/min离心30min去除细胞碎片较大的囊泡，0.22μm针头滤器过滤，去除微泡及可能存在的凋亡小体。用20mL空针将上清液转移至超速离心管中，106×g离心70min，去除上清液，收集沉淀，得到粗提取的外泌体，106×g离心70min，去除上清液，用100μL PBS溶解沉淀，得到较纯的外泌体。
取5μL外泌体溶液，用BCA法测外泌体的蛋白浓度；取1滴外泌体滴于铜网上，体积分数1％磷钨酸负染，室温干燥后，用透射电子显微镜观察外泌体外形及检测外泌体直径；取20μL外泌体溶液，用PBS稀释至200μL，用粒度仪检测直径分布。结果显示，外泌体的形态学观察外泌体外形为杯状，有膜结构，直径分布在(75-110)nm，BCA蛋白浓度测定结果为2.4g/L。
实施例3胎盘间充质细胞干细胞外泌体对照例的制备
取实施例1制备的胎盘干细胞，细胞融合生长至85％时，换外泌体促分泌培养基(15％AGS加85％DMEM/F12)培养60h，收集细胞上清液。300×g离心10min，去除死细胞和大的细胞碎片，2000×g离心10min，去除死细胞和细胞碎片，10000×g/min离心30min去除细胞碎片较大的囊泡，0.22μm针头滤器过滤，去除微泡及可能存在的凋亡小体。用20mL空针将上清液转移至超速离心管中，106×g离心70min，去除上清液，收集沉淀，得到粗提取的外泌体，106×g离心70min，去除上清液，用100μL PBS溶解沉淀，得到较纯的外泌体。
取5μL外泌体溶液，用BCA法测外泌体的蛋白浓度；取1滴外泌体滴于铜网上，体积分数1％磷钨酸负染，室温干燥后，用透射电子显微镜观察外泌体外形及检测外泌体直径；取20μL外泌体溶液，用PBS稀释至200μL，用粒度仪检测直径分布。结果显示，外泌体的形态学观察外泌体外形为杯状，有膜结构，直径分布在(70-100)nm，BCA蛋白浓度测定结果为1.3g/L。
从实施例2和3的结果可以看出，通过添加人参总皂苷之后，可以显著的促进外泌体的分泌以及提高外泌体的直径分布效果，其中外泌体的分泌量提高了接近90％，具有较好的促进效果。
实施例4融合多肽的外泌体制备
将4×109的外泌体溶解在500μL含有50mM海藻糖的PBS缓冲液中；将1mg的SEQ IDNO：1的活性肽也加入到上述缓冲液中，混匀后转入电转杯中进行电转，电击条件为电压400V，电容175μF，41Tim电转杯进行电转。随后用倒置离心超滤膜过滤，除去游离和非特异性结合的多肽。
通过280nm的紫外吸收情况测定多肽是否转染成功，空白对照：400μl含有50mM海藻糖的PBS缓冲液；阴性对照不添加多肽作为对照：将4×109的外泌体溶解在500μL含有50mM海藻糖的PBS缓冲液中；处理流程同上述电转步骤。测量在280nm的紫外吸进行情况，测试结果如图1所示，由图1可知，经电穿孔转导后并洗脱去未导入到外泌体中的多肽后，实验样品在280nm的紫外吸收值达到0.20，高于对照二个组的紫外吸收值证明通过电穿孔转导多肽有效导入到外泌体。
实施例5促进成纤维细胞增殖实验
以MTT法检测细胞增殖能力:将处于对数生长期的HSF以1×103/mL细胞密度接种至96孔细胞培养板，待细胞完全贴壁后，换用浓度为105/mL的实施例2-4制备的外泌体或者SEQ ID NO：1的多肽(50ug/mL)的无血清RPMI-1640培养液继续培养24h。以正常无血清RPMI-1640培养液作为对照组，以槲皮素为阳性对照(用量为50ug/mL)，每组设6个复孔。每孔加入20μl、5mg/ml MTT溶液继续孵育4h，弃上清，每孔加入150μl二甲亚砜(DMSO)以充分溶解沉淀，于490nm下测定吸光度值(A)。结果如表1所示。
表1各组吸光度值
Figure BDA0003363918020000081
Figure BDA0003363918020000091
从表1的结果可以看出，采用外泌体培养HSF细胞后，能够明显的刺激所述细胞的增殖，而采用皂苷培养获得外泌体具有比不用皂苷培养的外泌体更好的活性。此外，所述多肽本身具有比外泌体更好的刺激HSF增殖的效果，将多肽导入到外泌体之后，具有明显的协同促进HSF细胞增殖的效果，其吸光度值达到了0.97±0.08，比阳性对照具有显著的提高。
实施例6小鼠实验
150只BALB/c小鼠随机分为5组:①对照组；②模型组；③多肽组；④实施例3外泌体治疗组；⑤实施例4外泌体治疗组；每组30只。除对照组外各组采用免疫抑制复合皮肤伤口的方法制备慢性皮肤溃疡小鼠模型，于实验前连续7天肌内注射氢化可的松0.5mg/d；空白组小鼠肌内注射0.2ml生理盐水。实验时给予戊巴比妥钠60mg/kg腹腔麻醉，背部去毛，消毒，用特制打孔器在鼠背打一圆孔，切取直径11mm的皮肤，深至皮下。造模后单笼饲养，在SPF级动物室无菌饲料喂养。治疗组伤口滴加50μl含量为5×106的外泌体或者50μl含有100ug的多肽，一次性无菌敷料贴包扎，3天换药1次并拍照。皮肤损伤后，对照组和模型组小鼠隔天肌内注射0.25mg/d生理盐水，其余组小鼠隔天肌内注射相同剂量氢化可的松0.25mg/d。于小鼠皮肤创面形成后第10天处死后取伤口组织。
检测指标与方法:(1)伤口面积:小鼠造模后第10天照相，使用图像分析软件IPP5.1计算伤口面积。结果如图2所示。
从图2可以看出，10天时，对照组与模型组创面面积差异有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，外泌体组和多肽组组创面面积均明显缩小，这说明多肽和外泌体均能够显著的缩小创面面积，特别是导入了多肽的外泌体其创伤面积只有18.1±1.3mm2，具有更小的创伤面积。
(2)TNF－α(放免法):取伤口的肉芽组织，称重，放入1ml生理盐水中匀浆，离心3000r/min，20min，取上清，按放免说明书操作，γ－计数器测定放射性计数。结果如图3所示。
创伤后10天模型组TNF－α水平高于对照组，多肽组与外泌体组各组TNF－α水平与模型组比较明显降低(P＜0.01)，特别是导入了多肽的外泌体组的TNF－α水平只有(11.0±1.9)ng/mL，见图3。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；实施例中涉及到试剂浓度以及其它参数为在本发明构思下的一种可行方式，并不限制于本实施例中所限定的相关实验参数；在本发明构思下，能够解决相关技术问题，达到本发明技术效果的相关实验参数均在本发明保护的范围内；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 北京远胜达生物科技发展有限公司
<120> 一种改善肌肤生理特性的活性肽与胎盘干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Trp Lys Gln Lys His His Tyr Asn Tyr Lys Gln Met Tyr
1 5 10

Claims (1)

1.一种导入了活性肽的外泌体在制备皮肤损伤修复、促进成纤维细胞增殖防止皱纹产生的药物组合物中的用途，其特征在于：所述活性肽的序列如SEQ ID NO：1所示，所述外泌体为胎盘干细胞外泌体；其中所述导入了活性肽的外泌体的制备方法如下：将外泌体溶解在50mM海藻糖的PBS缓冲液中；将SEQ ID NO：1的活性肽也加入到上述缓冲液中，混匀后转入电转杯中进行电转，电击条件为电压400V，电容175μF，41Tim电转杯进行电转；随后用倒置离心超滤膜过滤，除去游离和非特异性结合的多肽，即得到导入了多肽的外泌体；其中外泌体是胎盘干细胞外泌体，所述外泌体的制备方法为：取胎盘干细胞，细胞融合生长至85%时，换外泌体促分泌培养基：15%AGS、0.5%人参总皂苷加84.5%DMEM/F12培养60h，收集细胞上清液；300×g离心10min，去除死细胞和大的细胞碎片，2000×g离心10min，去除死细胞和细胞碎片，10000×g/min离心30min去除细胞碎片较大的囊泡，0.22μm针头滤器过滤，去除微泡及可能存在的凋亡小体，用20mL空针将上清液转移至超速离心管中，106×g离心70min，去除上清液，收集沉淀，得到粗提取的外泌体，再用106×g离心70min，去除上清液，用100μL PBS溶解沉淀，得到较纯的外泌体。
CN202111376134.XA 2021-11-19 2021-11-19 一种改善肌肤生理特性的活性肽与胎盘干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用 Active CN113876687B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111376134.XA CN113876687B (zh) 2021-11-19 2021-11-19 一种改善肌肤生理特性的活性肽与胎盘干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111376134.XA CN113876687B (zh) 2021-11-19 2021-11-19 一种改善肌肤生理特性的活性肽与胎盘干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113876687A CN113876687A (zh) 2022-01-04
CN113876687B true CN113876687B (zh) 2022-09-30

Family

ID=79015907

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111376134.XA Active CN113876687B (zh) 2021-11-19 2021-11-19 一种改善肌肤生理特性的活性肽与胎盘干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113876687B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114983922B (zh) * 2022-06-16 2023-09-05 广东赛尔生物科技有限公司 生物活性肽与干细胞外泌体在皮肤修复中的应用
CN115089698B (zh) * 2022-06-16 2023-06-16 广州市拜沃思生物科技有限公司 改善皮肤的活性肽与干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用
CN117327153B (zh) * 2023-10-10 2024-05-07 安龄(上海)生物科技有限公司 一种活性肽与植物外泌体抗衰化妆品的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113248573A (zh) * 2021-05-18 2021-08-13 北京戴域生物技术有限公司 改善皮肤生理特性的活性肽与间充质干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用
CN113307851A (zh) * 2021-06-11 2021-08-27 北京戴域生物技术有限公司 一种改善皮肤生理特性的活性肽与间充质干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用
CN113559238A (zh) * 2021-08-16 2021-10-29 北京戴域生物技术有限公司 一种含有活性肽并具有抗衰老作用的药品或化妆品
CN113563452A (zh) * 2021-07-15 2021-10-29 北京戴域生物技术有限公司 一种生物活性肽及其与脂肪干细胞外泌体在皮肤增殖修复中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113248573A (zh) * 2021-05-18 2021-08-13 北京戴域生物技术有限公司 改善皮肤生理特性的活性肽与间充质干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用
CN113307851A (zh) * 2021-06-11 2021-08-27 北京戴域生物技术有限公司 一种改善皮肤生理特性的活性肽与间充质干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用
CN113563452A (zh) * 2021-07-15 2021-10-29 北京戴域生物技术有限公司 一种生物活性肽及其与脂肪干细胞外泌体在皮肤增殖修复中的应用
CN113559238A (zh) * 2021-08-16 2021-10-29 北京戴域生物技术有限公司 一种含有活性肽并具有抗衰老作用的药品或化妆品

Also Published As

Publication number Publication date
CN113876687A (zh) 2022-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113876687B (zh) 一种改善肌肤生理特性的活性肽与胎盘干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用
JP6847080B2 (ja) 皮膚美白またはしわ改善用組成物
JP5981947B2 (ja) スキンクリーム
US9119974B2 (en) Skin cream
US11446333B2 (en) Use of composition comprising stem cell-derived exosome as effective ingredient for suppression or alleviation of pruritus
US20110294731A1 (en) Skin cream
CN112239746A (zh) 一种人脐带间充质干细胞外泌体提取液的制备及外泌体乳霜的制备方法
WO2021147922A1 (zh) 细胞外囊泡及其在皮肤产品的用途
US20220127578A1 (en) Novel exosome production method and application thereof
EP2427167A1 (en) Method and composition for restoration of age-related tissue loss in the face or selected areas of the body
CN115282065A (zh) 一种含间充质干细胞外泌体的冻干粉及其制备方法和应用
CN113855619B (zh) 胎盘干细胞外泌体在制备皮肤美容化妆品或药物中的应用
CN113750216B (zh) 一种抗衰老的化妆品或药物
KR20130021793A (ko) 지방 유래 성체줄기세포 배양액의 나노섬유 또는 나노캡슐을 포함하는 화장료 조성물 및 그 제조방법
KR102008665B1 (ko) 사포게닌과 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물
CN117106712B (zh) 一种用于皮肤再生的干细胞外泌体及其应用和产品
KR102368442B1 (ko) 생리활성이 강화된 엑소좀의 생산방법 및 이의 응용
WO2018155979A1 (ko) 줄기세포 유래 나노소포체 및 이를 포함하는 발모 및 육모 촉진용 조성물
US11744856B1 (en) Compositions and methods to improve skin quality and appearance, cure skin and tissue damage, and use in therapy
CN115947790A (zh) 成纤维细胞外基质制备的三型胶原蛋白组合物
CN116919977A (zh) mir-199a-3p在制备治疗骨关节炎的药物中的应用
CN117618320A (zh) 具有清洁皮肤功能的外泌体制剂及其制备方法
CN114681387A (zh) 一种动物来源外泌体组合物及其在皮肤创伤修复中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20220907

Address after: 8108, floor 1, building 3, No. 3, Yongchang North Road, Beijing Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing 102600 (Yizhuang group, high-end industrial area, Beijing Pilot Free Trade Zone)

Applicant after: Beijing Saier Regenerative Medicine Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 100000 622, floor 6, building 2, yard 78, Shuangying West Road, Changping District, Beijing

Applicant before: Beijing yuanshengda Biotechnology Development Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant