CN110841104A - 一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法及在皮肤创伤修复的应用 - Google Patents

一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法及在皮肤创伤修复的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及海绵支架技术领域，具体涉及一种红景天苷‑胶原蛋白海绵支架的制备方法及在皮肤创伤修复的应用。该红景天苷‑胶原蛋白海绵支架的制备方法包括：步骤一、制备胶原混合物；步骤二、注入培养板；步骤三、冷冻干燥。该制备方法是利用胶原蛋白作为天然材料和药物载体，构建红景天苷‑胶原蛋白海绵支架，所制得的红景天苷‑胶原蛋白海绵支架具有高互联性和孔隙率的优点，进而不影响药物释放，并且具有皮肤创伤修复效果好的优点。并通过动物实验证实了红景天苷‑胶原蛋白海绵支架对皮肤创伤修复的效果好，能为创伤修复的基础研究和临床应用提供参考，并且其再上皮化效果最佳，因此，红景天苷‑胶原蛋白海绵支架能够促进修复皮肤创口及皮肤再上皮化。

Description

一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法及在皮肤创伤 修复的应用
技术领域
本发明涉及海绵支架技术领域，具体涉及一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架 的制备方法及在皮肤创伤修复的应用。
背景技术
胶原蛋白是一种天然的高分子蛋白质，主要分布于动物的骨、肌腱、韧带、 皮肤和角膜等组织中，是动物体内含量最为丰富的蛋白质。胶原蛋白提取方法 主要有中性盐溶解法、酸溶法、碱溶法和酶法。商业应用的胶原溶液可以制备 各种凝胶、胶原膜和支架等应用于组织工程材料、药物控释载体和伤口修复及 愈合等方面。胶原蛋白作为生物医用材料已得到广泛地应用，但是，单纯的胶 原蛋白存在互联性和孔隙率均较低的缺陷，容易影响药物释放。
皮肤创伤修复是一个动态复杂的过程，涉及多种细胞协同作用，任何修复 过程中的失败可能导致慢性伤口和瘢痕形成，这将给患者带来极大痛苦。皮肤 组织工程技术实现修复创伤和重建功能的目的，解决了自体植皮术来源受限的 问题。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，具有很强的生物活性及生物功能， 也是一种天然的组织支架材料，被广泛用于创伤修复，但是皮肤创伤修复的效 果还是欠佳，需要不断改进。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，提供一种红景天苷-胶原蛋白 海绵支架的制备方法，所制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架具有高互联性和孔 隙率的优点，进而不影响药物释放，并且具有皮肤创伤修复效果好的优点。
本发明的目的之二在于针对现有技术的不足，提供一种红景天苷-胶原蛋白 海绵支架在皮肤创伤修复的应用。
为了实现上述目的之一，本发明采用如下技术方案：
提供一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一、制备胶原混合物：将胶原蛋白溶液与红景天苷混合均匀，制得 胶原混合物；
步骤二、注入培养板：将步骤一制得的胶原混合物注入培养板中；
步骤三、冷冻干燥：将步骤二中注入了培养板中的胶原混合物进行冷冻干 燥，即制得所述红景天苷-胶原蛋白海绵支架。
上述技术方案中，所述步骤一中，所述胶原蛋白溶液的浓度为6mg/g～ 10mg/g。
上述技术方案中，所述步骤一中，所述胶原蛋白溶液与所述红景天苷的质 量比为30～45:0.05～0.5。
上述技术方案中，所述步骤一中，所述胶原蛋白溶液的制备方法为：将富 含胶原蛋白的动物的组织采用酸酶结合方法进行提取，得到粗提取液，然后粗 提取液依次经离心、盐析和超滤的纯化处理后，即得到纯胶原蛋白溶液。
上述技术方案中，所述步骤三中，所述冷冻干燥的温度为-60℃～-30℃， 所述冷冻干燥的时间为48h～72h。
为了实现上述目的之二，本发明采用如下技术方案：
提供上述任意一项所述的一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法所 制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架在皮肤创伤修复的应用。
本发明与现有技术相比较，有益效果在于：
(1)本发明提供的一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，红景天 苷具有抗氧化、抗衰老，对心血管、神经、皮肤等有一定的保护作用，本发明 是利用胶原蛋白作为天然材料和药物载体，构建红景天苷-胶原蛋白海绵支架， 所制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架具有高互联性和孔隙率的优点，进而不影 响药物释放，并且具有皮肤创伤修复效果好的优点。
(2)本发明提供的一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，具有工 艺过程简单、设备简易、制备过程温和、生产成本低，并能够适用于工业化大 规模应用的特点。
(3)本发明提供的一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架在皮肤创伤修复的应 用，通过动物实验证实了红景天苷-胶原蛋白海绵支架对皮肤创伤修复的效果好， 能为创伤修复的基础研究和临床应用提供参考。通过组织病理分析表明红景天 苷-胶原蛋白海绵支架与胶原蛋白海绵支架和模型组相比，其再上皮化效果最佳， 且与正常皮肤结构最接近，因此，红景天苷-胶原蛋白海绵支架能够促进修复皮 肤创口及皮肤再上皮化。
附图说明
图1是本发明实施例1制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架的外观图。
图2是本发明实施例1制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架的扫描电镜图。
图3是本发明实施例1制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架的孔隙率测定图。
图4是本发明实施例1制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架的体外红景天苷 累积释放率图。
图5是大鼠皮肤创伤修复情况对比图。
图6是大鼠皮肤创伤修复的创口愈合率对比图。
图7是大鼠皮肤创口组织切片HE染色对比图。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以 下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体 实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1。
一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一、制备胶原混合物：将胶原蛋白溶液与红景天苷混合均匀，制得 胶原混合物；本实施例中，胶原蛋白溶液的浓度为8mg/g；本实施例中，胶原 蛋白溶液与红景天苷的质量比为38.5:0.2；
其中，胶原蛋白溶液的制备方法为：将富含胶原蛋白的动物的组织采用酸 酶结合方法进行提取，得到粗提取液，然后粗提取液依次经离心、盐析和超滤 的纯化处理后，即得到纯胶原蛋白溶液；
步骤二、注入培养板：将步骤一制得的胶原混合物注入培养板中；
步骤三、冷冻干燥：将步骤二中注入了培养板中的胶原混合物进行冷冻干 燥，即制得所述红景天苷-胶原蛋白海绵支架。本实施例中，冷冻干燥的温度 为-50℃，冷冻干燥的时间为60h。
上述一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法所制得的红景天苷-胶原 蛋白海绵支架在皮肤创伤修复的应用。
实施例2。
一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一、制备胶原混合物：将胶原蛋白溶液与红景天苷混合均匀，制得 胶原混合物；本实施例中，胶原蛋白溶液的浓度为6mg/g；本实施例中，胶原 蛋白溶液与红景天苷的质量比为30:0.05；
其中，胶原蛋白溶液的制备方法为：将富含胶原蛋白的动物的组织采用酸 酶结合方法进行提取，得到粗提取液，然后粗提取液依次经离心、盐析和超滤 的纯化处理后，即得到纯胶原蛋白溶液；
步骤二、注入培养板：将步骤一制得的胶原混合物注入培养板中；
步骤三、冷冻干燥：将步骤二中注入了培养板中的胶原混合物进行冷冻干 燥，即制得所述红景天苷-胶原蛋白海绵支架。本实施例中，冷冻干燥的温度 为-60℃，冷冻干燥的时间为48h。
上述一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法所制得的红景天苷-胶原 蛋白海绵支架在皮肤创伤修复的应用。
实施例3。
一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一、制备胶原混合物：将胶原蛋白溶液与红景天苷混合均匀，制得 胶原混合物；本实施例中，胶原蛋白溶液的浓度为10mg/g；本实施例中，胶 原蛋白溶液与红景天苷的质量比为45:0.5；
其中，胶原蛋白溶液的制备方法为：将富含胶原蛋白的动物的组织采用酸 酶结合方法进行提取，得到粗提取液，然后粗提取液依次经离心、盐析和超滤 的纯化处理后，即得到纯胶原蛋白溶液；
步骤二、注入培养板：将步骤一制得的胶原混合物注入培养板中；
步骤三、冷冻干燥：将步骤二中注入了培养板中的胶原混合物进行冷冻干 燥，即制得所述红景天苷-胶原蛋白海绵支架。本实施例中，冷冻干燥的温度 为-30℃，冷冻干燥的时间为72h。
上述一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法所制得的红景天苷-胶原 蛋白海绵支架在皮肤创伤修复的应用。
实施例4。
一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一、制备胶原混合物：将胶原蛋白溶液与红景天苷混合均匀，制得 胶原混合物；本实施例中，胶原蛋白溶液的浓度为7mg/g；本实施例中，胶原 蛋白溶液与红景天苷的质量比为35:0.1；
其中，胶原蛋白溶液的制备方法为：将富含胶原蛋白的动物的组织采用酸 酶结合方法进行提取，得到粗提取液，然后粗提取液依次经离心、盐析和超滤 的纯化处理后，即得到纯胶原蛋白溶液；
步骤二、注入培养板：将步骤一制得的胶原混合物注入培养板中；
步骤三、冷冻干燥：将步骤二中注入了培养板中的胶原混合物进行冷冻干 燥，即制得所述红景天苷-胶原蛋白海绵支架。本实施例中，冷冻干燥的温度 为-40℃，冷冻干燥的时间为52h。
上述一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法所制得的红景天苷-胶原 蛋白海绵支架在皮肤创伤修复的应用。
实施例5。
一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一、制备胶原混合物：将胶原蛋白溶液与红景天苷混合均匀，制得 胶原混合物；本实施例中，胶原蛋白溶液的浓度为9mg/g；本实施例中，胶原 蛋白溶液与红景天苷的质量比为42:0.4；
其中，胶原蛋白溶液的制备方法为：将富含胶原蛋白的动物的组织采用酸 酶结合方法进行提取，得到粗提取液，然后粗提取液依次经离心、盐析和超滤 的纯化处理后，即得到纯胶原蛋白溶液；
步骤二、注入培养板：将步骤一制得的胶原混合物注入培养板中；
步骤三、冷冻干燥：将步骤二中注入了培养板中的胶原混合物进行冷冻干 燥，即制得所述红景天苷-胶原蛋白海绵支架。本实施例中，冷冻干燥的温度 为-55℃，冷冻干燥的时间为68h。
上述一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法所制得的红景天苷-胶原 蛋白海绵支架在皮肤创伤修复的应用。
实验测试：
1.材料与方法
1.1实验动物及主要试剂、仪器
幼年SPF级雄性SD大鼠24只，体重约150g，由南方医科大学实验动物中 心提供。红景天苷(道斯夫生物)；胶原蛋白(牛跟腱中提取)由本实验室自 制；HE染色试剂(南京建成)；高效液相色谱仪(岛津)；真空冷冻干燥机(宁 波新芝生物)。
1.2红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备
根据上述实施例1的制备方法，取38.5g的8mg/g胶原蛋白溶液与0.2g红 景天苷混合，充分搅拌。将混合所得胶原混合物注入12孔培养板中，每孔2g。 随后冷冻干燥，制成直径约2cm红景天苷-胶原蛋白海绵支架，每块红景天苷- 胶原蛋白海绵支架约含10mg的红景天苷。
1.3扫描电子显微镜(SEM)检测红景天苷-胶原蛋白海绵支架的结构表征
将上述1.2制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架经喷金处理后，采用扫描电 镜在加速电压下观察其的表面与断面结构。
1.4红景天苷-胶原蛋白海绵支架孔隙率的测定
乙醇渗透法测定支架的孔隙率。将体积为10ml的离心管装满乙醇并称重为 W1，把重为Ws的支架浸入乙醇中，超声30分钟，然后再加满乙醇并称重为W2。 将吸满乙醇的样品取出后，称剩余的乙醇和离心管的重量W3。同时将无药物装 载的胶原蛋白海绵支架作为对照组,实验重复3次。计算公式：孔隙率＝(W2-W3-WS) /(W1-W3)X100％。
1.5红景天苷-胶原蛋白海绵支架的体外药物释放度
将红景天苷-胶原蛋白海绵支架完全浸入10ml磷酸盐缓冲溶液(PBS)中， 置于37℃恒温摇床。于5min、10min、20min、30min、60min、120min后分别 取样保存。利用高效液相检测溶液中药物含量，计算累积释放率。实验重复3 次。
1.6动物模型制备与分组
将24只SD大鼠随机分为3组，每组8只，分为模型组、胶原蛋白海绵支 架组和红景天苷-胶原蛋白海绵支架组。各组大鼠以10％水合氯醛腹腔注射 (0.4ml/100g)麻醉后，背部备皮并用碘伏消毒，在背部正中线两侧用手术刀 各切除一个直径为2cm全层圆形皮肤创口。对照组创口不作其他处理，仅用纱 布包扎，其他两组分别用胶原蛋白海绵支架组、红景天苷-胶原蛋白海绵支架组 植入大鼠皮肤创面，并用医用胶布包扎。待大鼠苏醒后分笼饲养，造模后三天 腹腔注射青霉素-链霉素双抗防止伤口感染。
1.7一般情况
术后观察各组大鼠存活情况、有无感染以及创口愈合情况，并用数码相机 拍照记录。
1.8创伤愈合率的测量
造模后第7天、14天、21天、28天，用半透明塑料薄膜贴附于瘢痕后分 别沿边缘描记、拍照，将照片扫描入计算机，通过软件image-pro-plus测算愈 合面积。
愈合率(％)＝(原创面面积-现创面面积)/原创面面积×100％。
1.9常规病理组织学切片染色(HE染色)
造模后第7天、14天、21天、28天各组分别处死2只模型大鼠，取包括整个 创面及周边5mm的全层组织，将组织块置于4％中性多聚甲醛中固定24小时。 随后常规石蜡包埋后备用。蜡块常规脱水，包埋，切片后作HE染色，光镜下观 察组织病理学变化。
1.10统计学方法
用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，采用t检验 或单因素方差分析比较各组间差异，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差 异极具统计学意义。
2.实验结果
2.1本实施例1制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架的外观图，如图1所示，海 绵支架色泽洁白，柔软疏松。另外，本实施例1制得的红景天苷-胶原蛋白海绵 支架的扫描电镜图，如图2所示，通过扫描电镜图可观察到红景天苷-胶原蛋白 海绵支架的内部具有高度互联的多孔结构，孔与孔之间呈紧密排列状态，孔径 大小在40μm-200μm范围。
2.2本实施例1制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架的孔隙率测定图，如图3 所示，从图3中可见装载红景天苷的胶原蛋白海绵支架与单纯胶原蛋白海绵支 架的孔隙率相比，并没有明显差异。
2.3本发明实施例1制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架的体外红景天苷累积 释放率图，如图4所示，由图4可知，红景天苷-胶原蛋白海绵支架中的红景天 苷能够在短时间内释放，说明胶原蛋白海绵支架并不影响红景天苷药物释放。 从另一方面验证了该红景天苷-胶原蛋白海绵支架的高孔隙率结构。
2.4大鼠皮肤创伤修复及创口愈合率检测：其中，大鼠皮肤创伤修复情况对比 图，如图5所示，其中，A代表模型组，B代表胶原蛋白海绵支架组，C代表红景天苷- 胶原蛋白海绵支架组。其中，大鼠皮肤创伤修复的创口愈合率对比图，如图6所示， 与模型组相比，**P<0.01，***P<0.001；与胶原海绵支架组相比，#P<0.01。从上图5和图6 可知，皮肤创伤造模后，在第7、14、21、28天测量并记录创面愈合情况。随着 时间推移，三组的创口面积都呈减小的趋势，两种海绵支架组创口面积明显小 于模型组，在第28天两种海绵支架组创口基本愈合完全。但红景天苷-胶原蛋 白海绵支架组在促进创口愈合作用更优于胶原蛋白海绵支架组，在第7、14、 21天其愈合率均与模型组相比，差异极具统计学意义(***P<0.001)，并在第14天其比海绵支架组愈合速度更快(#P<0.01)。
2.5大鼠皮肤创伤愈合的HE染色：其中，大鼠皮肤创口组织切片HE染色对比 图，如图7所示，其中，A代表正常皮肤，B代表模型组，C代表胶原蛋白海绵 支架组，D代表红景天苷-胶原蛋白海绵支架组。从图7可知，HE染色可见第7 天三组创面主要表现炎症细胞渗出伴随肉芽组织生成，在第14天，各组新生组 织出现再上皮化,真皮层内可见肉芽组织生长活跃，成纤维细胞及新生血管增多， 胶原蛋白海绵支架组和红景天苷-胶原蛋白海绵支架组中的炎症细胞较模型组 少，成纤维细胞较模型组多，再上皮化程度较模型组高。第21天，模型组表皮 继续增厚，未达完全再上皮化，新生上皮下仍有肉芽组织填充，有少量炎症细胞浸润。胶原蛋白海绵支架组和红景天苷-胶原蛋白海绵支架组基本完全再上皮 化，偶见炎症细胞浸润，但红景天苷-胶原蛋白海绵支架组真皮层内的新生胶原 纤维排列较整齐。第28天三组达完全再上皮化，表皮和真皮分界明显，新生表 皮各层分化良好。但红景天苷-胶原蛋白海绵支架组修复效果最佳，其再上皮化 形成的新生上皮结构厚度接近正常皮肤，真皮层内新生胶原纤维排列较其他两 组整齐，有附属器形成。
3.讨论
伤口愈合是一个动态复杂的组织再生和生长的过程，生物活性支架可作为 细胞黏附和增殖的载体，促进新生组织的形成。近来，随着对药用植物生物活 性提取物的应用研究不断深入，越来越多的研究者改进复合伤口敷料，应用于 急慢性的创口愈合。本发明研究装载具有抗氧化能力的红景天苷的海绵支架对 创伤愈合的效果。实验结果显示，红景天苷-胶原蛋白海绵支架具有高互联性和 高孔隙率结构，用于大鼠背部全层皮肤缺损创面后，缩短了创面的愈合时间， 提高了愈合质量，有促进创面愈合及再上皮化的作用。创伤愈合的生理过程涉 及止血期、炎症反应期、增殖期、创面收缩和组织重塑期。红景天苷-胶原蛋白 海绵支架提供一个保护屏障，保护伤口免受外界湿度和微生物的影响，允许气 体交换，也提供了ECM成分，其多孔结构有利于细胞的黏附和增殖，符合愈合 特性。同时作为载体，释放具有抗氧化和对损伤修复有一定作用的植物提取物 红景天苷，发挥其生物特性。与单纯的胶原蛋白支架相比，它的愈合时间和愈 合质量更佳，HE染色结果显示其修复效果最接近正常皮肤，提示红景天苷对皮 肤创伤愈合有一定的修复作用。综上所述，本发明构建的红景天苷-胶原蛋白海 绵支架具有修复皮肤创口及促皮肤再上皮化的潜力，通过进一步研究和优化能 获得理想的皮肤创伤修复支架材料。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制， 尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理 解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方 案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：
步骤一、制备胶原混合物：将胶原蛋白溶液与红景天苷混合均匀，制得胶原混合物；
步骤二、注入培养板：将步骤一制得的胶原混合物注入培养板中；
步骤三、冷冻干燥：将步骤二中注入了培养板中的胶原混合物进行冷冻干燥，即制得所述红景天苷-胶原蛋白海绵支架。
2.根据权利要求1所述的一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，其特征在于：所述步骤一中，所述胶原蛋白溶液的浓度为6mg/g～10mg/g。
3.根据权利要求1所述的一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，其特征在于：所述步骤一中，所述胶原蛋白溶液与所述红景天苷的质量比为30～45:0.05～0.5。
4.根据权利要求1所述的一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，其特征在于：所述步骤一中，所述胶原蛋白溶液的制备方法为：将富含胶原蛋白的动物的组织采用酸酶结合方法进行提取，得到粗提取液，然后粗提取液依次经离心、盐析和超滤的纯化处理后，即得到纯胶原蛋白溶液。
5.根据权利要求1所述的一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，其特征在于：所述步骤三中，所述冷冻干燥的温度为-60℃～-30℃，所述冷冻干燥的时间为48h～72h。
6.权利要求1至5任意一项所述的一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法所制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架在皮肤创伤修复的应用。
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