CN112957273B - 一种美容用干细胞因子培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种美容用干细胞因子培养方法。该方法包括以下步骤：(1)将间充质干细胞置于无血清培养基中，传代培养至4代后，用生理盐水冲洗，然后加入消化液，消化计数；(2)当步骤(1)所得细胞融合度达到80～90％时，更换为诱导培养基，继续培养；(3)过滤步骤(2)所得诱导培养基3～4次，将滤液合并后，浓缩为原体积的1/10～1/5；然后加入含有枸橼酸钠的生理盐水补足至原体积后，再次过滤，收集滤液并将其浓缩为原体积的1/20～1/10；(4)采用截留分子量为8KD～14KD的滤膜对步骤(3)所得产物进行过滤，收集得到干细胞因子浓缩液。本发明能够有效的提升制备得到的浓缩液中的细胞因子的含量。

Description

一种美容用干细胞因子培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种美容用干细胞因子培养方法。
背景技术
近年来，随着对间充质干细胞研究的不断深入，其分泌因子已成为研究者们的热点。间充质干细胞可以分泌多种具有生物活性的细胞因子，这些细胞因子可有效地调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。
干细胞在美容中的应用，最早是干细胞在整形外科中的运用，它是目前研究较多的一种干细胞美容技术。而在整形外科中应用得较多的干细胞种类主要亦是人脐带间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞等。
但目前干细胞作用机理尚不完全明确，一般认为主要通过以下机制：1、旁分泌作用分泌细胞营养因子、细胞生长因子、抗凋亡因子等。2、代替或修复死亡或受损的细胞。3、细胞直接接触，调控细胞的功能。当前，越来越多的研究表明，间充质干细胞的旁分泌效应在其发挥治疗效果中其主要作用。间充质干细胞通过分泌各类细胞因子对邻近细胞产生作用，从而发挥其功效。研究表明，间充质干细胞可分泌多种细胞因子，如VEGF血管内皮生长因子、bFGF碱性成纤维细胞生长因子、NGF神经生长因子、HGF肝细胞生长因子、IGF-1胰岛素样生长因子1、BDNF脑源性神经营养因子、GDNF胶质源性神经营养因子、IL-6白细胞介素6、IL-11白细胞介素11等。而目前方法培育得到的干细胞活率、分化效率低，细胞因子产量低。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种美容用干细胞因子培养方法，可高效稳定的制取干细胞活性因子。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种美容用干细胞因子培养方法，包括以下步骤：
(1)将间充质干细胞置于无血清培养基中，于35～37℃，5～10％CO2环境中培养7～10天，进行传代培养，传代至4代后，用生理盐水冲洗1～2次，然后加入消化液，消化计数；
(2)当步骤(1)所得细胞融合度达到80～90％时，更换为诱导培养基，继续于35～37℃，5～10％CO2环境中培养48～72h；
(3)过滤步骤(2)所得诱导培养基3～4次，将滤液合并后，浓缩为原体积的1/10～1/5；然后加入含有枸橼酸钠的生理盐水补足至原体积后，静置1～2h，再次过滤，收集滤液并将其浓缩为原体积的1/20～1/10；
(4)采用截留分子量为8KD～14KD的滤膜对步骤(3)所得产物进行过滤，收集得到干细胞因子浓缩液，再加入冻干保护剂即可。
进一步地，步骤(1)中的传代培养的具体过程为：
S1.含有间充质干细胞的组织块装于培养瓶中，然后加入无血清培养基，于35～37℃，5～10％CO2的培养箱只能够培养，培养7～10天；
S2.当细胞融合度达到70～80％时，舍弃无血清培养基，用生理盐水冲洗瓶壁，然后加入0.25％胰酶均匀浸润细胞贴壁面，室温孵育5～10min，待细胞变圆后快速震荡并吹打细胞贴壁面，得到细胞悬液，离心弃上清，然后以6000～8000个/cm2的细胞密度继续进行传代培养，直至细胞传代至4代。
进一步地，S1中培养条件为：37℃，5％CO2。
进一步地，步骤(2)中细胞融合度达到85％时，更换诱导培养基。
进一步地，诱导培养基包括：终浓度为0.5～2mmol/L的低氧模拟物、5～10mmol/L的枸橼酸三钠、5～10mmol/L的蛋氨酸、10～20mmol/L的谷氨酰胺，以及DMEM基础培养基。
进一步地，诱导培养基中低氧模拟物的终浓度为1.8mmol/L、枸橼酸三钠的终浓度为6.4mmol/L、蛋氨酸的终浓度为7.2mmol/L、谷氨酰胺的终浓度为14.6mmol/L。
进一步地，低氧模拟物为氯化钴或去铁胺。
进一步地，步骤(3)生理盐水中枸橼酸钠的浓度为0.01～0.05mmol/L。
进一步地，冻干保护剂的添加量为浓缩液体积的0.1～0.5％。
进一步地，冻干保护剂为海藻糖、甘露醇或黄体酮中的至少一种。
本发明的有益效果：
1、本申请在传代培养后采用特定的诱导培养基继续进行培养，诱导培养基中使用的枸橼酸三钠和蛋氨酸可有效的促进细胞生长，提升细胞的增殖效率；而低氧模拟物则是能够模拟低氧环境，改变培养环境，刺激干细胞分泌细胞因子，此外，培养基中添加的谷氨酰胺、枸橼酸三钠和蛋氨酸一同配合，能够进一步的诱导间充质干细胞分泌细胞因子，提升细胞因子的分泌量。
2、本申请使用含有枸橼酸钠的生理盐水进行纯化，能够有效的防止细胞因子在纯化过程中失活，同时，再添加了枸橼酸钠以后，能够有效的降低浓缩纯化过程中细胞因子的损失量。
3、本申请采用截留分子量为8KD～14KD的滤膜进行超滤，能够有效的过滤掉糖类等大量的杂质，且能够有效的降低细胞因子在超滤过程中的损失量，这样即可保证制备得到的产物中细胞因子的含量。
4、本申请使用的诱导培养基中基本上不含有大分子蛋白成分，便于后续的产物分离，也不会导致产物受到蛋白带来的污染或影响。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1
一种美容用干细胞因子培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)含有间充质干细胞的组织块装于培养瓶中，然后加入无血清培养基，于37℃，5％CO2的培养箱只能够培养，培养7天；
(2)当细胞融合度达到70％时，舍弃无血清培养基，用生理盐水冲洗瓶壁，然后加入0.25％胰酶均匀浸润细胞贴壁面，室温孵育5min，待细胞变圆后快速震荡并吹打细胞贴壁面，得到细胞悬液，离心弃上清，然后以6000个/cm2的细胞密度继续进行传代培养，直至细胞传代至4代；
(3)当步骤(2)所得细胞融合度达到80％时，更换为诱导培养基，继续于37℃，5％CO2环境中培养72h；其中，诱导培养基包括：终浓度为0.5mmol/L的氯化钴、5mmol/L的枸橼酸三钠、5mmol/L的蛋氨酸、10mmol/L的谷氨酰胺，以及DMEM基础培养基；
(4)过滤步骤(3)所得诱导培养基4次，将滤液合并后，浓缩为原体积的1/10；然后加入含有枸橼酸钠的生理盐水补足至原体积后，静置2h，再次过滤，收集滤液并将其浓缩为原体积的1/15；
(5)采用截留分子量为8KD的滤膜对步骤(3)所得产物进行过滤，收集得到干细胞因子浓缩液，再加入海藻糖冻干保护剂即可。
实施例2
一种美容用干细胞因子培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)含有间充质干细胞的组织块装于培养瓶中，然后加入无血清培养基，于37℃，5％CO2的培养箱只能够培养，培养7天；
(2)当细胞融合度达到80％时，舍弃无血清培养基，用生理盐水冲洗瓶壁，然后加入0.25％胰酶均匀浸润细胞贴壁面，室温孵育5min，待细胞变圆后快速震荡并吹打细胞贴壁面，得到细胞悬液，离心弃上清，然后以6000个/cm2的细胞密度继续进行传代培养，直至细胞传代至4代；
(3)当步骤(2)所得细胞融合度达到85％时，更换为诱导培养基，继续于37℃，5％CO2环境中培养72h；其中，诱导培养基包括：终浓度为1.8mmol/L的低氧模拟物、6.4mmol/L的枸橼酸三钠、7.2mmol/L的蛋氨酸、14.6mmol/L的谷氨酰胺，以及DMEM基础培养基；
(4)过滤步骤(3)所得诱导培养基3次，将滤液合并后，浓缩为原体积的1/8；然后加入含有枸橼酸钠的生理盐水补足至原体积后，静置2h，再次过滤，收集滤液并将其浓缩为原体积的1/20；
(5)采用截留分子量为10KD的滤膜对步骤(3)所得产物进行过滤，收集得到干细胞因子浓缩液，再加入海藻糖冻干保护剂即可。
实施例3
一种美容用干细胞因子培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)含有间充质干细胞的组织块装于培养瓶中，然后加入无血清培养基，于37℃，5％CO2的培养箱只能够培养，培养7天；
(2)当细胞融合度达到80％时，舍弃无血清培养基，用生理盐水冲洗瓶壁，然后加入0.25％胰酶均匀浸润细胞贴壁面，室温孵育5～10min，待细胞变圆后快速震荡并吹打细胞贴壁面，得到细胞悬液，离心弃上清，然后以6000个/cm2的细胞密度继续进行传代培养，直至细胞传代至4代；
(3)当步骤(2)所得细胞融合度达到85％时，更换为诱导培养基，继续于37℃，5％CO2环境中培养72h；其中，诱导培养基包括：终浓度为2mmol/L的低氧模拟物、10mmol/L的枸橼酸三钠、10mmol/L的蛋氨酸、20mmol/L的谷氨酰胺，以及DMEM基础培养基；
(4)过滤步骤(3)所得诱导培养基4次，将滤液合并后，浓缩为原体积的1/5；然后加入含有枸橼酸钠的生理盐水补足至原体积后，静置1h，再次过滤，收集滤液并将其浓缩为原体积的1/20；
(5)采用截留分子量为10KD的滤膜对步骤(3)所得产物进行过滤，收集得到干细胞因子浓缩液，再加入海藻糖冻干保护剂即可。
实施例4
与实施例1相比，步骤(3)中使用的是无血清培养基进行培养，其余过程均与实施例1相同。
实施例5
与实施例1相比，步骤(3)中诱导培养基的成分为：低氧模拟物、甘露糖、维生素E，以及DMEM基础培养基，其余过程与实施例1相同。
实施例6
与实施例1相比，步骤(4)中采用PBS补足至原体积，其余过程与实施例1相同。
实验例
取实施例1～6以及中国专利CN105543313所记载的方法制备得到的干细胞因子浓缩液各5mL，采用ELISA试剂盒测定其中EGF、FGF、VEGF的含量，其结果见表1。
表1细胞因子浓度
VEGF(ng/mL) EGF(ng/mL) FGF(ng/mL)
实施例1 623 386 455
实施例2 689 402 503
实施例3 614 394 451
实施例4 185 92 168
实施例5 452 259 268
实施例6 594 362 441
CN105543313 290 185 312
由表1数据可知，采用本申请实施例1～3所记载的方法制备得到的浓缩液中干细胞因子的含量显著优于实施例4、实施例5和中国专利CN105543313，其中以实施例2的效果最佳。
与实施例1相比，实施例6在纯化过程中将含有枸橼酸钠的生理盐水替换为了PBS溶液，但根据检测数据可知，其与实施例1相比，细胞因子的含量虽有所下降，但下降的幅度实际上并不算很大，且其细胞因子的含量也显著优于实施例4、实施例5和中国专利CN105543313所制备得到的浓缩液中的细胞因子的含量。
与实施例1相比，实施例4中将能够诱导细胞因子分泌的培养基更换为了常规的无血清培养基，可以看出，采用该方法制备得到的浓缩液中的细胞因子的含量显著降低，说明了本申请设计的诱导培养基在提升细胞因子分泌量方面具有很重要的作用。
实施例5中更换了诱导培养基中的成分，将其替换为了甘露糖和维生素E，但仍然保留有低氧模拟物，可以看出，采用实施例5所记载的方法制备得到的浓缩液中的细胞因子的含量也有一定的降低，虽然比实施例4和中国专利CN105543313制备得到的浓缩液中的细胞因子的含量高，但其仍然无法达到本申请实施例1所记载的效果。
综上所述，只有在本申请记载的培育方法和培养基的配合下，才能够有效的保证制备得到的浓缩液中的细胞因子的含量。

Claims (8)

1.一种美容用干细胞因子培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将间充质干细胞置于无血清培养基中，于35~37℃，5~10%CO2环境中培养7~10天，进行传代培养，传代至4代后，用生理盐水冲洗1~2次，然后加入消化液，消化计数；
（2）当步骤（1）所得细胞融合度达到80~90%时，更换为诱导培养基，继续于35~37℃，5~10%CO2环境中培养48~72h；
（3）过滤步骤（2）所得诱导培养基3~4次，将滤液合并后，浓缩为原体积的1/10~1/5；然后加入含有枸橼酸钠的生理盐水补足至原体积后，静置1~2h，再次过滤，收集滤液并将其浓缩为原体积的1/20~1/10；
诱导培养基由以下组分组成：终浓度为0.5~2mmol/L的低氧模拟物、5~10mmol/L的枸橼酸三钠、5~10mmol/L的蛋氨酸、10~20mmol/L的谷氨酰胺，以及DMEM基础培养基；所述低氧模拟物为氯化钴或去铁胺；
（4）采用截留分子量为8KD~14KD的滤膜对步骤（3）所得产物进行过滤，收集得到干细胞因子浓缩液，再加入冻干保护剂即可。
2.根据权利要求1所述的美容用干细胞因子培养方法，其特征在于，步骤（1）中所述传代培养的具体过程为：
S1.含有间充质干细胞的组织块装于培养瓶中，然后加入无血清培养基，于35~37℃，5~10%CO2的培养箱，培养7~10天；
S2.当细胞融合度达到70~80%时，舍弃无血清培养基，用生理盐水冲洗瓶壁，然后加入0.25%胰酶均匀浸润细胞贴壁面，室温孵育5~10min，待细胞变圆后快速震荡并吹打细胞贴壁面，得到细胞悬液，离心弃上清，然后以6000~8000个/cm2的细胞密度继续进行传代培养，直至细胞传代至4代。
3.根据权利要求2所述的美容用干细胞因子培养方法，其特征在于，所述S1中培养条件为：37℃，5%CO2。
4.根据权利要求1所述的美容用干细胞因子培养方法，其特征在于，步骤（2）中细胞融合度达到85%时，更换为诱导培养基。
5.根据权利要求1所述的美容用干细胞因子培养方法，其特征在于，所述诱导培养基中低氧模拟物的终浓度为1.8mmol/L、枸橼酸三钠的终浓度为6.4mmol/L、蛋氨酸的终浓度为7.2mmol/L、谷氨酰胺的终浓度为14.6mmol/L。
6.根据权利要求1所述的美容用干细胞因子培养方法，其特征在于，步骤（3）中所述生理盐水中枸橼酸钠的浓度为0.01~0.05mmol/L。
7.根据权利要求1所述的美容用干细胞因子培养方法，其特征在于，所述冻干保护剂的添加量为浓缩液体积的0.1~0.5%。
8.根据权利要求1或7所述的美容用干细胞因子培养方法，其特征在于，所述冻干保护剂为海藻糖、甘露醇或黄体酮中的至少一种。
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