CN109294969A - 一种胎盘组织冻干粉及其制备方法与在提高乳酸杆菌产量、活性和/或氧耐受中的应用 - Google Patents

一种胎盘组织冻干粉及其制备方法与在提高乳酸杆菌产量、活性和/或氧耐受中的应用 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种胎盘组织冻干粉及其制备方法与在提高乳酸杆菌产量、活性和/或氧耐受中的应用，本公开制备的胎盘组织冻干粉能显著提高乳酸杆菌生物量和氧耐受性。本公开的胎盘组织冻干粉的制备方法过程简单，操作方便，成本低廉。本公开的原料胎盘来源广、易于获得，养猪场、养牛场或养鹿场等都非常容易获得，价格低。

Description

一种胎盘组织冻干粉及其制备方法与在提高乳酸杆菌产量、 活性和/或氧耐受中的应用
技术领域
本公开属于生物医药领域，具体涉及一种胎盘组织冻干粉及其制备方法与在提高乳酸杆菌产量、活性和/或氧耐受中的应用。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
乳酸杆菌属微生物多是益生菌，包括罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、戊糖乳杆菌、发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和鼠李糖乳杆菌等。益生菌作为保健食品服用，需要菌体具有较强的活力，在菌种冷藏、运输及销售过程中会遇到各种各样的环境刺激，如氧气、低温和其他微生物等，都会导致菌体活力迅速下降，而在食用后经过人体消化道又会因为胃酸和胆汁等条件丧失大部分活力。因此，乳酸杆菌作为益生菌应用需要菌体具备较高的活力和对环境条件的耐受性。另外，乳酸杆菌属微生物多为厌氧发酵，它们对氧的耐受性较低，导致发酵成本高。目前乳酸杆菌的生产和储运成本昂贵且工艺复杂，限制了乳酸杆菌菌粉作为益生菌的推广和应用。
已有研究表明，乳酸杆菌属微生物通过有氧呼吸可以得到活力更强的的菌体，如果在振荡培养的同时，在培养体系中添加血红素可以提高乳酸杆菌的菌体活力，而对照组菌体无一能够保持长时间高活力，添加血红素也可提高植物乳杆菌、戊糖乳杆菌的生物量及活力。不过血红素价格昂贵，限制了工业应用，寻找廉价、方便且高效的来源非常迫切。
发明内容
针对背景技术，本公开提供一种胎盘组织冻干粉及其制备方法与在提高乳酸杆菌产量、活性和/或氧耐受中的应用。
本公开具体采用以下技术方案：
在本公开的第一个方面，提供一种胎盘组织在制备提高乳酸杆菌产量、活性和/或氧耐受的制剂中的应用。
在本公开的第二个方面，提供一种胎盘组织冻干粉，其通过以下方法制备得到：
将胎盘切成薄片进行真空冷冻干燥，真空冷冻干燥时先进行预冻，然后进行第一阶段冷冻干燥，再进行第二阶段干燥；
真空冷冻干燥结束后进行低温粉碎；
粉碎后进行灭菌。
在本公开的第三个方面，提供所述胎盘组织冻干粉在提高乳酸杆菌产量、活性和/或氧耐受中的应用。
在本公开的第四个方面，提供一种提高乳酸杆菌产量、活性和/或氧耐受的方法，该方法包括在培养乳酸杆菌的培养基中加入所述胎盘组织冻干粉的步骤。
在本公开的第五个方面，提供一种培养乳酸杆菌的方法，该方法包括在培养乳酸杆菌的培养基中加入所述胎盘组织冻干粉的步骤。
在本公开的第六个方面，提供采用上述方法制备得到的乳酸杆菌产品。
与本发明人知晓的相关技术相比，本公开其中的一个技术方案具有如下有益效果：
本公开制备的胎盘组织冻干粉能显著提高乳酸杆菌生物量和氧耐受性。
本公开的胎盘组织冻干粉的制备方法过程简单，操作方便，成本低廉。
本公开的原料胎盘来源广、易于获得，养猪场、养牛场或养鹿场等都非常容易获得，价格低。
本公开充分利用胎盘组织冻干粉作为添加剂用于乳酸杆菌的培养，有效的提高了菌体活力和单位时间产量，并降低了生产成本。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中缺乏一种廉价、方便且高效的能够提高乳酸杆菌产量、活性和/或氧耐受的产品，为了解决如上的技术问题，本公开提出了一种胎盘组织在制备提高乳酸杆菌产量、活性和/或氧耐受的制剂中的应用。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述胎盘组织来自动物；进一步，所述胎盘组织来自猪、羊、牛或鹿等动物其中的一种。
进一步的，在试验过程中，发明人研究了多种动物的胎盘种类，基于胶原含量的原因，本公开发现牛来源胎盘的效果较佳。
在本公开的一个典型的实施方式中，提供一种胎盘组织冻干粉，其通过以下方法制备得到：
将胎盘切成薄片进行真空冷冻干燥，真空冷冻干燥时先进行预冻，然后进行第一阶段冷冻干燥，再进行第二阶段冷冻干燥；
真空冷冻干燥结束后进行低温粉碎；
粉碎后进行臭氧灭菌。臭氧熏蒸是能够保持生物大分子活性，并且在车间能够利用臭氧发生器实现的最可行的方法，成本低，灭菌效果好。
在本公开的一个或一些具体的实施方式中，将胎盘切成厚度0.5～1.5cm的薄片。过厚的话冻干过程中水分不容易出来，太薄的话会产生大量切片占据冻干机托盘。
由于胎盘韧性很足以及含有大量的水分，经本发明人试验验证，若是先用旋转刀头高速粉碎的话，这个过程无法控制其产热以及发生氧化反应，影响大部分蛋白质物质等其他活性物质的生物学活性，因而无法有效提高乳酸杆菌产量、活性和/或氧耐受性，而冷冻干燥后，胎盘会变得很酥，轻轻一碰就成粉了，无须高速刀头产热。
在本公开的一个或一些具体的实施方式中，预冻温度为-45～-40℃，时间为2～3h。预冻让胎盘组织中的蛋白质和水等全部成为固态。
在本公开的一个或一些具体的实施方式中，第一阶段冷冻干燥温度为-25℃至-45℃，真空度为0.12～0.18mbar,冷阱温度为-50～-45℃，时间为8～10h。隔板温度在一开始设置的比较低，因为胎盘组织在开始冻干的初期阶段容易温度升高导致解冻，从而冻干失败；而这个时候把隔板温度设置较低，可有效避免胎盘解冻，若是更低的话，会导致胎盘组织中的蛋白质聚焦、变性等损失严重。冻干过程中，真空度过低，会导致热传导率下降，冻干效率降低，所以一开始真空度不易设置过低。冻干机冷阱温度越低，冻干效率越高；时间过长浪费电费能源，过短水分残留过多。
在本公开的一个或一些具体的实施方式中，第二阶段干燥温度为15-30℃，真空度0.005-0.01mbar，时间为0.5～3h。冻干过程后端，已无胎盘解冻之忧，此时调高隔板温度，有利于胎盘组织中水分进加快升华，缩短冻干时间，此时可适当降低真空度，从而加快最后的水分从胎盘组织中挥发。
在本公开的一个或一些具体的实施方式中，真空冷冻干燥结束后，此时产品水分含量小于2.5％。这有利于胎盘组织冻干粉的长期保存。
在本公开的一个或一些具体的实施方式中，低温粉碎温度为4～10℃，转速为4000～5000转/min，时间为10～15min。
进一步的，低温粉碎后过50～100筛，未过筛的颗粒再次进行粉碎。
在本公开的一个或一些具体的实施方式中，在0.5～5PPM的臭氧浓度中，灭菌20～50min。细菌灭菌率平均为95.2％，霉菌灭菌率平均为95.7％。其中细菌灭菌率最高为99.9％，最低灭菌率为92.8％；霉菌灭菌率最高为100％，最低为92.8％。
进一步，臭氧浓度为1PPM，灭菌时间为30min。
胎盘成分复杂，里面含有有利于微生物生长的多种营养物质如氨基酸和维生素，还含有活性蛋白质例如胶原蛋白I、II、III、VI、XII型胶原蛋白等以及血红素。其中，益生菌乳杆菌广泛表达胶原结合蛋白基因CNB。对胶原蛋白的结合与利用，不但有利于提高乳杆菌的代谢活力，也有利于乳杆菌属益生菌与肠上皮细胞的粘附，增加肠内定植能力。
本公开的胎盘组织冻干粉制备方法首先进行切片，然后进行真空冷冻干燥，再进行低温粉碎，最后进行臭氧灭菌，从最大程度的保留能够提高乳酸杆菌产量、活性和/或氧耐受的活性成分，降低活性成分的损失。经过试验验证，本公开制备的胎盘冻干粉能显著提高乳酸杆菌生物量和氧耐受性。
另外，本公开的胎盘组织冻干粉遇水后溶解性好，能够有效的将活性成分溶于水中，以供乳酸杆菌利用。
在本公开的又一个典型的实施方式中，提供所述胎盘组织冻干粉在提高乳酸杆菌产量、活性和/或氧耐受中的应用。
在本公开的一个或一些具体的实施方式中，所述乳酸杆菌为罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌，植物乳杆菌、干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、戊糖乳杆菌、发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌中的一种或多种。来源不限制，均可通过市售获得。
在本公开的再一个典型的实施方式中，提供一种提高乳酸杆菌产量、活性和/或氧耐受的方法，该方法包括在培养乳酸杆菌的培养基中加入所述胎盘组织冻干粉的步骤。
在本公开的再一个典型的实施方式中，提供一种培养乳酸杆菌的方法，该方法包括在培养乳酸杆菌的培养基中加入所述胎盘组织冻干粉的步骤。
在本公开的一个或一些具体的实施方式中，具体方法包括：在无菌条件下，取活化好的乳酸杆菌菌液，以体积比为1％～5％的接种量接种到加入0.5～3(w/w)％胎盘组织冻干粉的发酵培养基中，在温度36～38℃、转速100～300rpm条件下培养12～48小时，其间，待检测生物量不再增加时，发酵结束，分离菌体。
进一步的，装液量50～300ml/500ml三角瓶。
更进一步的，装液量100～200ml/500ml三角瓶。
进一步的，发酵培养基配方为：1升水中含：酪蛋白胨5.0克，酵母提取液10.0克，葡萄糖20.0克，乙酸钠5.0克，柠檬酸二胺2.0克，磷酸氢二钾2.0克，七水硫酸镁0.2克，七水硫酸锰0.05克，吐温80 1.0克，115℃灭菌20分钟。
进一步的，发酵培养基的pH为6.0～7.0。
进一步的，摇床转速为100～150rpm。
进一步的，加入1～2(w/w)％胎盘组织冻干粉，是指100g发酵培养基中加入1～2g胎盘组织冻干粉。
进一步的，乳酸杆菌菌液的活化方法是：
(a)平板培养：将乳酸杆菌菌株划线到含有质量体积比为1.5～1.8％琼脂MRS培养基平板上，36～38℃培养22～26小时；
(b)种子培养：无菌条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到MRS培养基中，36～38℃静置培养10～14小时，得到乳酸杆菌活化菌液。
更进一步的，所述MRS培养基配方为：1升水中含：酪蛋白胨10克，牛肉浸取物10.0克，酵母提取液5.0克，葡萄糖5.0克，乙酸钠5.0克，柠檬酸二胺2.0克，磷酸氢二钾2.0克，七水硫酸镁0.2克，七水硫酸锰0.05克，吐温80 1.0克，115℃灭菌20分钟。
进一步的，生物量的检测方法是：样品进行设定的稀释后，采用分光光度计测定600nm处吸光值。
在本公开的再一个典型的实施方式中，提供采用上述方法制备得到的乳酸杆菌产品。该产品中的乳酸杆菌活力高，益生效果好。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
本公开中氧耐受性的测定：(a)对比添加胎盘组织冻干粉添加剂和未添加胎盘组织冻干粉添加剂的乳酸杆菌在摇瓶中的生物量；(b)利用稀释涂平板法计算活菌数，进而对比添加胎盘组织冻干粉添加剂和未添加胎盘组织冻干粉添加剂的乳酸杆菌在4℃保藏中的存活率。
实施例1
一种胎盘组织冻干粉添加剂，其通过以下方法制备得到：
(1)将胎盘切成厚度0.5～1.5cm的薄片，置于真空冷冻干燥机隔板上在-40℃预冻3h，隔板设置温度为-35℃，抽真空度达到0.161mbar，冷阱温度设置为-50℃，持续冷冻干燥9h，然后加热隔板温度调至25℃，再持续干燥1h，真空度0.007mbar。最终产品水分含量小于2.5％，即进行下一步粉碎处理；
(2)将冻干后的产品放入带冷却夹套的粉碎机，在通入4～10℃冷却水的情况下，在4000转/分的条件下，粉碎15分钟，通过高速粉化制成胎盘冻干粉，粉碎完成后，使用50～100目的分样筛进行筛分，未过筛的颗粒再次进行粉碎。
(3)将胎盘冻干粉置于臭氧灭菌机中，在1PPM的臭氧浓度中，灭菌30min。
其中，所述胎盘取自牛。
实施例2
一种胎盘组织冻干粉添加剂，其通过以下方法制备得到：
(1)将胎盘切成厚度0.5～1.5cm的薄片，置于真空冷冻干燥机隔板上在-45℃预冻3h，隔板设置温度为-30℃，抽真空度达到0.12mbar，冷阱温度设置为-50℃，持续冷冻干燥9h，然后加热隔板温度调至15℃，再持续干燥1.5h，真空度0.005mbar。最终产品水分含量小于2.5％，即进行下一步粉碎处理；
(2)将冻干后的产品放入带冷却夹套的粉碎机，在通入4～10℃冷却水的情况下，在4500转/分的条件下，粉碎15分钟，通过高速粉化制成胎盘冻干粉，粉碎完成后，使用50～100目的分样筛进行筛分，未过筛的颗粒再次进行粉碎。
(3)将胎盘冻干粉置于臭氧灭菌机中，在1PPM的臭氧浓度中，灭菌30min。
其中，所述胎盘取自牛。
实施例3
一种胎盘组织冻干粉添加剂，其通过以下方法制备得到：
(1)将胎盘切成厚度0.5～1.5cm的薄片，置于真空冷冻干燥机隔板上在-40℃预冻3h，隔板设置温度为-45℃，抽真空度达到0.18mbar，冷阱温度设置为-50℃，持续冷冻干燥8h，然后加热隔板温度调至30℃，再持续干燥2h，真空度0.01mbar。最终产品水分含量小于2.5％，即进行下一步粉碎处理；
(2)将冻干后的产品放入带冷却夹套的粉碎机，在通入4～10℃冷却水的情况下，在5000转/分的条件下，粉碎15分钟，通过高速粉化制成胎盘冻干粉，粉碎完成后，使用50～100目的分样筛进行筛分，未过筛的颗粒再次进行粉碎。
(3)将胎盘冻干粉置于臭氧灭菌机中，在1PPM的臭氧浓度中，灭菌30min。
其中，所述胎盘取自牛。
实施例4
利用实施例1中制备的胎盘组织冻干粉添加剂提高植物乳杆菌生物量和氧耐受性
(1)平板培养：将植物乳杆菌CICC20022划线到含有质量体积比为1.8％(100mL培养基含有1.8g琼脂)琼脂MRS培养基平板上，37±1℃培养24小时。
(2)种子培养：无菌条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到MRS培养基中，37±1℃静置培养12小时，得到植物乳杆菌CICC20022活化菌液；
(3)摇瓶：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的菌液以体积比2％的接种量，接种到200毫升含有1(w/w)％胎盘组织冻干粉添加剂的发酵培养基中，37±1℃摇床在转速100rpm条件下培养14小时，生物量(OD620nm)达到12；而未添加胎盘组织冻干粉添加剂组生物量(OD620nm)仅为5。菌体在4℃保存10天后，添加胎盘组织冻干粉添加剂组，其存活率为87％，而未添加组仅为7.5％。可以看出，与未添加组相比，添加胎盘组织冻干粉添加剂后，其生物量和氧耐受性得到了显著提高，而未添加的植物乳杆菌其氧耐受性低，生长繁殖慢，导致生物量也比较低。
本发明人还按照以上方法添加了不同质量分数的牛血浆冻干粉、胶原蛋白以及两者的混合物等作为比较，植物乳杆菌CICC20022发酵后，其生物量和氧耐受性均远不如添加胎盘组织冻干粉添加剂的效果更加突出。
其中，上述步骤中所述的MRS培养基配方为：1升蒸馏水中含：酪蛋白胨10克，牛肉浸取物10.0克，酵母提取液5.0克，葡萄糖5.0克，乙酸钠5.0克，柠檬酸二胺2.0克，磷酸氢二钾2.0克，七水硫酸镁0.2克，七水硫酸锰0.05克，吐温80 1.0克，115℃灭菌20分钟。
上述步骤中所述的发酵培养基配方为：1升蒸馏水中含：酪蛋白胨5.0克，酵母提取液10.0克，葡萄糖20.0克，乙酸钠5.0克，柠檬酸二胺2.0克，磷酸氢二钾2.0克，七水硫酸镁0.2克，七水硫酸锰0.05克，吐温80 1.0克，115℃灭菌20分钟。
实施例5
利用实施例1中制备的胎盘组织冻干粉添加剂提高罗伊氏乳杆菌生物量和氧耐受性
(1)平板培养：将罗伊氏乳杆菌CICC 6125划线到含有质量体积比为1.8％琼脂MRS培养基平板上，37±1℃培养24小时。
(2)种子培养：无菌条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到MRS培养基中，37±1℃静置培养12小时，得到罗伊氏乳杆菌CICC 6125活化菌液；
(3)摇瓶：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的菌液以体积比2％的接种量，接种到200毫升含有1(w/w)％胎盘组织冻干粉添加剂的发酵培养基中，37±1℃摇床在转速100rpm条件下培养12小时，生物量(OD620nm)达到11；而未添加胎盘冻干粉添加剂组生物量(OD620nm)仅为3.8。菌体在4℃保存10天后，添加胎盘组织冻干粉添加剂组，其存活率为91％，而未添加组仅为6.2％。可以看出，与未添加组相比，添加胎盘组织冻干粉添加剂后，其生物量和氧耐受性得到了显著提高，而未添加的罗伊氏乳杆菌其氧耐受性低，生长繁殖慢，导致生物量也比较低。
本发明人还按照以上方法添加了不同质量分数的牛血浆冻干粉、胶原蛋白以及两者的混合物等作为比较，罗伊氏乳杆菌CICC 6125发酵后，其生物量和氧耐受性均远不如添加胎盘组织冻干粉添加剂的效果更加突出。
其中，上述步骤中所述的MRS培养基配方为：1升蒸馏水中含：酪蛋白胨10克，牛肉浸取物10.0克，酵母提取液5.0克，葡萄糖5.0克，乙酸钠5.0克，柠檬酸二胺2.0克，磷酸氢二钾2.0克，七水硫酸镁0.2克，七水硫酸锰0.05克，吐温80 1.0克，115℃灭菌20分钟。
上述步骤中所述的发酵培养基配方为：1升蒸馏水中含：酪蛋白胨5.0克，酵母提取液10.0克，葡萄糖20.0克，乙酸钠5.0克，柠檬酸二胺2.0克，磷酸氢二钾2.0克，七水硫酸镁0.2克，七水硫酸锰0.05克，吐温80 1.0克，115℃灭菌20分钟。
实施例6
利用实施例2中制备的胎盘组织冻干粉添加剂提高鼠李糖乳杆菌生物量和氧耐受性
(1)平板培养：将鼠李糖乳杆菌CICC6141划线到含有质量体积比为1.8％琼脂MRS培养基平板上，37±1℃培养24小时。
(2)种子培养：无菌条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到MRS培养基中，37±1℃静置培养12小时，得到鼠李糖乳杆菌CICC6141活化菌液；
(3)摇瓶：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的菌液以体积比2％的接种量，接种到200毫升含有1(w/w)％胎盘组织冻干粉添加剂的发酵培养基中，37±1℃摇床在转速100rpm条件下培养16小时，生物量(OD620nm)达到13.3；而未添加胎盘组织冻干粉添加剂组生物量(OD620nm)仅为7。菌体在4℃保存10天后，添加胎盘组织冻干粉添加剂组，其存活率为92.4％，而未添加组仅为14.5％。可以看出，与未添加组相比，添加胎盘组织冻干粉添加剂后，其生物量和氧耐受性得到了显著提高，而未添加的鼠李糖乳杆菌其氧耐受性低，生长繁殖慢，导致生物量也比较低。
本发明人还按照以上方法添加了不同质量分数的牛血浆冻干粉、胶原蛋白以及两者的混合物等作为比较，鼠李糖乳杆菌CICC6141发酵后，其生物量和氧耐受性均远不如添加胎盘组织冻干粉添加剂的效果更加突出。
其中，上述步骤中所述的MRS培养基配方为：1升蒸馏水中含：酪蛋白胨10克，牛肉浸取物10.0克，酵母提取液5.0克，葡萄糖5.0克，乙酸钠5.0克，柠檬酸二胺2.0克，磷酸氢二钾2.0克，七水硫酸镁0.2克，七水硫酸锰0.05克，吐温80 1.0克，115℃灭菌20分钟。
上述步骤中所述的发酵培养基配方为：1升蒸馏水中含：酪蛋白胨5.0克，酵母提取液10.0克，葡萄糖20.0克，乙酸钠5.0克，柠檬酸二胺2.0克，磷酸氢二钾2.0克，七水硫酸镁0.2克，七水硫酸锰0.05克，吐温80 1.0克，115℃灭菌20分钟。
实施例7
利用实施例3中制备的胎盘组织冻干粉添加剂提高发酵杆菌生物量和氧耐受性
(1)平板培养：将发酵乳杆菌CCICC 21829划线到含有质量体积比为1.8％琼脂MRS培养基平板上，37±1℃培养24小时。
(2)种子培养：无菌条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到MRS培养基中，37±1℃静置培养10小时，得到发酵乳杆菌CCICC 21829活化菌液；
(3)摇瓶：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的菌液以体积比2％的接种量，接种到200毫升含有1(w/w)％胎盘组织冻干粉添加剂的发酵培养基中，37±1℃摇床在转速100rpm条件下培养14小时，生物量(OD620nm)达到14；而未添加胎盘组织冻干粉添加剂组生物量(OD620nm)仅为5.5。菌体在4℃保存10天后，添加胎盘组织冻干粉添加剂组，其存活率为93.2％，而未添加组仅为9.7％。可以看出，与未添加组相比，添加胎盘组织冻干粉添加剂后，其生物量和氧耐受性得到了显著提高，而未添加的发酵杆菌其氧耐受性低，生长繁殖慢，导致生物量也比较低。
本发明人还按照以上方法添加了不同质量分数的牛血浆冻干粉、胶原蛋白以及两者的混合物等作为比较，发酵乳杆菌CCICC 21829发酵后，其生物量和氧耐受性均远不如添加胎盘组织冻干粉添加剂的效果更加突出。
其中，上述步骤中所述的MRS培养基配方为：1升蒸馏水中含：酪蛋白胨10克，牛肉浸取物10.0克，酵母提取液5.0克，葡萄糖5.0克，乙酸钠5.0克，柠檬酸二胺2.0克，磷酸氢二钾2.0克，七水硫酸镁0.2克，七水硫酸锰0.05克，吐温80 1.0克，115℃灭菌20分钟。
上述步骤中所述的发酵培养基配方为：1升蒸馏水中含：酪蛋白胨5.0克，酵母提取液10.0克，葡萄糖20.0克，乙酸钠5.0克，柠檬酸二胺2.0克，磷酸氢二钾2.0克，七水硫酸镁0.2克，七水硫酸锰0.05克，吐温80 1.0克，115℃灭菌20分钟。
上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种胎盘组织在制备提高乳酸杆菌产量、活性和/或氧耐受的制剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征是：所述胎盘组织来自动物；
进一步，来自牛、猪、羊或鹿的胎盘。
3.一种胎盘组织冻干粉，其特征是，该胎盘组织冻干粉是通过以下方法制备得到：
将胎盘切成薄片进行真空冷冻干燥，真空冷冻干燥时先进行预冻，然后进行第一阶段冷冻干燥，再进行第二阶段干燥；
真空冷冻干燥结束后进行低温粉碎；
粉碎后进行灭菌。
4.如权利要求3所述的胎盘组织冻干粉，其特征是：将胎盘切成厚度0.5～1.5cm的薄片；
进一步的，预冻温度为-45～-40℃，时间为2～3h；
进一步的，第一阶段冷冻干燥温度为-25℃至-45℃，真空度为0.12～0.18mbar,冷阱温度为-50～-45℃，时间为8～10h；
进一步的，第二阶段干燥温度为15-30℃，真空度0.005-0.01mbar，时间为0.5～3h；
进一步的，真空冷冻干燥结束后，此时产品水分含量小于2.5％。
5.如权利要求3所述的胎盘组织冻干粉，其特征是：低温粉碎温度为4～10℃，转速为4000～5000转/min，时间为10～15min；
进一步的，低温粉碎后过50～100筛，未过筛的颗粒再次进行粉碎；
在0.5～5PPM的臭氧浓度中，灭菌20～50min；
进一步，臭氧浓度为1PPM，灭菌时间为30min。
6.权利要求3～5中任一项所述的胎盘组织冻干粉在提高乳酸杆菌产量、活性和/或氧耐受中的应用，其特征是：
进一步的，所述乳酸杆菌为罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌，植物乳杆菌、干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、戊糖乳杆菌、发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌中的一种或多种。
7.一种提高乳酸杆菌产量、活性和/或氧耐受的方法，其特征是，该方法包括在培养乳酸杆菌的培养基中加入权利要求3～5中任一项所述胎盘组织冻干粉的步骤。
8.一种培养乳酸杆菌的方法，其特征是，该方法包括在培养乳酸杆菌的培养基中加入权利要求3～5中任一项所述胎盘组织冻干粉的步骤。
9.如权利要求8所述的方法，其特征是：具体方法包括：在无菌条件下，取活化好的乳酸杆菌菌液，以体积比为1％～5％的接种量接种到加入0.5～3(w/w)％胎盘组织冻干粉的发酵培养基中，在温度36～38℃、转速100～300rpm条件下培养12～48小时，其间，待检测生物量不再增加时，发酵结束，分离菌体；
进一步的，装液量50～300ml/500ml三角瓶；
更进一步的，装液量100～200ml/500ml三角瓶；
进一步的，发酵培养基配方为：1升水中含：酪蛋白胨5.0克，酵母提取液10.0克，葡萄糖20.0克，乙酸钠5.0克，柠檬酸二胺2.0克，磷酸氢二钾2.0克，七水硫酸镁0.2克，七水硫酸锰0.05克，吐温80 1.0克，115℃灭菌20分钟；
进一步的，发酵培养基的pH为6.0～7.0；
进一步的，摇床转速为100～150rpm；
进一步的，加入1～2(w/w)％胎盘组织冻干粉；
进一步的，乳酸杆菌菌液的活化方法是：
(a)平板培养：将乳酸杆菌菌株划线到含有质量体积比为1.5～1.8％琼脂MRS培养基平板上，36～38℃培养22～26小时；
(b)种子培养：无菌条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到MRS培养基中，36～38℃静置培养10～14小时，得到乳酸杆菌活化菌液；
更进一步的，所述MRS培养基配方为：1升水中含：酪蛋白胨10克，牛肉浸取物10.0克，酵母提取液5.0克，葡萄糖5.0克，乙酸钠5.0克，柠檬酸二胺2.0克，磷酸氢二钾2.0克，七水硫酸镁0.2克，七水硫酸锰0.05克，吐温80 1.0克，115℃灭菌20分钟；
进一步的，生物量的检测方法是：样品进行设定的稀释后，采用分光光度计测定600nm处吸光值。
10.采用权利要求7、8或9中所述的方法制备得到的乳酸杆菌产品。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1142949A (zh) * 1995-08-15 1997-02-19 内蒙古众康实业有限责任公司 羊胎盘冻干粉
CN101397541A (zh) * 2007-09-29 2009-04-01 上海泓宝绿色水产科技发展有限公司 含有天然促长因子的微生态制剂促长菌及其制备方法
CN101396065A (zh) * 2007-09-29 2009-04-01 上海泓宝绿色水产科技发展有限公司 一种以牛胎盘蛋白为天然营养因子的微生态制剂及其制备方法
CN101618048A (zh) * 2008-06-30 2010-01-06 瑞士金本洋行（香港）有限公司 一种羊胎盘、胎羊干制品的制备方法
CN102191206A (zh) * 2011-04-22 2011-09-21 河北科技大学 一种以牛胎盘酶解物为活性氮源制备大肠杆菌培养基的方法
CN102807959A (zh) * 2011-05-30 2012-12-05 绍兴市古煌酿酒有限公司 一种发酵乳杆菌La-Y1高密度培养的方法及其应用
CN104673690A (zh) * 2013-11-28 2015-06-03 杨树才 乳酸菌冻干粉的生产工艺
CN108309921A (zh) * 2017-12-21 2018-07-24 云南舜喜再生医学工程有限公司 一种富含细胞因子的冻干粉制备方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1142949A (zh) * 1995-08-15 1997-02-19 内蒙古众康实业有限责任公司 羊胎盘冻干粉
CN101397541A (zh) * 2007-09-29 2009-04-01 上海泓宝绿色水产科技发展有限公司 含有天然促长因子的微生态制剂促长菌及其制备方法
CN101396065A (zh) * 2007-09-29 2009-04-01 上海泓宝绿色水产科技发展有限公司 一种以牛胎盘蛋白为天然营养因子的微生态制剂及其制备方法
CN101618048A (zh) * 2008-06-30 2010-01-06 瑞士金本洋行（香港）有限公司 一种羊胎盘、胎羊干制品的制备方法
CN102191206A (zh) * 2011-04-22 2011-09-21 河北科技大学 一种以牛胎盘酶解物为活性氮源制备大肠杆菌培养基的方法
CN102807959A (zh) * 2011-05-30 2012-12-05 绍兴市古煌酿酒有限公司 一种发酵乳杆菌La-Y1高密度培养的方法及其应用
CN104673690A (zh) * 2013-11-28 2015-06-03 杨树才 乳酸菌冻干粉的生产工艺
CN108309921A (zh) * 2017-12-21 2018-07-24 云南舜喜再生医学工程有限公司 一种富含细胞因子的冻干粉制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZENDER R, BORTH R. ET AL: ""[On a thermolabile growth factor of Lactobacillus casei in the human placenta"", 《HELV PHYSIOL PHARMACOL ACTA》 *
沈棚等: "牛胎盘废弃物制备食品微生物培养基", 《食品研究与开发》 *

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