CN109172605A - 一种再生因子的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种再生因子的制备方法，包括以下步骤：体外培养脐带来源的间充质干细胞；在细胞培养到一定代数时，当细胞汇合率达到一定程度时，将原培养基弃去，用生理盐水轻轻清洗细胞两遍，尽量去除残留的培养基原液，然后加入生理盐水，继续培养，细胞会分泌多种因子，因子溶解到生理盐水中，形成细胞分泌液；收集上清液至离心管中离心，去除组织块、细胞碎片；将上清液分装后冻干或冻存于冰箱，长期保存，制备得到再生因子。该种再生因子为干细胞分泌的多种可溶性蛋白，纯度较高，且去除了原细胞培养基的影响，使用效果得到提升。

Description

一种再生因子的制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种再生因子的制备方法及应用。
背景技术
近年来，随着对间充质干细胞研究的不断深入，其分泌因子已成为研究者们的热点。间充质干细胞可以分泌多种具有生物活性的细胞因子，包括肝细胞生长因子(HGF)、转化生子因子-a(TGF-a)、前列腺素E2、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞因子(FGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、神经生长因子(NGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)等，这些可溶性细胞因子可以有效地调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，抑制T淋巴细胞的增殖；参神经系统的修复和再生；参与损伤衰老细胞的增生分化等。
目前的基础研究提示，间充质干细胞可以应用于神经细胞、毛囊干细胞、皮肤干细胞等的再生，从而用于治疗神经损伤、脱发、美容等。而目前临床上对于上述部分疾病暂时没有非常有效的方法。以脱发为例：男性雄激性秃发系统冶疗最有效的冶疗方案主要是口服非那雄胺，联合局部外用米诺地尔。脱发严重者则采取毛发移植手术(王羿婷，孙蔚凌，范卫新.非那雄胺和米诺地尔治疗雄激素性秃发的临床研究[J].临床皮肤科杂志，2011,40(7)：387-390.)。但是非那雄胺口服并不适用于女性激素性脱发、休止期脱发如产后脱发增加或者绝经后脱发(赵辨.中国临床皮肤病学[M].南京:江苏科学技术出版社，2010:1185-1190.)。但现有的治疗方法缺点较多，效果有限，可引起头痛、瘙痒、毛发移植价格昂贵，移植后有排斥、脱落率大、操作不方便等。而使用干细胞手术治疗，费用昂贵，操作不便，安全风险较高。
对于间充质干细胞治疗疾病的机理的进一步研究发现，干细胞治疗这类疾病很重要的原因之一是其强大的外泌能力，通过细胞分泌的多种细胞因子，及外泌体携带的小分子核酸和更小分子如PFG2等的作用来发挥辅助治疗疾病的功效。而这些分泌到胞外的物质即本文所述再生因子。因此再生因子可用于辅助治疗神经损伤性疾病、脱发，使用方便简单易操作，而不存在干细胞输注可能引起的出血、感染等手术风险。
另一方面，在美容行业，皮肤抗衰的治疗手段多样，但很多都会对皮肤造成物理性损伤。传统上所谓的干细胞美容，异体的通常会引起免疫排斥反应，而且存在一定的伦理问题。自体的一般采用脂肪干细胞，取材痛苦、有感染风险，而且脂肪组织会游走，维持的时间较短。因此，将某些细胞因子添加到美容化妆品，常见的如表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)等，不仅具有一般化妆品的保湿美白功效，还能够修复受损皮肤，消除皮肤皱纹，收缩毛孔，改善面色等，细胞因子的作用越来越受到人们的关注，但这种单一的添加通常效果有限。因此含多种细胞因子的化妆品可有效改善肌肤状态，保湿美白肌肤，修复受损肌肤，同时缓解敏感肌，而几乎无安全风险。此外，本方法提前将细胞原培养液去除，替换为生理盐水，使得再生因子糖分等杂质含量降低，避免使用时出现皮肤干燥等不良效果，使用舒适感提升。
发明内容
有鉴于此，本发明针对提供了一种再生因子的制备方法及应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种再生因子的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、体外培养脐带来源的间充质干细胞；
步骤2、在细胞培养到一定代数时，当细胞汇合率达到一定程度时，将原培养基弃去，用生理盐水轻轻清洗细胞两遍，尽量去除残留的培养基原液，然后加入生理盐水，继续培养，细胞会分泌多种因子，因子溶解到生理盐水中，形成细胞分泌液；
步骤3、收集上清液至离心管中离心，去除组织块、细胞碎片；
步骤4、将上清液分装后冻干或冻存于冰箱，长期保存，制备得到再生因子。
可选地，所述步骤1中的体外培养脐带来源的间充质干细胞具体为：
步骤1.1、脐带转移至无菌培养皿，加10mlPBS缓冲液浸泡清洗至脐带发白，无血迹；
步骤1.2、将脐带组织剪成5cm的均匀小段，剥离3根血管和脐带外表皮，剩下的部分称为华通氏胶；
步骤1.3、将华通氏胶用无菌眼科剪尽量剪碎，剪碎成1mm3小块；
步骤1.4、将剪碎的组织块均匀铺于新的培养皿底部，组织块间的距离小于5mm；
步骤1.5、加入1ml无血清培养基润湿组织块，翻转培养皿待其贴牢，置37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中培养；
步骤1.6、隔天将培养皿翻转正置，补充完全培养基到10ml，重新于37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中培养，期间尽量不用力摇晃培养皿，以免贴牢的组织块发生脱落而漂浮；
步骤1.7、组织块培养1周后，倒置显微镜下观察，有长梭状细胞从组织块边缘爬出，即为目标细胞群；此时对细胞进行全量换液，轻轻吸弃原培养基，再沿侧壁小心加入新鲜培养基，保证组织块尽量不脱落；
步骤1.8、以后每3天半量更换培养基，每日镜下观察细胞生长状态，细胞由单个克隆团逐步汇合生长；
步骤1.9、当细胞生长至80％融合时，弃去组织块及非贴壁细胞；用工程化重组胰蛋白酶消化液消化细胞，按1∶5比例传代。
可选地，步骤2中的细胞培养到的代数为第三代-第五代；细胞汇合率达到70％-80％。
可选地，步骤2中的生理盐水的添加量为15-25ml，继续培养时间为20-30小时。
可选地，步骤3中的离心转速为1800-2200rmp，离心时间为8-12min。
可选地，步骤4中的冰箱的冻存温度为-80℃。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)该种再生因子为干细胞分泌的多种可溶性蛋白，纯度较高，且去除了原细胞培养基的影响，使用效果得到提升。
2)将该种再生因子冻干后可将保存时间由原来的一周延长至6个月，大大延长其保质期，同时更加轻便，保存温度要求由4℃变为常温，更便于携带和保存。
3)本发明再生因子与自体外周血prp二联制剂可延缓毛囊萎缩、使原有的静止期毛囊恢复为生长期、帮助原有生长期毛发直径增加，促进伤口愈合，有效促进毛囊存活。
4)本发明再生因子可促进神经细胞的增殖再生，辅助治疗神经损伤性疾病。
5)本发明再生因子可营养滋润皮肤，缓解皱纹的生成，改善肤质。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明公开了一种再生因子的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、体外培养脐带来源的间充质干细胞；
步骤1.1、脐带转移至无菌培养皿，加10mlPBS缓冲液(Solarbio公司)浸泡清洗至脐带发白，无血迹；
步骤1.2、将脐带组织剪成5cm的均匀小段，剥离3根血管(1根脐静脉，2根脐动脉)和脐带外表皮，剩下的部分称为华通氏胶；
步骤1.3、将华通氏胶用无菌眼科剪尽量剪碎，剪碎成1mm3小块；
步骤1.4、将剪碎的组织块均匀铺于新的培养皿底部，组织块间的距离小于5mm；
步骤1.5、加入1ml无血清培养基(Lonza，瑞士)润湿组织块，翻转培养皿待其贴牢，置37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱(Thermo公司，美国)中培养；
步骤1.6、隔天将培养皿翻转正置，补充完全培养基到10ml，重新于37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱(Thermo公司，美国)中培养，期间尽量不用力摇晃培养皿，以免贴牢的组织块发生脱落而漂浮；
步骤1.7、组织块培养1周后，倒置显微镜下观察，可见有长梭状细胞从组织块边缘爬出，即为目标细胞群。此时对细胞进行全量换液，轻轻吸弃原培养基，再沿侧壁小心加入新鲜培养基，保证组织块尽量不脱落；
步骤1.8、以后每3天半量更换培养基，每日镜下观察细胞生长状态，细胞由单个克隆团逐步汇合生长；
步骤1.9、当细胞生长至80％融合时，弃去组织块及非贴壁细胞。用工程化重组胰蛋白酶消化液消化细胞，按1∶5比例传代；
步骤2、在细胞到P3-P5(第三代到第五代)时，当细胞汇合率达到70％-80％时，将原培养基弃去，用生理盐水轻轻清洗细胞两遍，尽量去除残留的培养基原液，然后加入15-25ml生理盐水，继续培养20-30小时，细胞会分泌多种因子，因子溶解到生理盐水中，形成细胞分泌液；
步骤3、收集上清液至50ml离心管中，1800-2200rmp离心8-12min，去除组织块、细胞碎片等；
步骤4、将上清液分装后冻干或冻存于-80℃冰箱，长期保存，制备得到再生因子。
在细胞的整个培养过程中均不使用含动物源成分的试剂，如培养基我们选用无血清化学成分明确的培养基，胰蛋白酶选用工程化重组胰蛋白酶来代替，避免了可能的牛源猪源病毒感染的同时，试剂批次稳定，生产过程更加可控。
细胞再生因子的制备过程中，我们排除了原培养基的干扰，将再生因子的溶剂更换为生理盐水。因为培养基中含有大量的糖分，制作为再生因子成品使用时，舒适度会降低，影响用户体验。
整个制备过程中，最为关键的参数之一：步骤2细胞的传代次数；本发明选择第三到第五代的细胞来制备细胞因子成品。因为代次低于第三代的细胞，仍然混杂不少杂细胞，细胞纯度不能达到要求，使得终产品不纯。而代次高于第五代的细胞，因为细胞老化的影响，其分泌功能减弱，导致终产品有效成分减少，使用效果打折。
当细胞汇合率小于70％时，细胞的生长仍然处于上升期，此阶段细胞出现数量的增多，而分泌功能较弱；当细胞汇合率大于80％时，细胞生长处于平台期后期，即将步入下降期，此时细胞分泌物中代谢废物的量增多，且细胞即将步入衰老死亡的进程。因此，70％-80％汇合度的细胞分泌生物活性物质能力最强，终产品效果最佳。
步骤2中细胞原培养基去除，更换生理盐水后的培养时间为20-30小时。当培养小于20小时，细胞分泌的再生因子量少，有效成分浓度低；培养多于30小时，细胞在无营养状态下培养时间过长，可能提前进入衰老或死亡或者因应激而产生代谢废物，影响终产品质量。
制备再生因子所需原料除人脐带外，还可以选择永生化间充质干细胞、人牙髓、人脂肪、人骨髓、用ipsc分化得到的人间充质干细胞等。
实施例1
一种再生因子的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、体外培养脐带来源的间充质干细胞；
步骤1.1、脐带转移至无菌培养皿，加10mlPBS缓冲液(Solarbio公司)浸泡清洗至脐带发白，无血迹；
步骤1.2、将脐带组织剪成5cm的均匀小段，剥离3根血管(1根脐静脉，2根脐动脉)和脐带外表皮，剩下的部分称为华通氏胶；
步骤1.3、将华通氏胶用无菌眼科剪尽量剪碎，剪碎成1mm3小块；
步骤1.4、将剪碎的组织块均匀铺于新的培养皿底部，组织块间的距离小于5mm；
步骤1.5、加入1ml无血清培养基(Lonza，瑞士)润湿组织块，翻转培养皿待其贴牢，置37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱(Thermo公司，美国)中培养；
步骤1.6、隔天将培养皿翻转正置，补充完全培养基到10ml，重新于37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱(Thermo公司，美国)中培养，期间尽量不用力摇晃培养皿，以免贴牢的组织块发生脱落而漂浮；
步骤1.7、组织块培养1周后，倒置显微镜下观察，可见有长梭状细胞从组织块边缘爬出，即为目标细胞群。此时对细胞进行全量换液，轻轻吸弃原培养基，再沿侧壁小心加入新鲜培养基，保证组织块尽量不脱落；
步骤1.8、以后每3天半量更换培养基，每日镜下观察细胞生长状态，细胞由单个克隆团逐步汇合生长；
步骤1.9、当细胞生长至80％融合时，弃去组织块及非贴壁细胞。用工程化重组胰蛋白酶消化液消化细胞，按1∶5比例传代；
步骤2、在细胞到P4(第四代)时，当细胞汇合率达到75％时，将原培养基弃去，用生理盐水轻轻清洗细胞两遍，尽量去除残留的培养基原液，然后加入20ml生理盐水，继续培养25小时，细胞会分泌多种因子，因子溶解到生理盐水中，形成细胞分泌液；
步骤3、收集上清液至50ml离心管中，2000rmp离心10min，去除组织块、细胞碎片等；
步骤4、将上清液分装后冻干或冻存于-80℃冰箱，长期保存，制备得到再生因子。
实施例2
一种再生因子的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、体外培养脐带来源的间充质干细胞；具体操作同实施例1。
步骤2、在细胞到P3(第三代)时，当细胞汇合率达到70％时，将原培养基弃去，用生理盐水轻轻清洗细胞两遍，尽量去除残留的培养基原液，然后加入25ml生理盐水，继续培养20小时，细胞会分泌多种因子，因子溶解到生理盐水中，形成细胞分泌液；
步骤3、收集上清液至50ml离心管中，2200rmp离心8min，去除组织块、细胞碎片等；
步骤4、将上清液分装后冻干或冻存于-80℃冰箱，长期保存，制备得到再生因子。
实施例3
一种再生因子的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、体外培养脐带来源的间充质干细胞；具体操作同实施例1。
步骤2、在细胞到P5(第五代)时，当细胞汇合率达到80％时，将原培养基弃去，用生理盐水轻轻清洗细胞两遍，尽量去除残留的培养基原液，然后加入15ml生理盐水，继续培养30小时，细胞会分泌多种因子，因子溶解到生理盐水中，形成细胞分泌液；
步骤3、收集上清液至50ml离心管中，1800rmp离心12min，去除组织块、细胞碎片等；
步骤4、将上清液分装后冻干或冻存于-80℃冰箱，长期保存，制备得到再生因子。
实施例4
实施例1-3中制备得到的再生因子用于生发：实施例1-3中制备得到的再生因子+自体外周血prp形成二联制剂，用滚针对脱发患者进行深导治疗。实施例1-3中制备得到的再生因子与自体外周血prp二联制剂可延缓毛囊萎缩、使原有的静止期毛囊恢复为生长期、帮助原有生长期毛发直径增加，促进伤口愈合，有效促进毛囊存活。
实施例5
实施例1-3中制备得到的再生因子用于神经损伤性疾病的辅助治疗：实施例1-3中制备得到的再生因子制成鼻用喷雾，借助雾化机使用。可促进神经细胞的增殖再生，辅助治疗神经损伤性疾病。
实施例6
实施例1-3中制备得到的再生因子用于面部滋润：实施例1-3中制备得到的再生因子加入到常规面膜，待吸收后使用。本发明再生因子可营养滋润皮肤，缓解皱纹的生成，改善肤质。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.一种再生因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、体外培养脐带来源的间充质干细胞；
步骤2、在细胞培养到一定代数时，当细胞汇合率达到一定程度时，将原培养基弃去，用生理盐水轻轻清洗细胞两遍，尽量去除残留的培养基原液，然后加入生理盐水，继续培养，细胞会分泌多种因子，因子溶解到生理盐水中，形成细胞分泌液；
步骤3、收集上清液至离心管中离心，去除组织块、细胞碎片；
步骤4、将上清液分装后冻干或冻存于冰箱，长期保存，制备得到再生因子。
2.根据权利要求1所述的再生因子的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的体外培养脐带来源的间充质干细胞具体为：
步骤1.1、脐带转移至无菌培养皿，加10mlPBS缓冲液浸泡清洗至脐带发白，无血迹；
步骤1.2、将脐带组织剪成5cm的均匀小段，剥离3根血管和脐带外表皮，剩下的部分称为华通氏胶；
步骤1.3、将华通氏胶用无菌眼科剪尽量剪碎，剪碎成1mm3小块；
步骤1.4、将剪碎的组织块均匀铺于新的培养皿底部，组织块间的距离小于5mm；
步骤1.5、加入1ml无血清培养基润湿组织块，翻转培养皿待其贴牢，置37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中培养；
步骤1.6、隔天将培养皿翻转正置，补充完全培养基到10ml，重新于37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中培养，期间尽量不用力摇晃培养皿，以免贴牢的组织块发生脱落而漂浮；
步骤1.7、组织块培养1周后，倒置显微镜下观察，有长梭状细胞从组织块边缘爬出，即为目标细胞群；此时对细胞进行全量换液，轻轻吸弃原培养基，再沿侧壁小心加入新鲜培养基，保证组织块尽量不脱落；
步骤1.8、以后每3天半量更换培养基，每日镜下观察细胞生长状态，细胞由单个克隆团逐步汇合生长；
步骤1.9、当细胞生长至80％融合时，弃去组织块及非贴壁细胞；用工程化重组胰蛋白酶消化液消化细胞，按1∶5比例传代。
3.根据权利要求1所述的再生因子的制备方法，其特征在于，步骤2中的细胞培养到的代数为第三代-第五代；细胞汇合率达到70％-80％。
4.根据权利要求1所述的再生因子的制备方法，其特征在于，步骤2中的生理盐水的添加量为15-25ml，继续培养时间为20-30小时。
5.根据权利要求1所述的再生因子的制备方法，其特征在于，步骤3中的离心转速为1800-2200rmp，离心时间为8-12min。
6.根据权利要求1所述的再生因子的制备方法，其特征在于，步骤4中的冰箱的冻存温度为-80℃。
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