CN107723331B - 一种从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物提取技术领域，具体涉及到一种从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺，包括以下步骤S1脱矿：对鱼鳞进行酸解；S2脱脂：表面活性剂与碱联合处理；S3蒸煮；S4膨胀处理；S5发酵：产蛋白酶菌种培养进行蛋白质分解；本发明工艺简单，解决现有技术中存在的提取胶原蛋白杂质多，收率低等不足，提取的胶原蛋白分子量小，并且提取得到的胶原蛋白收率高，纯度高，并且将其应用到鱼饲料中得到的鱼肉质量好。

Description

一种从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺
技术领域
本发明属于生物提取技术领域，具体涉及到一种从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺。
背景技术
近年来，鱼制品产业越来越广泛，大多数的淡水鱼加工过程仅局限于对鱼体肌肉的利用，而对鱼鳞等废弃物的加工利用甚少，鱼鳞是鱼体与外界接触的组织，是鱼类真皮层的变形物，通常占鱼体重量的1％～5％，起保护鱼体免受伤害的作用。鱼鳞主要由蛋白质，卵磷脂，羟基磷灰石和鸟嘌呤组成，其中有机物占41％-55％，钙盐38％-46％，其中鱼鳞中含有丰富的蛋白质成分，主要为胶原蛋白和鱼鳞角蛋白，若是将鱼鳞加以利用，可有效减少环境污染，又可提高企业效益，因此加大对鱼鳞含有物质的利用，可应用多个行业，其利用价值巨大，发展前景广阔。
鱼鳞中含有的胶原蛋白若是应用在鱼饲料中，既有利于提高饲养鱼肉产量，又有利于提高鱼肉的质量，鱼鳞胶原蛋白主要为I型胶原，I型胶原蛋白为三股超螺旋结构，即三条多肽链每条都向左旋转形成左手螺旋结构，这三条肽链再以氢键相互结合形成右手超螺旋结构；这种结构非常稳定，胶原一般不溶于水和中性盐溶液、稀酸、稀碱及一般有机溶剂，溶于强酸和强碱。因此，鱼鳞中胶原蛋白的提取工艺是目前鱼产品加工业的研究热点。
公告号为CN104012747B的中国专利公开了一种鱼鳞胶原蛋白的提取方法及相关食品的制备方法。该发明的鱼鳞胶原蛋白的提取方法，采用浸酸、浸碱、微波处理和热水提取相结合，提高了胶原蛋白的溶出率和纯度，有效地去除了鱼腥味，且得到的胶原蛋白的分子量分布集中，90％以上在1000至2000道尔顿之间，水溶性好，易于被人体吸收。
公开号为CN104726527A的中国专利申请公开了一种鱼鳞酶解生产胶原蛋白的制备工艺，包括以下步骤：(1)清洗，(2)碱处理，(2)脱钙，(4)蒸煮，(5)冷却，(6)一道酶解，(7)二道酶解，(8)鱼鳞胶原蛋白液酵母发酵，(9)活性炭吸附反应，(10)过滤，(11)浓缩，(12)灭菌，(13)喷雾干燥。该发明所提供的方法不仅可从鱼鳞中获得高含量低分子组分胶原蛋白肽，而且去除影响胶原蛋白产品外观的色素类物质，减轻胶原蛋白特有的鱼腥鱼臭味，提高了鱼类胶原蛋白产品的产品价值。
上述两种提取方法中都只是简单的酸碱或是蒸煮处理，但是鱼鳞中羟基磷灰石、蛋白质与其他物质之间已经形成网状结构，简单的酸碱处理并不能除去羟基磷灰石等其他物质，直接导致蛋白纯度低，影响产品质量。
发明内容
为了解决现有技术中存在的不足，本发明公开了一种从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺，本发明工艺简单，提取得到的胶原蛋白收率高，纯度高。
本发明技术方案如下所述：
一种从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺，步骤为：
S1脱矿：将鱼鳞洗净、干燥、粉碎至粒径为150-200目，加入到40-50倍质量的混合酸溶液中，超声波反应40-50min，过滤，并用水洗涤至滤液pH值至6.5-6.8，滤渣干燥，得酸水解鱼鳞粉A；
S2脱脂：将步骤S1得到的酸水解鱼鳞粉A加入质量分数5-7％的非离子表面活性剂溶液中，超声波反应3-5h，过滤，将滤渣放入质量分数0.5-1％的氢氧化钠溶液中，25-35℃静置浸泡8-12小时，过滤，并使用水洗涤至滤液pH值至7.2-7.5，滤渣干燥，得到水解鱼鳞粉B；
S3蒸煮：将步骤S2得到的水解鱼鳞粉B与8-10倍质量的水混合，在100-105℃温度下蒸煮20-30min，冷却至室温，过滤得到鱼鳞黏浆C；
S4膨胀处理：将步骤S3得到的鱼鳞黏浆C与10-12倍质量的膨胀溶剂混合，60-70℃水浴加热30-40min，得到浆液D；
S5发酵：将步骤S4得到的浆液D与混合菌培养液混合均匀，在35℃温度下发酵48-60h，然后123-125℃高温灭菌，冷却至50-55℃，去渣，上清液干燥即得。
进一步的，步骤S1中混合酸溶液由以下浓度的成分组成：0.05-0.1mol/L柠檬酸、0.05-0.08mol/L丁二酸、0.03-0.05mol/L乙酸、0.05-0.1mol/L乳酸和0.05-0.1mol/L盐酸。
进一步的，步骤S2中酸水解鱼鳞粉A、非离子表面活性剂溶液和氢氧化钠溶液的物料比为1g:8-10ml:12-15ml。
进一步的，所述的非离子表面活性剂由S-12蔗糖酯与丙二醇脂肪酸酯按重量比4-6:1组成。
进一步的，步骤S4中所述的膨胀溶剂由以下浓度的成分组成：3-5g/L碳酸氢钠、1-3g/L碳酸钠和0.5-1g/L甘油单酯。
进一步的，步骤S5中浆液D与混合菌培养液的体积比为8-12:1。
进一步的，所述的混合菌培养液的制备方法为：将枯草芽胞杆菌、啤酒酵母菌分别以2×108cfu/mL、5×107cfu/mL的密度接种在液体培养基中，在温度为30-35℃条件下培养20-24h，即得。
进一步的，所述的液体培养基的配方为：2.5-3.5g/L葡萄糖、8-12g/L蛋白胨、2-4g/L酵母膏、5-10g/L甘油、1-2g/L山梨醇、2-4g/L磷酸二氢钾、0.3-0.7g/L硫酸锰、0.2-0.4g/L硫酸亚铁。
本发明采用了S1脱矿-S2脱脂-S3蒸煮-S4膨胀处理-发酵的提取工艺，S1主要是对鱼鳞进行酸解，使用的是有机酸与无机酸的混合酸溶液，其中无机酸可以有效地去除羟基磷灰石，而有机酸可以通过亲油基对鱼鳞中羟基磷灰石与蛋白质等其他物质形成的网状结构进行破坏，加速溶解内部的羟基磷灰石，这对于本领域的技术人员是难以想象到的。
本发明公开的工艺中步骤S2首先对S1得到产物进行非离子表面活性剂的处理，主要目的是为了使蛋白质与其他物质的交联结构松动，降低物质间作用力，但是并不是所有的非离子表面活性剂具有这些功能。本发明人经过深度研究意外发现S-12蔗糖酯与丙二醇脂肪酸酯配合协同作用，不仅仅可以明显达到我们的目的，更为重要的是为后续油脂的去除与鱼鳞中间产物的膨胀处理提供有利条件。取得了意料不到的技术效果。
本发明公开的步骤S4中对蒸煮后的鱼鳞黏浆进行了膨胀处理，主要是为了对蛋白质进行扩孔处理，有利于后续发酵酶解反应生成小分子多肽。
本发明步骤S5使用产蛋白酶菌株进行发酵处理，安全性高，产率与纯度高，其中发酵过程中意外引入了枯草芽胞杆菌、啤酒酵母菌，均可以产生蛋白酶成分，其中枯草芽胞杆菌在发酵过程中产生的蛋白酶含量及蛋白酶对鱼鳞中蛋白酶的酶解效果均远远大于啤酒酵母，但是啤酒酵母可以在发酵过程中产生二氧化碳，使发酵体系膨胀，使鱼鳞中蛋白交联结构疏松，进一步增加蛋白酶对蛋白质的接触与分解，产生的蛋白质肽链长度降低，提高蛋白质断链效果，取得了意料不到的技术效果。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)胶原多肽分子量小，本发明公开的从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺提取得到的胶原蛋白分子量70％以上小于800道尔顿，95％胶原蛋白以上分子量在2000道尔顿以内；(2)提取率高，本发明公开的从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺提取得到的胶原蛋白收率高，为鱼鳞干重的66-70％；(3)纯度高，本发明公开的从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺提取得到的胶原蛋白经焙烧后得到的灰分小，灰分含量小于0.2％。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的说明，使本领域技术人员更加理解本发明技术方案，本发明使用原料鱼鳞为草鱼鳞。
实施例1一种从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺
所述的工艺步骤为：
S1脱矿：将鱼鳞洗净、干燥、粉碎至粒径为180目，加入到45倍质量的混合酸溶液中，超声波反应45min，过滤，并用水洗涤至滤液pH值至6.7，滤渣干燥，得酸水解鱼鳞粉A；
S2脱脂：将步骤S1得到的酸水解鱼鳞粉A加入质量分数6％的非离子表面活性剂溶液中，超声波反应4h，过滤，将滤渣放入质量分数0.7％的氢氧化钠溶液中，30℃静置浸泡10小时，过滤，并使用水洗涤至滤液pH值至7.3，滤渣干燥，得到水解鱼鳞粉B；其中，酸水解鱼鳞粉A、非离子表面活性剂溶液和氢氧化钠溶液的物料比为1g:9ml:13ml；非离子表面活性剂由S-12蔗糖酯与丙二醇脂肪酸酯按重量比5:1组成；
S3蒸煮：将步骤S2得到的水解鱼鳞粉B与9倍质量的水混合，在103℃温度下蒸煮25min，冷却至室温，过滤得到鱼鳞黏浆C；
S4膨胀处理：将步骤S3得到的鱼鳞黏浆C与11倍质量的膨胀溶剂混合，65℃水浴加热35min，得到浆液D；所述的膨胀溶剂由以下浓度的成分组成：4g/L碳酸氢钠、2g/L碳酸钠和0.7g/L甘油单酯；
S5发酵：将步骤S4得到的浆液D与混合菌培养液按体积比10:1混合均匀，在35℃温度下发酵54h，然后124℃高温灭菌，冷却至53℃，去渣，上清液干燥即得；
其中，步骤S1中混合酸溶液由以下浓度的成分组成：0.07mol/L柠檬酸、0.06mol/L丁二酸、0.04mol/L乙酸、0.08mol/L乳酸和0.08mol/L盐酸；
步骤S4中混合菌培养液的制备方法为：将枯草芽胞杆菌、啤酒酵母菌分别以2×108cfu/mL、5×107cfu/mL的密度接种在液体培养基中，在温度为33℃条件下培养22h，即得；液体培养基的配方为：3g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨、3g/L酵母膏、7g/L甘油、1.5g/L山梨醇、3g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸锰、0.3g/L硫酸亚铁。
实施例2一种从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺
所述的工艺步骤为：
S1脱矿：将鱼鳞洗净、干燥、粉碎至粒径为150目，加入到40倍质量的混合酸溶液中，超声波反应40min，过滤，并用水洗涤至滤液pH值至6.5，滤渣干燥，得酸水解鱼鳞粉A；
S2脱脂：将步骤S1得到的酸水解鱼鳞粉A加入质量分数5％的非离子表面活性剂溶液中，超声波反应3h，过滤，将滤渣放入质量分数0.5％的氢氧化钠溶液中，25℃静置浸泡8小时，过滤，并使用水洗涤至滤液pH值至7.2，滤渣干燥，得到水解鱼鳞粉B；其中，酸水解鱼鳞粉A、非离子表面活性剂溶液和氢氧化钠溶液的物料比为1g:8ml:12ml；非离子表面活性剂由S-12蔗糖酯与丙二醇脂肪酸酯按重量比4:1组成；
S3蒸煮：将步骤S2得到的水解鱼鳞粉B与8倍质量的水混合，在100℃温度下蒸煮20min，冷却至室温，过滤得到鱼鳞黏浆C；
S4膨胀处理：将步骤S3得到的鱼鳞黏浆C与10倍质量的膨胀溶剂混合，60℃水浴加热30min，得到浆液D；所述的膨胀溶剂由以下浓度的成分组成：3g/L碳酸氢钠、1g/L碳酸钠和0.5g/L甘油单酯；
S5发酵：将步骤S4得到的浆液D与混合菌培养液按体积比8:1混合均匀，在35℃温度下发酵48h，然后123℃高温灭菌，冷却至50℃，去渣，上清液干燥即得；
其中，步骤S1中混合酸溶液由以下浓度的成分组成：0.05mol/L柠檬酸、0.05mol/L丁二酸、0.03mol/L乙酸、0.05mol/L乳酸和0.1mol/L盐酸；
步骤S4中混合菌培养液的制备方法为：将枯草芽胞杆菌、啤酒酵母菌分别以2×108cfu/mL、5×107cfu/mL的密度接种在液体培养基中，在温度为30℃条件下培养20h，即得；液体培养基的配方为：2.5g/L葡萄糖、8g/L蛋白胨、2g/L酵母膏、5g/L甘油、1g/L山梨醇、2g/L磷酸二氢钾、0.3g/L硫酸锰、0.2g/L硫酸亚铁。
实施例3一种从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺
所述的工艺步骤为：
S1脱矿：将鱼鳞洗净、干燥、粉碎至粒径为200目，加入到50倍质量的混合酸溶液中，超声波反应50min，过滤，并用水洗涤至滤液pH值至6.8，滤渣干燥，得酸水解鱼鳞粉A；
S2脱脂：将步骤S1得到的酸水解鱼鳞粉A加入质量分数7％的非离子表面活性剂溶液中，超声波反应5h，过滤，将滤渣放入质量分数1％的氢氧化钠溶液中，35℃静置浸泡12小时，过滤，并使用水洗涤至滤液pH值至7.5，滤渣干燥，得到水解鱼鳞粉B；其中，酸水解鱼鳞粉A、非离子表面活性剂溶液和氢氧化钠溶液的物料比为1g:10ml:15ml；非离子表面活性剂由S-12蔗糖酯与丙二醇脂肪酸酯按重量比6:1组成；
S3蒸煮：将步骤S2得到的水解鱼鳞粉B与10倍质量的水混合，在105℃温度下蒸煮30min，冷却至室温，过滤得到鱼鳞黏浆C；
S4膨胀处理：将步骤S3得到的鱼鳞黏浆C与12倍质量的膨胀溶剂混合，70℃水浴加热40min，得到浆液D；所述的膨胀溶剂由以下浓度的成分组成：5g/L碳酸氢钠、3g/L碳酸钠和1g/L甘油单酯；
S5发酵：将步骤S4得到的浆液D与混合菌培养液按体积比12:1混合均匀，在35℃温度下发酵60h，然后125℃高温灭菌，冷却至55℃，去渣，上清液干燥即得；
其中，步骤S1中混合酸溶液由以下浓度的成分组成：0.1mol/L柠檬酸、0.08mol/L丁二酸、0.05mol/L乙酸、0.1mol/L乳酸和0.05mol/L盐酸；
步骤S4中混合菌培养液的制备方法为：将枯草芽胞杆菌、啤酒酵母菌分别以2×108cfu/mL、5×107cfu/mL的密度接种在液体培养基中，在温度为35℃条件下培养24h，即得；液体培养基的配方为：3.5g/L葡萄糖、12g/L蛋白胨、4g/L酵母膏、10g/L甘油、2g/L山梨醇、4g/L磷酸二氢钾、0.7g/L硫酸锰、0.4g/L硫酸亚铁。
对比例1一种从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺
所述的工艺步骤为：步骤S1、S3、S4、S5同实施例1；
与实施例1的区别是S2不使用非离子表面活性剂处理，具体为：S2脱脂：将步骤S1得到的酸水解鱼鳞粉A放入质量分数0.7％的氢氧化钠溶液中，30℃静置浸泡10小时，过滤，并使用水洗涤至滤液pH值至7.3，滤渣干燥，得到水解鱼鳞粉B；其中，酸水解鱼鳞粉A、氢氧化钠溶液的物料比为1g:13ml。
对比例2一种从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺
与实施例1的区别是步骤S2中使用的非离子表面活性剂为S-12蔗糖酯，其他同实施例1。
对比例3一种从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺
所述的工艺步骤为：步骤S1、S2、S3、S5同实施例1；
与实施例1的区别是步骤S4改为：S4膨胀处理：将步骤S3得到的鱼鳞黏浆C与11倍质量的水混合，65℃水浴加热35min，得到浆液D。
试验例1、产物检测
1.1灰分含量计算
试验对象：采用实施例1-3与对比例1-2从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺得到的胶原蛋白；
试验方法：称取制得的胶原蛋白质量m1，将得到的胶原蛋白500℃焙烧，称取得到的灰分质量m2，计算得到的胶原蛋白的灰分含量，计算方法为m2/m1×100％，具体如表1所示。
表1灰分含量
组别 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2
灰分含量 0.15％ 0.18％ 0.20％ 0.42％ 0.33％
从表1中可以看出，采用本发明实施例1-3提取得到的胶原蛋白中灰分的含量低，说明本发明提取方法可以有效的去除鱼鳞中的羟基磷灰石与其他无机元素，提高产品质量。
1.2收率计算
试验对象：采用实施例1-3从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺得到的胶原蛋白；
试验方法：称取鱼鳞质量m3，制得的胶原蛋白的质量m1，将得到的胶原蛋白500℃焙烧，称取得到的灰分质量m2，计算得到的胶原蛋白的收率，计算方法为(m1-m2)/m3×100％，具体如表2所示。
表2胶原蛋白收率
组别 实施例1 实施例2 实施例3
收率 70％ 67％ 66％
从表2中可以看出，采用本发明实施例1-3提取得到的胶原蛋白收率高。
试验例2、分子量检测
试验对象：采用实施例1-3与对比例1-3从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺得到的胶原蛋白；
试验方法：将胶原蛋白溶于20倍质量的水中，然后使用膜分离得到分子量小于500道尔顿，分子量小于800道尔顿，分子量小于1300道尔顿，分子量小于2000道尔顿的胶原蛋白多肽，干燥后称取并计算不同分子量的百分比，具体如表3所示。
表3成分分子量占比(分子量单位：道尔顿)
组别 <500 500-800 800-1300 1300-2000 >2000
实施例1 56％ 23％ 12％ 8％ 1％
实施例2 52％ 20％ 13％ 13％ 4％
实施例3 50％ 21％ 11％ 13％ 5％
对比例1 39％ 16％ 12％ 23％ 10％
对比例2 44％ 18％ 10％ 21％ 7％
对比例3 42％ 16％ 9％ 25％ 8％
从表3中可以看出，本发明采用实施例的工艺提取的胶原蛋白分子量70％以上小于800道尔顿，95％胶原蛋白以上分子量在2000道尔顿以内，与对比例1-3相比，本发明实施例1-3得到的胶原蛋白分子量分布在800道尔顿以内的含量较高，而分子量大于800道尔顿的含量较低，说明采用本发明制备得到的胶原蛋白肽链短，将其应用在食品或是饲料产业更有利于产品的吸收，其中实施例1是本发明的最佳实施例，胶原蛋白分子量最低。
试验例3、应用效果
试验对象：采用实施例1-3与对比例1-3从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺得到的胶原蛋白；
试验方法：将人工驯养后的笋壳鱼放养在试验鱼塘中，条件为pH为5的酸性水体和盐度为1％的咸淡水中生长，使用95％基础饲料+5％胶原蛋白喂养(基础饲料：墨鱼粉55％，豆柏9％，面粉6％，虾糠粉20％，啤酒酵母5％，氯化胆碱0.2％，鱼油4.8％)，每日投喂量为鱼体重的2％，喂养2个月后，将养殖得到的笋壳鱼肉质蛋白质和灰分的含量进行分析，具体见表4所示。
表4笋壳鱼肉质含量
从表4中可以看出，实施例1-3的蛋白含量明显高于对比例1-3，灰分含量明显低于对比例1-3，说明了采用本发明工艺制得的胶原蛋白质量高，将其应用在饲料中喂养得到的笋壳鱼肉质营养价值高，灰分的减少降低了肉质的泥腥味，提高鱼肉品质，其中实施例1是本发明的最佳实施例，喂养后得到的鱼肉蛋白含量更高，灰分更少。

Claims (3)

1.一种从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺，其特征在于，步骤为：
S1脱矿：将鱼鳞洗净、干燥、粉碎至粒径为150-200目，加入到40-50倍质量的混合酸溶液中，超声波反应40-50min，过滤，并用水洗涤至滤液pH值至6.5-6.8，滤渣干燥，得酸水解鱼鳞粉A；
S2脱脂：将步骤S1得到的酸水解鱼鳞粉A加入质量分数5-7%的非离子表面活性剂溶液中，超声波反应3-5h，过滤，将滤渣放入质量分数0.5-1%的氢氧化钠溶液中，25-35℃静置浸泡8-12小时，过滤，并使用水洗涤至滤液pH值至7.2-7.5，滤渣干燥，得到水解鱼鳞粉B；
S3蒸煮：将步骤S2得到的水解鱼鳞粉B与8-10倍质量的水混合，在100-105℃温度下蒸煮20-30min，冷却至室温，过滤得到鱼鳞黏浆C；
S4膨胀处理：将步骤S3得到的鱼鳞黏浆C与10-12倍质量的膨胀溶剂混合，60-70℃水浴加热30-40min，得到浆液D；
S5发酵：将步骤S4得到的浆液D与混合菌培养液混合均匀，在35℃温度下发酵48-60h，然后123-125℃高温灭菌，冷却至50-55℃，去渣，上清液干燥即得；
所述步骤S1中混合酸溶液由以下浓度的成分组成：0.05-0.1mol/L柠檬酸、0.05-0.08mol/L丁二酸、0.03-0.05mol/L乙酸、0.05-0.1mol/L乳酸和0.05-0.1mol/L盐酸；
所述的非离子表面活性剂由S-12蔗糖酯与丙二醇脂肪酸酯按重量比4-6:1组成；
所述步骤S4中所述的膨胀溶剂由以下浓度的成分组成：3-5g/L碳酸氢钠、1-3g/L碳酸钠和0.5-1g/L甘油单酯；
所述的混合菌培养液的制备方法为：将枯草芽胞杆菌、啤酒酵母菌分别以2×108cfu/mL、5×107cfu/mL的密度接种在液体培养基中，在温度为30-35℃条件下培养20-24h，即得；
所述的液体培养基的配方为：2.5-3.5g/L葡萄糖、8-12g/L蛋白胨、2-4g/L酵母膏、5-10g/L甘油、1-2g/L山梨醇、2-4g/L磷酸二氢钾、0.3-0.7g/L硫酸锰、0.2-0.4g/L硫酸亚铁。
2.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺，其特征在于，步骤S2中酸水解鱼鳞粉A、非离子表面活性剂溶液和氢氧化钠溶液的物料比为1g:8-10ml:12-15ml。
3.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺，其特征在于，步骤S5中浆液D与混合菌培养液的体积比为8-12:1。
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