CN104874017A - 复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架及其制备方法和应用 - Google Patents
复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104874017A CN104874017A CN201510241326.8A CN201510241326A CN104874017A CN 104874017 A CN104874017 A CN 104874017A CN 201510241326 A CN201510241326 A CN 201510241326A CN 104874017 A CN104874017 A CN 104874017A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- collagen
- chitin
- porous support
- compound
- chitosan
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明涉及生物制品领域，公开了一种复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架及其制备方法和在制备皮肤替代品中应用。本发明的制备方法包括：制备胶原-壳聚糖多孔支架，并将胶原-壳聚糖多孔支架浸泡在Tβ4溶液中，得到复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架；然后将复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架依次进行化学交联处理和冷冻干燥处理。本发明的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架能够明显有效地促进糖尿病等皮肤难愈合创面的再生、重构、修复与愈合。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品领域，具体地，涉及一种复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架及其制备方法和应用。
背景技术
由于糖尿病患者机体的组织细胞长时间处于高糖环境，使局部皮肤组织细胞、蛋白质等被糖基化，引起血管内皮功能异常，反应受损；巨嗜细胞的功能减弱，炎症反应延长失衡；生长因子缺乏或者受损，胶原组织的减少、表皮屏障功能的失调，以及肉芽组织的减少等，导致溃疡难以修复。且治疗糖尿病引起的皮肤难愈合创面的研究仍未取得重大突破。
以胶原和壳聚糖两种高分子生物为基础的胶原-壳聚糖组织工程支架是运用多学科的方法和手段制备的一种较为完善的工程化组织，是能够恢复、保持或改善皮肤功能的皮肤替代品，它可以模拟细胞外基质，构建组织再生的框架，支架的形态和微观结构直接影响细胞的粘附、生长、迁移、增殖和代谢功能，最终使组织得以重建，完成创面的修复与再生。但是，其治疗糖尿病皮肤难愈合创面的效率较低，不利于促进皮肤难愈合创面的修复进程与皮肤附件的再生。
生长因子可以作为调节细胞行为的重要营养物质，应用于组织工程皮肤支架中。作为一种多功能的生长因子，胸腺素β4(以下简称为Tβ4)在促进创伤愈合方面是通过多种途径来实现的。Tβ4是存在于真核细胞中的一种肌动蛋白螯合分子，在机体内广泛分布，具有调节多种生长因子的表达以及趋化新生细胞迁移的特性，在皮肤的创伤愈合过程中，Tβ4可以刺激内皮细胞迁移，促进血管形成；调节某些炎症介质表达，抑制炎症反应；促进角质细胞迁移进而加速创面再上皮化；与纤维蛋白和胶原交联，促进胶原纤维重排与基底膜重建。
随着难愈合创面研究的进一步深入，Tβ4的独特作用使它在难愈合创面研究上有了逐步发展，但如何安全、稳定、快速、高效地将Tβ4运用在皮肤难愈合创面的修复与再生上，仍是亟需解决的难题。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的上述缺陷，提供一种复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架及其制备方法和应用，该复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架能够明显有效地促进糖尿病等皮肤难愈合创面的再生、重构、修复与愈合。
因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架的制备方法，该方法包括：制备胶原-壳聚糖多孔支架，并将胶原-壳聚糖多孔支架浸泡在Tβ4溶液中，得到复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架；然后将复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架依次进行化学交联处理和冷冻干燥处理。
第二方面，本发明提供了上述方法制备得到的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架。
第三方面，本发明提供了复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架在制备皮肤替代品中的应用。
本发明的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架具有以下有益效果：
(1)本发明的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架为治疗难愈合创面并加快其再生程度提供了有效手段，适用于难愈合创面的高效安全愈合。该支架在炎症期(即皮肤损伤后第1-4天)的Tβ4累积释放率高达70％，且之后以稳定的速度持续缓慢的释放Tβ4，并在损伤后12天Tβ4的累积释放率高达96％，能够明显促进皮肤损伤部位的完美再生。
(2)该支架拥有合理的孔径、孔隙和三维多孔结构和优良的生物降解率和溶胀属性，在体内可以较好的模拟正常皮肤微环境，有利于细胞增生迁移以及生长因子的浸润，可以有效促进损伤部位移植后的快速血管新生及再上皮化，促进难愈创面修复再生，提高移植效率。
(3)该支架可以有效抑制损伤部位的炎症反应，促进损伤皮肤生成毛囊等附属结构，从而使损伤部位皮肤结构和功能趋于正常化。
(4)该支架可以应用于糖尿病溃疡、严重创伤、烧伤患者等缺乏可供移植的自体皮肤，以及创面修复困难、严重影响肢体功能的难愈慢性创面，为促进皮肤创面愈合，解决移植皮源问题提供了新的出路。
(5)该支架揭示了糖尿病等皮肤难愈合损伤部位治疗的新的作用机制，为糖尿病皮肤损伤的治疗提供新思路，也可以作为体外皮肤模型进行一些相关的基础医学领域比如皮肤生理学及皮肤病理学方面的研究。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1显示的是本发明的胶原-壳聚糖多孔支架的特性，其中，(A)为胶原-壳聚糖多孔支架的肉眼直观图片，(B)、(C)、(D)分别为扫描电镜(200×倍数)下的实施例6、1和7的胶原-壳聚糖多孔支架的显微图片。
图2-4显示的是糖尿病皮肤损伤部位的大体观察及组织学评估情况。其中，图2和图3分别为将实施例1的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架和对比例1的支架移植于糖尿病皮肤损伤部位后21天内的皮肤愈合情况图和伤口面积比率，图4为将实施例1的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架和对比例1的支架移植于糖尿病皮肤损伤部位后第21天的组织学观察图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
第一方面，本发明提供了一种复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架的制备方法，该方法包括：制备胶原-壳聚糖多孔支架，并将胶原-壳聚糖多孔支架浸泡在Tβ4溶液中，得到复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架；然后将复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架依次进行化学交联处理和冷冻干燥处理。
本发明的制备方法中，对于制备胶原-壳聚糖多孔支架的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种制备方法。但是，本发明的发明人在研究中发现，在制备胶原-壳聚糖多孔支架时，控制胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的特定的浓度和胶原-壳聚糖溶液的pH值对包被的Tβ4的累积释放率有影响，因此，为了进一步提高制得的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架的Tβ4累积释放率，优选情况下，制备胶原-壳聚糖多孔支架的方法包括：配制胶原-壳聚糖溶液，使得胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的浓度均为1-5mg/mL，进一步优选均为2-3mg/mL；然后将胶原-壳聚糖溶液的pH值调节为6-7，进一步优选为6.2-6.4；再将胶原-壳聚糖溶液真空脱泡后注入模具中依次进行孵育处理和冷冻干燥处理。更进一步优选地，胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的浓度比为1:1。
本发明的制备方法中，对于配制胶原-壳聚糖溶液的溶剂没有特别的限定，可以为本领域常用的各种溶剂，优选情况下，所述溶剂为醋酸溶液，即，胶原-壳聚糖溶液为胶原-壳聚糖的醋酸溶液，进一步优选地，醋酸溶液中醋酸的浓度为0.01-1mol/L。
本发明的制备方法中，对于配制胶原-壳聚糖溶液的方法没有特别的限定，只要能够配制得到前述特定浓度的胶原-壳聚糖溶液即可，例如可以包括：分别将胶原粉末和壳聚糖粉末溶解于醋酸溶液中，配制2-10mg/mL优选3-7mg/mL的胶原溶液和2-10mg/mL优选3-7mg/mL的壳聚糖溶液，然后以适当的体积比例将两种溶液混合。
本发明的制备方法中，在制备胶原-壳聚糖多孔支架时，优选情况下，孵育处理的条件包括：温度为30-38℃，时间为25-40min。
本发明的制备方法中，在制备胶原-壳聚糖多孔支架时，优选情况下，冷冻干燥处理为先进行冷冻处理再进行干燥处理，冷冻处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为18-30h；干燥处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为8-18h。
本发明的制备方法中，为了进一步提高制得的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架的Tβ4累积释放率，优选情况下，Tβ4溶液的浓度为10-60ng/mL，进一步优选为25-35ng/mL。
本发明的制备方法中，为了进一步提高制得的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架的Tβ4累积释放率，优选情况下，浸泡的条件包括：温度为0-4℃，时间为18-30h。
本发明的制备方法中，优选情况下，化学交联处理的条件包括：将复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架浸泡于交联剂中，浸泡温度为20-30℃，浸泡时间为8-18h。对于交联剂没有特别的限定，可以为本领域常用的各种交联剂，优选地，所述交联剂为EDC/NHS交联剂。
本发明的制备方法中，在化学交联处理之后可以用去离子水洗涤支架2-4次，每次5-10min。
本发明的制备方法中，在将复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架进行冷冻干燥处理时，优选情况下，冷冻干燥处理为先进行冷冻处理再进行干燥处理，冷冻处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为18-30h；干燥处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为8-18h。
本发明的制备方法中，优选情况下，胶原的来源为猪、牛、羊、猴或鼠，进一步优选为牛，更进一步优选为牛肌腱。制备胶原粉末的方法可以为本领域技术人员所公知的各种方法，在此不再赘述。
本发明的制备方法中，本领域技术人员应该理解的是，所有操作均在无菌条件下进行。
第二方面，本发明提供了上述方法制备得到的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架。
第三方面，本发明提供了上述复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架在制备皮肤替代品中的应用。
本发明的应用中，对于皮肤替代品没有特别的限定，可以为本领域常用的各种皮肤替代品。
利用本发明的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架制备得到的皮肤替代品能够明显促进皮肤难愈合创面的再生、重构、修复与愈合，明显促进皮肤难愈合损伤部位新生血管的再生、再上皮化和减少炎症细胞浸润，以及明显促进真皮毛囊等附属结构再生和胶原重排，在最大程度上促进皮肤难愈合损伤部位皮肤结构和功能趋于正常化。
实施例
以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
以下实施例和对比例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例和对比例中所用的实验材料，如无特殊说明，均可市售获得。
壳聚糖粉末购自Sigma公司。
Tβ4购自ProSpec公司。
扫描电镜购自日本日立公司，型号为TM100。
EDC/NHS交联剂的配制方法为：将EDC、NHS分别溶于95％乙醇溶液中至浓度为33nmol/L和8nmol/L，得到EDC溶液和NHS溶液，然后将EDC溶液和NHS溶液等体积混合。
制备例
本制备例用于说明胶原粉末的提取方法。
(1)取新鲜牛肌腱10g，去除周围结缔组织，将牛肌腱剪成1-2mm大小的组织块。
(2)将组织块放入0.1％Na2CO3溶液中浸泡2h，蒸馏水漂洗3次，每次10min。
(3)将组织块放入含1mol/L NaCl的0.5％Tris-HCl(pH＝7.5)溶液中浸泡12h，蒸馏水漂洗3次，每次10min。
(4)将组织块放入250mL含500mg胃蛋白酶的0.05mol/L的醋酸溶液中，4℃浸泡72h，期间反复搅拌至充分消化成透明糊状。
(5)将混合液在4℃，5000g下离心20min，取上清。
(6)将步骤(5)中的离心沉淀再进行步骤(4)、(5)的操作，重复操作2次。
(7)向所得上清溶液中加入其体积1％的双氧水，4℃静置4h，去除沉淀杂质。
(8)向所得溶液中加入NaCl至沉淀不再析出，4℃静置12h。
(9)将混合液在4℃，5000g下离心20min，收集沉淀。
(10)将步骤(9)中的上清液再进行步骤(8)、(9)的操作一次。
(11)将所得沉淀溶解于100ml浓度为0.05mol/L的醋酸溶液中，用0.05mol/L醋酸溶液透析2天，再用超纯水透析3天，每天换液一次至胶原溶液中盐离子浓度为0.02-0.06mol/L之间。
(12)将透析后的所得溶液通过真空冷冻干燥机在-80℃下干燥24h，获得固体粉末胶原。
实施例1
本实施例用于说明本发明的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架的制备方法。
(1)将壳聚糖粉末和制备例制得的胶原粉末分别溶于0.05mol/L醋酸溶液中，得到浓度为5mg/mL的壳聚糖溶液和浓度为5mg/mL的胶原溶液。
(2)将2mL壳聚糖溶液和2mL胶原溶液混合均匀，获得胶原-壳聚糖溶液，然后用0.01mol/L的NaOH溶液调节胶原-壳聚糖溶液的pH值至6.3。
(3)将胶原-壳聚糖溶液搅拌均匀，真空脱泡后注入模具中，37℃孵育30min。
(4)-80℃冷冻24小时后，置于真空冷冻干燥机中-80℃冻干12h，得到胶原-壳聚糖多孔支架。
(5)将Tβ4溶于1×PBS中得到浓度为30ng/mL的Tβ4溶液，然后将冷冻干燥后的胶原-壳聚糖多孔支架浸泡于Tβ4溶液中，4℃放置24小时，得到复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架。
(6)将复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架浸泡于EDC/NHS交联剂中，25℃放置12h，用去离子水洗涤三次，每次5min。
(7)将水洗后的复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架于-80℃冷冻24小时后，再置于真空冷冻干燥机中-80℃冻干12h，即获得复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架。
实施例2
本实施例用于说明本发明的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架的制备方法。
(1)将壳聚糖粉末和制备例制得的胶原粉末分别溶于0.05mol/L醋酸溶液中，得到浓度为4mg/mL的壳聚糖溶液和浓度为6mg/mL的胶原溶液。
(2)将2mL壳聚糖溶液和2mL胶原溶液混合均匀，获得胶原-壳聚糖溶液，然后用0.01mol/L的NaOH溶液调节胶原-壳聚糖溶液的pH值至6.2。
(3)将胶原-壳聚糖溶液搅拌均匀，真空脱泡后注入模具中，38℃孵育25min。
(4)-70℃冷冻30小时后，置于真空冷冻干燥机中-90℃冻干8h，得到胶原-壳聚糖多孔支架。
(5)将Tβ4溶于1×PBS中得到浓度为25ng/mL的Tβ4溶液，然后将冷冻干燥后的胶原-壳聚糖多孔支架浸泡于Tβ4溶液中，3℃放置18小时，得到复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架。
(6)将复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架浸泡于EDC/NHS交联剂中，20℃放置18h，用去离子水洗涤三次，每次5min。
(7)将水洗后的复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架于-90℃冷冻18小时后，再置于真空冷冻干燥机中-70℃冻干18h，即获得复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架。
实施例3
本实施例用于说明本发明的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架的制备方法。
(1)将壳聚糖粉末和制备例制得的胶原粉末分别溶于0.05mol/L醋酸溶液中，得到浓度为6mg/mL的壳聚糖溶液和浓度为4mg/mL的胶原溶液。
(2)将2mL壳聚糖溶液和2mL胶原溶液混合均匀，获得胶原-壳聚糖溶液，然后用0.01mol/L的NaOH溶液调节胶原-壳聚糖溶液的pH值至6.4。
(3)将胶原-壳聚糖溶液搅拌均匀，真空脱泡后注入模具中，30℃孵育40min。
(4)-90℃冷冻18小时后，置于真空冷冻干燥机中-70℃冻干18h，得到胶原-壳聚糖多孔支架。
(5)将Tβ4溶于1×PBS中得到浓度为35ng/mL的Tβ4溶液，然后将冷冻干燥后的胶原-壳聚糖多孔支架浸泡于Tβ4溶液中，0℃放置30小时，得到复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架。
(6)将复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架浸泡于EDC/NHS交联剂中，30℃放置8h，用去离子水洗涤三次，每次5min。
(7)将水洗后的复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架于-70℃冷冻30小时后，再置于真空冷冻干燥机中-90℃冻干8h，即获得复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架。
实施例4
按照实施例1的方法，不同的是，步骤(5)中，将Tβ4溶于1×PBS中得到浓度为10ng/mL的Tβ4溶液，然后将冷冻干燥后的胶原-壳聚糖多孔支架浸泡于Tβ4溶液中。
实施例5
按照实施例1的方法，不同的是，步骤(5)中，将Tβ4溶于1×PBS中得到浓度为60ng/mL的Tβ4溶液，然后将冷冻干燥后的胶原-壳聚糖多孔支架浸泡于Tβ4溶液中。
实施例6
按照实施例1的方法，不同的是，步骤(2)中，将1mL壳聚糖溶液和3mL胶原溶液混合均匀，获得胶原-壳聚糖溶液。
实施例7
按照实施例1的方法，不同的是，步骤(2)中，将3mL壳聚糖溶液和1mL胶原溶液混合均匀，获得胶原-壳聚糖溶液。
实施例8
按照实施例1的方法，不同的是，步骤(2)中，用0.01mol/L的NaOH溶液调节胶原-壳聚糖溶液的pH值至6。
实施例9
按照实施例1的方法，不同的是，步骤(2)中，用0.01mol/L的NaOH溶液调节胶原-壳聚糖溶液的pH值至7。
对比例1
按照实施例1的方法，不同的是，步骤(2)-(5)为：
(3)将Tβ4溶于1×PBS中得到浓度为1mg/ml的储存液，然后将其逐滴加入步骤(2)的胶原-壳聚糖溶液中至Tβ4浓度为30ng/mL，得到复合Tβ4的胶原-壳聚糖溶液。
(4)将复合Tβ4的胶原-壳聚糖溶液搅拌均匀，真空脱泡后注入模具中，37℃孵育30min。
(5)-80℃冷冻24小时后，置于真空冷冻干燥机中-80℃冻干12h，得到复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架。
试验例1
对本发明的胶原-壳聚糖多孔支架和复合Tβ4胶原-壳聚糖组织工程支架的生物学性能和机械性能进行评估，评估内容和方法如下：
(1)本发明的胶原-壳聚糖多孔支架的宏观和微观结果评估。本发明的胶原-壳聚糖多孔支架的肉眼直观图片如图1(A)所示，扫描电镜下的实施例1、6和7的胶原-壳聚糖多孔支架的显微图片分别如图1(C)、图1(B)和图1(D)所示。
由图1(B)-(D)可以看出：本发明实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架的孔径为110-140μm、孔隙约为95％，为相互交联、高度均一的三维多孔网状结构；本发明实施例6的胶原-壳聚糖多孔支架的孔径为50-80μm、孔隙约为60％，为含有较多竖状纤维的三维多孔结构；本发明实施例7的胶原-壳聚糖多孔支架的孔径为190-220μm、孔隙约为80％，为不均匀的三维多孔片状结构。另外，本发明实施例2和3的胶原-壳聚糖多孔支架的孔径、孔隙和三维多孔结构与实施例1类似，在此不再赘述。本发明实施例8的胶原-壳聚糖多孔支架的孔径为70-90μm、孔隙约为75％，为不均匀的、含有部分竖状纤维的三维多孔结构；本发明实施例9的胶原-壳聚糖多孔支架的孔径为80-100μm、孔隙约为86％，为不均匀的、含有少量絮凝沉淀的三维多孔结构。即本发明的方法得到的胶原-壳聚糖多孔支架均具有合理的孔径、孔隙和三维多孔结构。将实施例1与实施例6-7进行比较可以看出，当胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的浓度均为2-3mg/mL时，得到的胶原-壳聚糖多孔支架具有更优的孔径、孔隙和三维多孔结构。将实施例1与实施例8-9进行比较可以看出，当将胶原-壳聚糖溶液的pH值调节为6.2-6.4时，得到的胶原-壳聚糖多孔支架具有更优的孔径、孔隙和三维多孔结构。
(2)对实施例1-9的胶原-壳聚糖多孔支架进行支架溶胀率测定，其中，以实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架的溶胀率的测定为例，测定方法包括：对实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架进行称重，计为W1，在室温下浸泡到去离子水中一定时间(如1、3、6、9、12天)，然后再称重，计为W2，计算支架溶胀率(％)＝(W2-W1)/W1×100％。
实施例1-9的胶原-壳聚糖多孔支架的溶胀率如表1所示，由表1数据可以看出：本发明的方法得到的胶原-壳聚糖多孔支架的溶胀性能良好，对水的平衡溶胀度达到25.8％-36.7％。将实施例1与实施例6-7进行比较可以看出，当胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的浓度均为2-3mg/mL时，得到的胶原-壳聚糖多孔支架具有更优的溶胀性能。将实施例1与实施例8-9进行比较可以看出，当将胶原-壳聚糖溶液的pH值调节为6.2-6.4时，得到的胶原-壳聚糖多孔支架具有更优的溶胀性能。
表1
(3)对实施例1-9的胶原-壳聚糖多孔支架进行支架降解率测定，其中，以实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架的降解率的测定为例，测定方法包括：对实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架进行称重，计为W1，在37℃将实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架置于含l mg/mL的I型胶原酶的1×PBS溶液中，一定时间后(如第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12天)取出支架，去离子水漂洗后烘干称重，计为W2，计算残余质量(％)＝W2/W1×100％。
实施例1-9的胶原-壳聚糖多孔支架的残余质量如表2所示。生物材料在体内的降解速度，应该满足细胞对支架的降解要求，以促进修复细胞的增殖及迁移。由表2可以看出，本发明的胶原-壳聚糖多孔支架均具有较为优良的生物降解性能以配合组织修复再生。将实施例1与实施例6-7进行比较可以看出，当胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的浓度均为2-3mg/mL时，得到的胶原-壳聚糖多孔支架具有更优的生物降解性能。将实施例1与实施例8-9进行比较可以看出，当将胶原-壳聚糖溶液的pH值调节为6.2-6.4时，得到的胶原-壳聚糖多孔支架具有更优的生物降解性能。
表2
(4)对实施例1-9的胶原-壳聚糖多孔支架进行机械性能测定，其中，以实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架的测定为例，测定方法包括：将实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架剪裁为40mm×5mm×0.3mm的条形，采用KES-G1材料试验机测试其干燥状态下的机械性能，拉伸速度为10mm/min。同时将实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架在去离子水中浸泡24h后取出，滤纸吸去表面水分后相同条件下测定支架在湿性状态下的机械性能。
本发明实施例1-9中的胶原-壳聚糖多孔支架在干燥状态和湿性状态的拉伸强度如表3所示。由表3中数据可知，本发明的方法得到的胶原-壳聚糖多孔支架均具有较好的机械性能，在干燥状态下，随着壳聚糖浓度的增加，支架材料的断裂程度逐渐增强，表明支架的机械性能逐渐增强；但在干燥及湿性两种状态进行对比后发现(干湿状态相差较少时比较好)，同时，将实施例1与实施例6-7进行比较可以看出，当胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的浓度均为2-3mg/mL时，得到的胶原-壳聚糖多孔支架的拉伸强度较大且干湿状态下可变范围较小，说明该支架具有更优良的柔韧度。将实施例1与实施例8-9进行比较可以看出，当将胶原-壳聚糖溶液的pH值调节为6.2-6.4时，得到的胶原-壳聚糖多孔支架的拉伸强度较大且干湿状态下可变范围较小，说明该支架具有更优良的柔韧度。
表3
| 干燥状态(G，MPa) | 湿性状态(G，MPa) | |
| 实施例1 | 2.28 | 1.49 |
| 实施例2 | 1.76 | 0.78 |
| 实施例3 | 1.41 | 0.49 |
| 实施例4 | 2.28 | 1.49 |
| 实施例5 | 2.28 | 1.49 |
| 实施例6 | 0.96 | 0.12 |
| 实施例7 | 1.63 | 0.63 |
| 实施例8 | 1.32 | 0.45 |
| 实施例9 | 1.26 | 0.33 |
(5)对实施例1-9得到的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架进行体外Tβ4释放实验，其中，以实施例1的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架为例，实验方法包括：将实施例1得到的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架浸泡于1mL的1×PBS溶液(pH＝7.4)中，置于37℃摇床，摇床转速为200转/分，在第0.5天时收集100μL释放液，并补充100μL新鲜的1×PBS溶液(pH＝7.4)至剩余的释放液中继续进行实验，在第1天时重新收集100μL释放液，并补充100μL新鲜的1×PBS溶液(pH＝7.4)至其剩余的释放液中继续进行实验，如此重复，直至收集到第12天时的收集100μL释放液，将前述方法定期(如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12天)收集的100μL释放液均保存在-20℃，最后统一用ELISA方法测定相应的100μL释放液中的Tβ4含量。测得的释放液中的Tβ4含量与复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架中含有的Tβ4含量(即4mL×30ng/mL)的比值即为Tβ4的累积释放率(％)。
实施例1-9得到的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架的Tβ4累积释放率如表4所示。将表4中数据可以看出，在炎症期(即皮肤损伤后第1-4天)和增殖期(即皮肤损伤后第5-12天)，本发明的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架具有较高的Tβ4累积释放率，能够较好的促进皮肤损伤部位的修复与再生。将实施例1与实施例4-5进行比较可以看出，当Tβ4溶液的浓度为25-35ng/mL时，能够进一步提高复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架Tβ4累积释放率，能够进一步促进皮肤损伤部位的修复与再生。将实施例1与实施例6-7进行比较可以看出，当胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的浓度均为2-3mg/mL时，能够进一步提高复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架Tβ4累积释放率，能够进一步促进皮肤损伤部位的修复与再生。将实施例1与实施例8-9进行比较可以看出，当将胶原-壳聚糖溶液的pH值调节为6.2-6.4时，能够进一步提高复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架Tβ4累积释放率，能够进一步促进皮肤损伤部位的修复与再生。
表4
试验例2
分别将实施例1得到的胶原-壳聚糖多孔支架(即单纯支架组)、实施例1得到的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架(即实验组)和对比例1得到的支架(即对照组)移植于糖尿病难愈合皮肤损伤部位(除支架不同外，其他条件均相同)，观察相应的损伤部位的愈合情况，同时对相同条件的损伤部位不进行任何处理，作为空白对照组进行对比。
(1)检测损伤部位在不同时间点愈合面积的动态变化。伤口面积比率(％)＝不同时间点的伤口面积/原始伤口面积×100％。
上述不同处理组在21天内的皮肤愈合情况图和伤口面积比率分别如图2和图3所示，结果显示：在移植后第7、14、21天，空白对照组的愈合面积分别仅为原始损伤面积的40.9％、71.1％和85.6％，而单纯支架组的愈合面积分别为原始损伤面积的67.5％、83.1％和89.7％，对照组的愈合面积分别为原始损伤面积的70.9％、88.9％.和93.5％，实验组的愈合面积分别高达原始损伤面积的73.2％、94.2％和98.4％。表明本发明的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架能够明显促进糖尿病难愈合皮肤损伤部位的愈合。
(2)分别取移植21天后的空白对照组、单纯支架组、实验组及对照组的皮肤损伤组织，于10％福尔马林溶液中固定24小时。将固定好的组织块进行脱水处理，放入石蜡进行包埋，包埋好的蜡块固定于切片机上，切成5-8微米厚的薄片，放于45℃恒温箱中烘干待用。分别进行苏木精-伊红染色，马松染色以及天狼猩红染色。电镜观察不同处理组损伤部位的皮肤病理学改变及胶原分布情况。
上述不同处理组在移植后第21天的糖尿病难愈合皮肤损伤部位的组织学观察图如图4所示。组织学观察显示在移植后第21天，本发明的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架能够明显促进损伤部位新生血管的再生、再上皮化和减少炎症细胞浸润，以及明显促进真皮毛囊等附属结构再生和胶原重排，在最大程度上促进损伤部位皮肤结构和功能趋于正常化。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架的制备方法，其特征在于，该方法包括：制备胶原-壳聚糖多孔支架，并将胶原-壳聚糖多孔支架浸泡在Tβ4溶液中，得到复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架；然后将复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架依次进行化学交联处理和冷冻干燥处理。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述制备胶原-壳聚糖多孔支架的方法包括：配制胶原-壳聚糖溶液，使得胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的浓度均为1-5mg/mL，优选均为2-3mg/mL；然后将胶原-壳聚糖溶液的pH值调节为6-7，优选为6.2-6.4；再将胶原-壳聚糖溶液真空脱泡后注入模具中依次进行孵育处理和冷冻干燥处理；
进一步优选地，所述胶原-壳聚糖溶液为胶原-壳聚糖的醋酸溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述孵育处理的条件包括：温度为30-38℃，时间为25-40min。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，Tβ4溶液的浓度为10-60ng/mL，优选为25-35ng/mL。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，浸泡的条件包括：温度为0-4℃，时间为18-30h。
6.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述化学交联处理的条件包括：将复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架浸泡于交联剂中，浸泡温度为20-30℃，浸泡时间为8-18h，优选地，所述交联剂为EDC/NHS交联剂。
7.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述冷冻干燥处理为先进行冷冻处理再进行干燥处理，冷冻处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为18-30h；干燥处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为8-18h。
8.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述胶原的来源为猪、牛、羊、猴或鼠，优选为牛，进一步优选为牛肌腱。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法制备得到的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架。
10.权利要求9所述的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架在制备皮肤替代品中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510241326.8A CN104874017B (zh) | 2015-05-13 | 2015-05-13 | 复合Tβ4的胶原‑壳聚糖组织工程支架及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510241326.8A CN104874017B (zh) | 2015-05-13 | 2015-05-13 | 复合Tβ4的胶原‑壳聚糖组织工程支架及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104874017A true CN104874017A (zh) | 2015-09-02 |
| CN104874017B CN104874017B (zh) | 2017-09-19 |
Family
ID=53941862
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510241326.8A Expired - Fee Related CN104874017B (zh) | 2015-05-13 | 2015-05-13 | 复合Tβ4的胶原‑壳聚糖组织工程支架及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104874017B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105816915A (zh) * | 2016-06-06 | 2016-08-03 | 中国人民解放军总医院 | 间充质干细胞组织工程支架及其制备方法和应用 |
| CN105833354A (zh) * | 2016-05-19 | 2016-08-10 | 中国人民解放军总医院 | 表皮片及其制备方法和应用 |
| CN108721690A (zh) * | 2018-06-14 | 2018-11-02 | 福州大学 | 一种药物缓释型抗菌敷料的制备方法及其产品 |
| CN109701065A (zh) * | 2019-01-03 | 2019-05-03 | 中国人民解放军总医院 | 一种包被小分子氯化锂的壳聚糖生物敷料的制备工艺 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006116989A2 (de) * | 2005-05-05 | 2006-11-09 | Hemoteq Ag | Vollflächige beschichtung von gefässstützen |
| CN102772822A (zh) * | 2011-05-10 | 2012-11-14 | 中国人民解放军军事医学科学院卫生装备研究所 | 胶原基质作为组织工程支架材料的应用 |
| CN103739869A (zh) * | 2013-12-25 | 2014-04-23 | 同济大学 | 一种交联壳聚糖/透明质酸复合多孔支架的制备方法 |
-
2015
- 2015-05-13 CN CN201510241326.8A patent/CN104874017B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006116989A2 (de) * | 2005-05-05 | 2006-11-09 | Hemoteq Ag | Vollflächige beschichtung von gefässstützen |
| CN102772822A (zh) * | 2011-05-10 | 2012-11-14 | 中国人民解放军军事医学科学院卫生装备研究所 | 胶原基质作为组织工程支架材料的应用 |
| CN103739869A (zh) * | 2013-12-25 | 2014-04-23 | 同济大学 | 一种交联壳聚糖/透明质酸复合多孔支架的制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| DONGDONG TI等: "Controlled Release of Thymosin Beta 4 Using a Collagen-Chitosan Sponge Scaffold Augments Cutaneous Wound Healing and Increases Angiogenesis in Diabetic Rats with Hindlimb Ischemia", 《TISSUE ENGINEERING：PART A》 * |
| LORAINE L.Y. CHIU等: "Controlled release of thymosin β4 using collagen–chitosan composite hydrogels promotes epicardial cell migration and angiogenesis", 《JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE》 * |
| 侯玉森等: "MSCs修复烧伤创面的研究进展", 《中国修复重建外科杂志》 * |
| 邱长虹等: "胶原-壳聚糖复合材料的制备及生物安全性检测", 《中国组织工程研究与临床康复》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105833354A (zh) * | 2016-05-19 | 2016-08-10 | 中国人民解放军总医院 | 表皮片及其制备方法和应用 |
| CN105816915A (zh) * | 2016-06-06 | 2016-08-03 | 中国人民解放军总医院 | 间充质干细胞组织工程支架及其制备方法和应用 |
| CN108721690A (zh) * | 2018-06-14 | 2018-11-02 | 福州大学 | 一种药物缓释型抗菌敷料的制备方法及其产品 |
| CN109701065A (zh) * | 2019-01-03 | 2019-05-03 | 中国人民解放军总医院 | 一种包被小分子氯化锂的壳聚糖生物敷料的制备工艺 |
| CN109701065B (zh) * | 2019-01-03 | 2020-07-17 | 中国人民解放军总医院 | 一种包被小分子氯化锂的壳聚糖生物敷料的制备工艺 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104874017B (zh) | 2017-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sivaraj et al. | Hydrogel scaffolds to deliver cell therapies for wound healing | |
| Catanzano et al. | Alginate–hyaluronan composite hydrogels accelerate wound healing process | |
| Sionkowska et al. | Preparation and characterization of silk fibroin/chitosan composite sponges for tissue engineering | |
| CN102961777B (zh) | 改性纳米纤维素多孔复合型高吸渗止血敷料的制备方法 | |
| CN104874017A (zh) | 复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架及其制备方法和应用 | |
| CN101020077A (zh) | 具有组织诱导性的胶原基体表创伤修复膜的制备方法 | |
| CN103083723B (zh) | 胶原/纳米纤维素皮肤再生材料及其制备方法与应用 | |
| Kangjian et al. | Preparation and characterization of collagen–chitosan–chondroitin sulfate composite membranes | |
| CN103223193B (zh) | 高强度丝素骨修复支架材料的制备方法 | |
| TW201442747A (zh) | 白蛋白組織支架 | |
| Ergun et al. | Decellularized liver ECM-based 3D scaffolds: compositional, physical, chemical, rheological, thermal, mechanical, and in vitro biological evaluations | |
| Wang et al. | Biogenetic acellular dermal matrix maintaining rich interconnected microchannels for accelerated tissue amendment | |
| CN104548200A (zh) | 一种制备高支化多糖-丝素水凝胶支架的方法 | |
| CN105816915A (zh) | 间充质干细胞组织工程支架及其制备方法和应用 | |
| CN106693082B (zh) | 一种抗凝血材料及其制备方法 | |
| Zehra et al. | Development of NSAID‐loaded nano‐composite scaffolds for skin tissue engineering applications | |
| Zhuang et al. | A poly (γ‐glutamic acid)‐based hydrogel loaded with superoxide dismutase for wound healing | |
| CN107715181A (zh) | 一种可生物降解的组织工程皮肤支架的制备方法 | |
| Rong et al. | Fetal milieu-simulating hyaluronic acid-dopamine-chondroitin sulfate hydrogel promoting angiogenesis and hair regeneration for wound healing | |
| Seifi et al. | A novel multifunctional chitosan-gelatin/carboxymethyl cellulose-alginate bilayer hydrogel containing human placenta extract for accelerating full-thickness wound healing | |
| Zhang et al. | Radiation cross-linked collagen/dextran dermal scaffolds: effects of dextran on cross-linking and degradation | |
| WO2017114902A1 (en) | Method for producing a decellularized tissue matrix | |
| CN105820267A (zh) | 一种皮肤创面修复制剂及其制备方法和应用 | |
| CN103495204B (zh) | 负载细胞外全基质的壳聚糖/纳米羟基磷灰石缓释微球及其制备方法 | |
| CN114191601A (zh) | 一种基于3d打印技术的淀粉凝胶止血材料及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170919 Termination date: 20210513 |