CN117327153B - 一种活性肽与植物外泌体抗衰化妆品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种活性肽与植物外泌体抗衰化妆品的制备方法。本发明首次提供了具有刺激成纤维细胞增殖活性的多肽，将活性多肽导入红石榴外泌体后，能够显著的促进成纤维细胞的增殖以及胶原蛋白的分泌，延缓皮肤衰老，促进伤口愈合。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品领域，特别涉及一种活性肽与植物外泌体抗衰化妆品的制备方法。
背景技术
植物外泌体狭义上是指由植物细胞分泌产生的指定尺寸范围的胞外囊泡(plantextracellular vesicle，plant EV)。植物外泌体的主要功能在于物质运输和信号传递两个方面。在植物的生长发育和免疫防御过程中，植物外泌体起到了重要的作用。作为植物抗感染的重要防线，植物外泌体在植物-病原体的互作中承担着转运抗菌蛋白、抗侵染siRNA的重要作用。植物外泌体的分泌过程受到病原体侵染刺激的调控，例如当用Golovinomycesorontii侵染拟南芥时，拟南芥能够分泌外泌体包裹多种参与应激反应的蛋白和siRNA以抵御病虫害。
皮肤是人体第一大器官，作为人体的保护屏障，具有防护外来机械损伤、防止病原微生物和化学性物质入侵机体的重要作用。皮肤损伤有外力导致的机械损伤和病理损伤，例如：日常生活中皮肤损伤，糖尿病患者并发症导致的慢性难愈合病理损伤。研究表明，在皮肤损伤修复过程中促进成纤维细胞增殖和胶原蛋白的分泌是促进皮肤损伤修复愈合的关键。虽然目前已有相关专利文献公开了采用外泌体和活性肽联合用于皮肤损伤修复的研究，但是其活性肽效果相对较差，并不能有效促进皮肤愈合，如何发现具备更优的活性肽是目前的技术难点，也是当下化妆品行业研发的重点方向之一。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种活性肽与植物外泌体抗衰化妆品的制备方法。所述活性肽能够促进成纤维细胞的增殖活性，并与植物外泌体联合应用可有效延缓皮肤衰老。
具体而言，本发明首先提供了一种具备抗衰老活性的多肽，该多肽可有效促进成纤维细胞的增殖。
优选地，所述多肽选自SEQ ID NO.1-10所示的氨基酸序列。
优选地，所述多肽选自如SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.9-10所示的氨基酸序列。
进一步优选地，所述多肽选自SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
另一方面，本发明还提供了一种导入了上述活性多肽的植物外泌体。优选地，所述外泌体是来源于红石榴外泌体。
另一方面，本发明还提供了一种导入了上述活性多肽的外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)根据将5×109的红石榴外泌体溶解在1mL含有50mM海藻糖的PBS缓冲液中；
2)将1mg的活性多肽加入到上述缓冲液中，混匀后转入电转杯中进行电转，电击条件为电压400V，电容175μF，41Tim电转杯进行电转；
3)随后用倒置离心超滤膜过滤，除去游离和非特异性结合的多肽。
进一步地，本发明还提供了一种活性肽与植物外泌体抗衰化妆品的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将导入活性肽的植物外泌体与抗氧化剂、稳定剂，乳化剂，可溶化剂，颜料及香料混合均匀即可。
进一步地，本发明还提供了一种抗衰化妆品，其特征在于，所述抗衰化妆品中包括导入活性多肽的植物外泌体。
进一步地，本发明还提供了所述活性肽在制备抗衰老化妆品中的用途，所述活性肽是通过导入植物外泌体形式发挥抗衰老活性。
优选地，所述化妆品中还包括其他常见辅料，如：抗氧化剂、稳定剂，乳化剂，可溶化剂，颜料及香料等。
本发明的优点如下：
本发明首次提供了具有刺激成纤维细胞增殖活性的多肽，将活性多肽导入植物外泌体后，能够显著的促进成纤维细胞的增殖以及胶原蛋白的分泌，延缓皮肤衰老，促进伤口愈合。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，并不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1植物外泌体的制备
以红石榴为例，采用超速离心法制备植物外泌体，所述方法包括如下步骤：将500mL 1×PBS缓冲液加入300g红石榴中，使用破碎机冰浴破碎20min，每破碎1min，停止2min，得到红石榴汁；将得到的红石榴汁于4℃，3000×g离心10min，得到上层液1；将上层液1于4℃，8000×g离心20min，得到上层液2；将上层液2于4℃，10000×g离心60min，得到上层液3，即为红石榴外泌体。
本发明所述方法制备得到的红石榴外泌体在透射电子显微镜下表现出典型的杯状结构，符合外泌体的形态学鉴定标准。粒径分析结果表明，大部分颗粒直径为50-100nm之间，平均粒径为80.56nm，可证明分离提取的微粒具备外泌体特性，说明了本发明所述方法制备外泌体的可行性。
实施例2活性多肽对成纤维细胞的增殖分析
发明人基于前期文库筛选试验，初步获得10条活性多肽，其序列分别为SEQ IDNO.1-10所示。采用MTT细胞增殖检测试剂盒(型号M1020，购自北京百奥创新科技有限公司)检测所述活性多肽本身对成纤维细胞HFF-1(货号ZB063，购自上海致备生物科技有限公司)的增殖影响。具体检测步骤可根据试剂盒说明书进行常规调整，其中，空白组是未添加活性肽的DMEM/F12完全培养基，实验组1-10分别对应添加有SEQ ID NO.1-10所示活性肽DMEM/F12完全培养基，对照组1和2分别是CN113876687A和CN113855619A中公开的活性肽，以上所有肽的使用浓度均为100μg/mL，每孔200μL，每组6次重复。
表1活性肽对成纤维细胞增殖分析
检测结果如表1所示，从活性肽的增殖试验中可知，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6具有明显促进成纤维细胞增殖活性，尤其是以SEQ ID NO.1的增殖活性为最优，其明显优于其他实验组的活性肽，且其促增殖效果明显优于对照组，差异显著，具有统计学意义(P＜0.05)。此外，相比于CN113876687A和CN113855619A中公开的活性肽而言，本发明中的采用的SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.9-10活性肽对成纤维细胞的增殖活性明显是由于对照组1和2，进一步证明本发明筛选的活性肽具备优越应用前景。
实施例3融合活性肽外泌体的制备
采用电转染方法，将本发明的活性肽与对照组活性肽分别转染至植物外泌体内，主要的具体方法步骤包括：首先根据将5×109的红石榴外泌体溶解在1mL含有50mM海藻糖的PBS缓冲液中；其次将1mg的活性肽加入到上述缓冲液中，混匀后转入电转杯中进行电转，电击条件为电压400V，电容175μF，41Tim电转杯进行电转。随后用倒置离心超滤膜过滤，除去游离和非特异性结合的多肽。通过280nm的紫外吸收情况测定多肽是否转染成功。
其中，空白对照含有50mM海藻糖的PBS缓冲液，不添加多肽作为对照；实验组1是转染SEQ ID NO.1所示的活性肽；对照组1和2分别是转染CN113876687A和CN113855619A中公开的活性肽。
测试结果如表2所示，实验组和对照组中经电穿孔转导后并洗脱去未导入到外泌体中的多肽后，在280nm的紫外吸收值达到0.250以上，高于空白组的紫外吸收值证明通过电穿孔转导多肽有效导入到外泌体。
表2活性肽转染试验分析
| 组别 | OD280nm |
| 空白组 | 0.051±0.009 |
| 实验组 | 0.254±0.015 |
| 对照组1 | 0.244±0.023 |
| 对照组2 | 0.250±0.016 |
实施例4融合活性肽外泌体对成纤维细胞胶原分泌的影响分析
采用MTT细胞增殖检测试剂盒(型号M1020，购自北京百奥创新科技有限公司)检测所述融合活性肽外泌体本身对成纤维细胞HFF-1(货号ZB063，购自上海致备生物科技有限公司)的增殖影响。具体检测步骤可根据试剂盒说明书进行常规调整，其中，空白组是DMEM/F12完全培养基；实验组1是未转染活性肽的红石榴外泌体处理组；实验组2是转染SEQ IDNO.1活性肽的红石榴外泌体处理组；对照组1和2分别是转染CN113876687A和CN113855619A中公开的活性肽的红石榴外泌体处理组，其中各处理组中的外泌体数量均保持在5×105个。
检测结果如下表3所示，从活性肽的增殖试验中可知，红石榴外泌体本身对成纤维细胞的增殖作用有限，并不能显著提升成纤维细胞的数量。而转染SEQ ID NO.1活性肽的红石榴外泌体处理组中，其能高效率促进成纤维细胞的增殖，相比于CN113876687A和CN113855619A中公开融合多肽外泌体而言，本发明中的采用转染SEQ ID NO.1活性肽的红石榴外泌体处理组对成纤维细胞的增殖活性明显优于对照组1和2，进一步证明本发明转染SEQ ID NO.1活性肽的红石榴外泌体具备优越应用前景。
表3融合活性肽外泌体对成纤维细胞增殖分析
| 组别 | OD值 |
| 空白组 | 0.215±0.024 |
| 实验组1 | 0.258±0.014 |
| 实验组2 | 0.987±0.045 |
| 对照组1 | 0.435±0.026 |
| 对照组2 | 0.427±0.034 |
实施例5融合活性肽外泌体对成纤维细胞胶原分泌的影响分析
对实施例4中的转染SEQ ID NO.1活性肽的红石榴外泌体处理组作进一步的分析，将所述转染SEQ ID NO.1活性肽的红石榴外泌体与成纤维细胞HFF-1进行共培养24h，收集细胞，通过ELISA试剂盒(货号EH7533/EH2866,购自武汉菲恩生物科技有限公司)检测I型和III型胶原分泌情况。结果如表4所示。
表4I型和III型胶原分泌
从表4的结果可以看出，采用本发明转染SEQ ID NO.1活性肽的红石榴外泌体可以高效率地促进成纤维细胞分泌I型和III型胶原，该效果明显优于对照组(P＜0.05)，差异显著，具有统计学意义。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1. 一种具备抗衰老活性的多肽，其特征在于，所述多肽是SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2.一种导入权利要求1所述多肽的植物外泌体，其特征在于，所述植物外泌体是来源于红石榴的外泌体。
3.如权利要求2所述植物外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）根据将5×109的植物外泌体溶解在1mL含有50mM海藻糖的PBS缓冲液中；
2）将1mg的权利要求1所述多肽加入到上述缓冲液中，混匀后转入电转杯中进行电转，电击条件为电压400V，电容175μF，41Tim电转杯进行电转；
3）随后用倒置离心超滤膜过滤，除去游离和非特异性结合的多肽。
4.一种抗衰化妆品，其特征在于，所述抗衰化妆品中包括权利要求2所述的植物外泌体。
5.一种多肽与红石榴外泌体抗衰化妆品的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求2所述导入权利要求1所述多肽的植物外泌体与抗氧化剂、稳定剂，乳化剂，颜料及香料混合均匀即可。
6.权利要求1所述多肽在制备抗衰老化妆品中的用途，所述活性肽是通过导入红石榴外泌体形式发挥抗衰老活性。
7.如权利要求4所述化妆品，其特征在于，所述化妆品中还包括抗氧化剂、稳定剂，乳化剂，颜料及香料。
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