CN1210335C - 壳聚糖－明胶－透明质酸双层复合支架材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种壳聚糖-明胶-透明质酸双层复合支架材料的制备方法。该方法包括以壳聚糖-明胶为原料制备成溶液，加入交联剂将溶液注入模具中，液层达1-10mm，经过包括预冻、真空冷冻干燥制得粗品，粗品经二次冷冻干燥制得支架材料，其主要特征是：以壳聚糖/明胶为1/0.3-3溶于0.5%-3%的乙酸中，配制含量为0.5%-4%的溶液A，在A中加入0.1%-2%的透明质酸水溶液，含量不超过壳聚糖明胶总量的10%，得到溶液B，在溶液B中加入碳二亚胺交联剂，或把溶液B经冻干成型后的支架浸泡于交联剂溶液中，预冻温度在-20℃～-200℃之间，冷冻干燥在-40℃于5Kpa进行。本发明支架材料断面为双层复合结构，能适应不同细胞共培养的要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种壳聚糖-明胶-透明质酸双层复合支架材料的制备方法。属于生物医学工程组织移植用支架材料技术。
背景技术
现有天然高分子支架主要是胶原基支架，包括胶原-壳聚糖、胶原-硫酸软骨素-6构造支架结构。美国Organogenesis公司制造的Apligral人工皮肤于1998年经FDA批准，此产品源于20年前MIT在胶原基支架材料成功培养成纤细胞和角质形成细胞。John F.Burke等以胶原和壳聚糖构筑生物材料支架。此支架生物相容性好，易于细胞生长，但具有一定的抗原性且收缩大。
明胶与海藻酸钠或透明质酸混合，可制备人工皮肤支架。海藻酸钠与透明质酸可有效的提高明胶支架的抗酶解性能，无抗原性，但此支架的力学性能仍较差[Young seon Choi，Sung Ran Hong，Young Moo Lee，Kang Won Song，Moom Hyang Park，Young Soo Nam，Studieson gelatin-containing artificial skin：preparation and characterization ofcross-linked gelatin-hyaluronate sponge，J Biomed Mater Res，1999，48：631～639]。
本课题组采用壳聚糖增强明胶支架，以及壳聚糖-明胶-磷酸钙复合支架已申请中国国家专利[姚康德等，壳聚糖/明胶网络支架材料，公开号CN1272384A 申请号00106287.5]，[姚康德等“壳聚糖-明胶/磷酸钙多孔复合支架材料的制备方法”申请号00136756.9(2000.12.29)]。此两种支架分别适合于软组织和硬组织再造。它们都具有良好的力学强度和细胞亲和力，以及具有亲/疏水平衡可调性和生物降解性等。但是它们均属于单一层状结构材料，即材料的断面属于单一结构体。因此在其应用上有着一定的局限性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种壳聚糖-明胶-透明质酸双层复合支架材料的制备方法。依此方法所制备的支架材料不但具有良好的力学性能，生物相容性，亲/疏水平衡性，降解速度可调性，而且材料断面为双层复合结构，能适应不同细胞共培养的要求。
为达到上述目的，本发明是通过下述技术方案加以实现的。包括以壳聚糖-明胶为原料，制备成溶液，然后加入交联剂将溶液注入模具中，并使其液层达1-10mm，经过包括预冻、真空冷冻干燥、加热、洗涤过程得到多孔基材粗制品：该粗品材料经第二次冷冻干燥、γ射线灭菌过程后得到壳聚糖-明胶-透明质酸双层复合支架材料，其特征在于：用透明质酸与壳聚糖和明胶相混合制备支架材料；采用0.5％-3％的乙酸作为溶剂制备壳聚糖-明胶溶液，其配比为壳聚糖/明胶为1/0.3-1/3，得到溶液A，此溶液的固含量为0.5％-4％；在上述溶液A中加入0.1％-2％的透明质酸水溶液，含量不超过壳聚糖明胶总量的10％，得到溶液B；在溶液B中加入碳二亚胺(EDC)交联剂，其用量为溶液B浓度的0.005％-0.05％，经冻干成型；或把溶液B经冻干成型后的支架浸泡于交联剂溶液中，交联剂浓度为0.1％-5％。预冻温度在-20℃～-200℃之间，时间为8小时以上。之后在-40℃于5KPa条件下冷冻干燥48小时以上，再于常压下40℃热烘2小时以上，二次冷冻干燥于-40℃，5KPa进行24小时以上。
上述制备过程中预冻的最佳温度为-20℃～-80℃之间。
依上述方法制备的支架材料其断面有明显的双层结构：一个是表面光滑的致密层，其通孔孔径为10～40μm，另一层为疏松层，为100～300μm较大孔径的通孔结构。
本发明采用壳聚糖、明胶、透明质酸制备支架材料，可实现它们之间的优势互补，达到仿生及生物环境友好的目的。本发明采用壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化的产物，选用的分子量从150000-500000，脱乙酰度从75％-95％的产品及壳聚糖衍生物，包括羧甲基化壳聚糖，烷基化壳聚糖。明胶是壳聚糖的变性产物，由胶原经水解制成，保留了胶原特定的氨基酸组成。透明质酸由微生物发酵而得，可选分子量从200000-1000000的产品及其衍生物酯化透明质酸。
本发明中主要选择了碳二亚胺(EDC)作为交联剂，它不具细胞毒性，可替代常用的戊二醛，从而使后处理过程简化。[Tomihata K，Ikada Y.Crosslinking of hyaluronic acidwith water-soluble carbodiimide.J.Biomed.Mater.Res.1997；37：243-251]。
本发明在预冻过程中采用将容器底部与冷源直接接触的方法，可实现模具内液层内具有不同的冷却速度，这是实现双层复合结构的重要条件之一。
本发明制备的壳聚糖-明胶-透明质酸双层复合支架具有良好的力学性能，生物相容性，亲/疏水平衡性，降解速度可调性，而且材料断面为双层复合结构，能适应不同细胞共培养的要求。
附图说明
图1为本发明支架材料断面疏松层结构的扫描电镜照片。
图2为本发明支架材料断面致密层结构的扫描电镜照片。
具体实施方式
实施例一：
取精制后的壳聚糖(脱乙酰度85％，分子量300000)2克和明胶2克放入90毫升浓度为1％的醋酸水溶液，40℃下搅拌4小时达到完全溶解，滴加10毫升1％的透明质酸水溶液，快速搅拌2小时。滴加0.25％EDC，得到交联的壳聚糖-明胶-透明质酸水溶液(A)。取A液20毫升加入90毫米聚苯乙烯培养皿，于-40℃低温预冻24小时；控制冷冻干燥机干燥室的温度为-40℃，将含有预冻液体的培养皿移入干燥室中，温度平衡后开启抽气泵，维持干燥室气压小于5000帕斯卡48小时，然后常压加热至40℃热烘2小时，即得多孔材料粗产品，以5％氢氧化钠乙醇溶液(50％)洗涤该多孔基材粗产品，用去离子水清洗5次，降低冻干机温度至-40℃，将多孔基材连同培养皿一起移入-40℃的冻干机中，抽真空至干燥室气压小于5000帕斯卡并保持24小时，多孔基材取出后采用γ射线进行灭菌，然后用聚乙烯薄膜将多孔基材密封后，即得组织工程用壳聚糖-明胶-透明质酸网络支架材料。
实施例二：
取精制后的壳聚糖(脱乙酰度85％)2克和明胶2克放入90毫升浓度为1％的醋酸水溶液，40℃下搅拌4小时达到完全溶解，滴加10毫升1％的透明质酸水溶液，快速搅拌2小时，得到壳聚糖-明胶-透明质酸水溶液(A)。取A液20毫升加入90毫米聚苯乙烯培养皿，于-40℃低温预冻24小时；控制冷冻干燥机干燥室的温度为-40℃，将含有预冻液体的培养皿移入干燥室中，温度平衡后开启抽气泵，维持干燥室气压小于5000帕斯卡48小时，然后常压加热至40℃热烘2小时，即得多孔材料粗产品，以5％氢氧化钠乙醇溶液(50％)洗涤该多孔基材粗产品，用去离子水清洗5次，将基材浸入0.1％EDC水溶液于4℃交联12小时，再用去离子水冲洗5次，降低冻干机温度至-40℃，将多孔基材连同培养皿一起移入-40℃的冻干机中，抽真空至干燥室气压小于5000帕斯卡并保持24小时，多孔基材取出后采用γ射线进行灭菌，然后用聚乙烯薄膜将多孔基材密封后，即得组织工程用壳聚糖-明胶-透明质酸网络支架材料。
Claims (2)
1.一种壳聚糖-明胶-透明质酸双层复合支架材料的制备方法，该方法包括以壳聚糖-明胶为原料，制备成溶液，然后加入交联剂将溶液注入模具中，并使其液层达1-10mm，经过包括预冻、真空冷冻干燥、加热、洗涤过程得到多孔基材粗制品；该粗品材料经第二次冷冻干燥、γ射线灭菌过程后得到壳聚糖-明胶-透明质酸双层复合支架材料，其特征在于：用透明质酸与壳聚糖和明胶相混合制备支架材料；采用0.5％-3％的乙酸作为溶剂制备壳聚糖-明胶溶液，其配比为壳聚糖/明胶为1/0.3-1/3，得到溶液A，此溶液的固含量为0.5％-4％；在上述溶液A中加入0.1％-2％的透明质酸水溶液，含量不超过壳聚糖明胶总量的10％，得到溶液B；在溶液B中加入碳二亚胺(EDC)交联剂，其用量为溶液B浓度的0.005％-0.05％，经冻干成型；或把溶液B经冻干成型后的支架浸泡于交联剂溶液中，交联剂浓度为0.1％-5％，预冻温度在-20℃～-200℃之间，时间为8小时以上，之后在-40℃于5KPa条件下冷冻干燥48小时以上，再于常压下40℃热烘2小时以上，二次冷冻干燥于-40℃，5KPa进行24小时以上。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖-明胶-透明质酸双层复合支架材料的制备方法，其特征在于：预冻的最佳温度为-20℃～-80℃之间。
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