CN107602728B - 一种从鱼骨中提取硫酸软骨素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其经过以下步骤：（1）选取新鲜海洋鱼骨为原料，蒸煮，并且使用高压空气进行分离，得到鱼肉蛋白和鱼骨；（2）将步骤1得到的鱼骨进行清洗、粉碎，得到鱼骨粉末；（3）将步骤2得到的鱼骨粉末加入到酶解液中，加热，过滤得到清液；（4）将步骤3得到的清液中加入乙醇，收集沉淀物；（5）将步骤4中得到的沉淀物使用洗涤剂进行淋洗洗涤；（6）将步骤5中得到的沉淀物中加入水直到溶解，并且加入乙醇，收集沉淀物并且烘干。本发明采用酶解与洗涤法相结合得到的硫酸软骨素具有过敏性较低等优良特性。本发明的方法步骤合理、技术先进、操作可行，可适用于硫酸软骨素的提取中。

Description

一种从鱼骨中提取硫酸软骨素的方法

技术领域

本发明涉及硫酸软骨素的制备，尤其是一种从鱼骨中提取硫酸软骨素的方法。

背景技术

硫酸软骨素是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖，广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面，主要是治疗风湿和类风湿疾病的药物，也用作功能食品的主要原料，还具有抗癌、抗血栓、降血脂等作用。现在作为原料药出口到美国和欧洲很多国家，市场需求旺盛。国内生产企业大都以软骨为原料制备硫酸软骨素，生产的方法主要有三种：盐解法、碱解法和酶解法。使用较多的方法是采用稀碱或浓碱与酶解相结合的方法来提取硫酸软骨素，采用这种碱法酶解生产工艺存在步骤繁琐、周期较长，在高温蒸煮、碱提取、酶解和脱色过程中，硫酸软骨素受到严重破坏，产品收率偏低、乙醇耗量大，生产成本高。

另外，肉类市场的软骨价格上涨，需要找到一种新的原料来源。近年来水产品加工量增加，鱼骨的产量不断增加，废弃物给环境带来的压力也日趋显著。而从鱼骨中提取硫酸软骨素，既可以减轻环境压力，又提高水产品下脚料的附加值。

在硫酸软骨素的使用过程中，常发现服用者出现皮疹等现象。提取制备一种低过敏性的硫酸软骨素，是目前本领域内希望实现的。

发明内容

为了克服现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种步骤合理、技术先进、操作可行的从鱼骨中提取硫酸软骨素的方法。采用该方法提取的硫酸软骨素具有低过敏性。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种从鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于：所述的方法经过以下步骤：

（1）选取新鲜海洋鱼骨为原料，蒸煮20-40分钟，并且使用高压空气进行分离，得到鱼肉蛋白和鱼骨；

（2）将步骤1得到的鱼骨进行清洗、粉碎到平均粒径为0.1-0.5 mm，得到鱼骨粉末；

（3）将步骤2得到的鱼骨粉末加入到2-4倍重量酶解液中，所述的酶解液含有2000-4000U/mL的胰蛋白酶和4000-6000U/mL的木瓜蛋白酶，并且pH调节为8.5-9.5；随后酶解12-24小时，加热到75-85摄氏度，过滤得到清液；

（4）将步骤3得到的清液中加入乙醇使得乙醇的质量浓度达到70%，收集沉淀物；

（5）将步骤4中得到的沉淀物使用其重量0.5-1.5倍的洗涤剂进行淋洗洗涤，所述的洗涤剂中按重量计包括50-60%的乙醇，5-8%的柠檬酸，其余为水；

（6）将步骤5中得到的沉淀物中加入水直到溶解，并且加入乙醇直到乙醇质量浓度达到70%，收集沉淀物并且烘干。

在本发明优选的方面，在步骤1中，在蒸煮时，所述的蒸煮液中包含重量分数为3.5-5.0%的碳酸钠和3-5%的乙醇。

在本发明优选的方面，在步骤1中，在蒸煮时，所述的蒸煮液中包含重量分数为4.2%的碳酸钠和4.8%的乙醇

在本发明优选的方面，在步骤2中，将步骤1得到的鱼骨进行清洗、粉碎到平均粒径为0.3 mm，得到鱼骨粉末。

在本发明优选的方面，在步骤3中，将步骤2得到的鱼骨粉末加入到2.5倍重量酶解液中，所述的酶解液含有2400U/mL的胰蛋白酶和4800 U/mL的木瓜蛋白酶，并且pH调节为9.0；随后酶解20小时，加热到80摄氏度，过滤得到清液。

在本发明优选的方面，在步骤5中，将步骤4中得到的沉淀物使用其重量1.2倍的洗涤剂进行缓慢淋洗洗涤，所述的洗涤剂中按重量计包括50-60%的乙醇，5-8%的柠檬酸，其余为水。

在本发明优选的方面，在步骤5中，所述的洗涤剂中还包括按重量计3.5-5%的氯化钠和0.03-0.05%的三氟乙酸。

在本发明优选的方面，在步骤5中，所述的洗涤剂中还包括按重量计4.2%的氯化钠和0.04%的三氟乙酸

在本发明优选的方面，在步骤5中，在洗涤完毕之后还包括在减压条件下抽干的步骤。

在本发明优选的方面，在步骤1中，在蒸煮时，所述的蒸煮液中包含重量分数为4.2%的碳酸钠和4.8%的乙醇；在步骤5中，所述的洗涤剂中还包括按重量计4.2%的氯化钠和0.04%的三氟乙酸；在步骤5中，在洗涤完毕之后还包括在减压条件下抽干的步骤。

本发明采用酶解与洗涤法相结合，所得到的硫酸软骨素具有过敏性较低等优良特性，在医药领域具有广泛的应用前景。本发明的方法步骤合理、技术先进、操作可行，可适用于硫酸软骨素的提取中。

具体实施方式

除非另外地说明，本发明的胰蛋白酶活力为100万U/g，木瓜蛋白酶的活力为300万U/g，其均购自上海士锋生物科技有限公司。

实施例1

本实施例中，一种从鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其经过以下步骤：

（1）选取新鲜海洋鱼骨为原料，蒸煮35分钟，并且使用高压空气进行分离，得到鱼肉蛋白和鱼骨；

（2）将步骤1得到的鱼骨进行清洗、粉碎到平均粒径为0.3 mm，得到鱼骨粉末；

（3）将步骤2得到的鱼骨粉末加入到2.5倍重量酶解液中，所述的酶解液含有2400U/mL的胰蛋白酶和4800 U/mL的木瓜蛋白酶，并且pH调节为9.0；随后酶解20小时，加热到80摄氏度，过滤得到清液；

（4）将步骤3得到的清液中加入乙醇使得乙醇的质量浓度达到70%，收集沉淀物；

（5）将步骤4中得到的沉淀物使用其重量1.2倍的洗涤剂进行缓慢淋洗洗涤，所述的洗涤剂中按重量计包括50-60%的乙醇，5-8%的柠檬酸，其余为水；

（6）将步骤5中得到的沉淀物中加入水直到溶解，并且加入乙醇直到乙醇质量浓度达到70%，收集沉淀物并且烘干。经计算其产率相对于鱼骨重量为3.4%。

实施例2

本实施例中，一种从鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其经过以下步骤：

（1）选取新鲜海洋鱼骨为原料，蒸煮20分钟，并且使用高压空气进行分离，得到鱼肉蛋白和鱼骨；

（2）将步骤1得到的鱼骨进行清洗、粉碎到平均粒径为0.5 mm，得到鱼骨粉末；

（3）将步骤2得到的鱼骨粉末加入到2倍重量酶解液中，所述的酶解液含有4000U/mL的胰蛋白酶和6000U/mL的木瓜蛋白酶，并且pH调节为9.5；随后酶解24小时，加热到85摄氏度，过滤得到清液；

（4）将步骤3得到的清液中加入乙醇使得乙醇的质量浓度达到70%，收集沉淀物；

（5）将步骤4中得到的沉淀物使用其重量1.5倍的洗涤剂进行淋洗洗涤，所述的洗涤剂中按重量计包括50%的乙醇， 8%的柠檬酸，其余为水；

（6）将步骤5中得到的沉淀物中加入水直到溶解，并且加入乙醇直到乙醇质量浓度达到70%，收集沉淀物并且烘干。经计算其产率相对于鱼骨重量为2.7%。

实施例3

本实施例中，一种从鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其经过以下步骤：

（1）选取新鲜海洋鱼骨为原料，蒸煮40分钟，并且使用高压空气进行分离，得到鱼肉蛋白和鱼骨；

（2）将步骤1得到的鱼骨进行清洗、粉碎到平均粒径为0.1 mm，得到鱼骨粉末；

（3）将步骤2得到的鱼骨粉末加入到4倍重量酶解液中，所述的酶解液含有2000U/mL的胰蛋白酶和4000U/mL的木瓜蛋白酶，并且pH调节为8.5；随后酶解12小时，加热到75摄氏度，过滤得到清液；

（4）将步骤3得到的清液中加入乙醇使得乙醇的质量浓度达到70%，收集沉淀物；

（5）将步骤4中得到的沉淀物使用其重量0.5倍的洗涤剂进行淋洗洗涤，所述的洗涤剂中按重量计包括60%的乙醇，5%的柠檬酸，其余为水；

（6）将步骤5中得到的沉淀物中加入水直到溶解，并且加入乙醇直到乙醇质量浓度达到70%，收集沉淀物并且烘干。经计算其产率相对于鱼骨重量为3.2%。

实施例4

在本实施例中，方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤1中，所述的蒸煮液中包含重量分数为4.2%的碳酸钠和4.8%的乙醇。经计算其产率相对于鱼骨重量为3.8%。

实施例5

在本实施例中，方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤5中，所述的洗涤剂中还包括按重量计4.2%的氯化钠和0.04%的三氟乙酸。经计算其产率相对于鱼骨重量为2.1%。

实施例6

在本实施例中，方法和实施例1基本相同，其区别在于：

（1）在步骤1中，在蒸煮时，所述的蒸煮液中包含重量分数为4.2%的碳酸钠和4.8%的乙醇。

（2）在步骤5中，所述的洗涤剂中还包括按重量计4.2%的氯化钠和0.04%的三氟乙酸。

（3）在步骤5中，在洗涤完毕之后还包括在减压条件下抽干的步骤。

经计算其产率相对于鱼骨重量为1.8%。

对比例1

在本对比例中，条件和实施例1基本相同，其区别在于：不执行步骤5的洗涤步骤。经计算其产率相对于鱼骨重量为3.7%。

产品皮疹试验

在本试验中，进行了结果产品的皮疹试验。

首先，按照对比例1所述的方法制备得到硫酸软骨素成品，然后招募了96名已知口服硫酸软骨素时出现皮疹的受试者，并且使其按照每人400mg的量进行口服。在2小时之内出现明显皮疹的受试者有89人，作为后续试验的人员。

将以上的89人分为6组（因为对比例1全部都过敏，因此无需设置其试验组），其中组1-5有15人，组6有14人。在以上的89人经历3天休息，皮疹完全消除之后，分别给予实施例1-6的硫酸软骨素产品400mg，其过敏情况如表1所示：

表1：实施例1-6的硫酸软骨素产品的过敏特性

组号	过敏人数
		实施例1	5
实施例2	6
		实施例3	5
实施例4	6
		实施例5	2
实施例6	0

在表1中可以看到，实施例1-3的方法所得到的硫酸软骨素产品具有一定的降低过敏的功效，其中只有不到半数的人员有过敏经历。而实施例5-6中，在经历了优选的洗涤剂洗涤之后，过敏人数进一步提高。在实施例6中，完全避免了过敏现象的发生。

为了进一步试验实施例6的过敏人员。在进行了以上实验之后的7天，将89名受试者中的85人重新募集（其中有4名受试者由于反复出现皮疹，谢绝了此后的试验），并且分为3组，分别有28人、28人和29人，并且分别进行了实施例1、5和6的口服试验，口服条件和上一次试验相同。发现口服实施例1的硫酸软骨素的受试者有11人发生了皮疹现象，口服实施例5的硫酸软骨素的受试者有5人发生了皮疹现象，而口服实施例6的硫酸软骨素的受试者没有发生皮疹现象。

Claims (6)

1.一种从鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于：所述的方法经过以下步骤：

（1）选取新鲜海洋鱼骨为原料，蒸煮20-40 分钟，并且使用高压空气进行分离，得到鱼肉蛋白和鱼骨；

（2）将步骤1 得到的鱼骨进行清洗、粉碎到平均粒径为0.1-0.5 mm，得到鱼骨粉末；

（3）将步骤2 得到的鱼骨粉末加入到2-4 倍重量酶解液中，所述的酶解液含有2000-4000U/mL 的胰蛋白酶和4000-6000U/mL 的木瓜蛋白酶，并且pH 调节为8.5-9.5；随后酶解12-24 小时，加热到75-85 摄氏度，过滤得到清液；

（4）将步骤3 得到的清液中加入乙醇使得乙醇的质量浓度达到70%，收集沉淀物；

（5）将步骤4 中得到的沉淀物使用其重量0.5-1.5 倍的洗涤剂进行淋洗洗涤，所述的洗涤剂中按重量计包括50-60%的乙醇，5-8%的柠檬酸，其余为水；

（6）将步骤5 中得到的沉淀物中加入水直到溶解，并且加入乙醇直到乙醇质量浓度达到70%，收集沉淀物并且烘干；其中，

在步骤1中，在蒸煮时，所述的蒸煮液中包含重量分数为3.5-5.0%的碳酸钠和3-5%的乙醇；

在步骤5中，所述的洗涤剂中还包括按重量计3.5-5%的氯化钠和0.03-0.05%的三氟乙酸。

2.根据权利要求1 所述的一种从鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于：在步骤1中，在蒸煮时，所述的蒸煮液中包含重量分数为4.2%的碳酸钠和4.8%的乙醇。

3.根据权利要求1 所述的一种从鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于：在步骤2中，将步骤1 得到的鱼骨进行清洗、粉碎到平均粒径为0.3 mm，得到鱼骨粉末。

4.根据权利要求1 所述的一种从鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于：在步骤3中，将步骤2 得到的鱼骨粉末加入到2.5 倍重量酶解液中，所述的酶解液含有2400U/mL的胰蛋白酶和4800 U/mL 的木瓜蛋白酶，并且pH 调节为9.0；随后酶解20小时，加热到80摄氏度，过滤得到清液。

5.根据权利要求1 所述的一种从鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于：在步骤5中，在洗涤完毕之后还包括在减压条件下抽干的步骤。

6.根据权利要求1 所述的一种从鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于：在步骤1中，在蒸煮时，所述的蒸煮液中包含重量分数为4.2%的碳酸钠和4.8%的乙醇；在步骤3中，所述的洗涤剂中还包括按重量计4.2%的氯化钠和0.04%的三氟乙酸；在步骤5 中，在洗涤完毕之后还包括在减压条件下抽干的步骤。