CN113151385B - 一种制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法 - Google Patents
一种制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113151385B CN113151385B CN202110394971.9A CN202110394971A CN113151385B CN 113151385 B CN113151385 B CN 113151385B CN 202110394971 A CN202110394971 A CN 202110394971A CN 113151385 B CN113151385 B CN 113151385B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- enzymolysis
- cartilage
- solution
- livestock
- collecting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 title claims abstract description 53
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 48
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 48
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 244000144972 livestock Species 0.000 title claims abstract description 32
- 244000144977 poultry Species 0.000 title claims abstract description 26
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 25
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 25
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 25
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 21
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 20
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 14
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 14
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 13
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 13
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 7
- 238000005185 salting out Methods 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 4
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 claims description 4
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 claims description 3
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 claims description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 3
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 claims description 3
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 238000007872 degassing Methods 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 3
- 108091005508 Acid proteases Proteins 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 5
- 239000002699 waste material Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 7
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 5
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 4
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000010025 steaming Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002567 Chondroitin Polymers 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 208000006735 Periostitis Diseases 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N chondroitin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@H](O)C=C(C(O)=O)O1 DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000003460 periosteum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 208000032041 Hearing impaired Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 238000007696 Kjeldahl method Methods 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000002639 bone cement Substances 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000005237 degreasing agent Methods 0.000 description 1
- 239000013527 degreasing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 125000000600 disaccharide group Chemical group 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000003 hoof Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000000552 rheumatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000000515 tooth Anatomy 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种高效制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法。本发明所述畜禽软骨胶原蛋白的制备方法，在传统制备软骨胶原蛋白方法的基础上，进一步通过对酶解过程中提取压力的调整控制，通过微负压和常压提取交替进行的方式，可有效提高胶原蛋白的提取效率，进一步提高了软骨废料的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种高效制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法。
背景技术
我国畜牧业大国，尤其是随着畜禽养殖的迅猛发展，副产物随之大量增加，这些副产物的深加工必须跟上养殖业的发展步伐，才能提高畜禽养殖的经济效益，减少资源浪费，促进产业持续、快速、健康、稳定地发展。因此，加强畜禽副产物的开发利用具有十分重要的意义。传统畜禽副产物的开发利用主要包括对畜禽的血液、骨、内脏、皮毛、蹄等的综合加工利用，而如何发展更多具有科技含量高、附加值高的畜禽副产品利用项目，己成为畜禽副产品研究、开发的重点。
软骨尤其是动物软骨是各类肉制品加工产生的下脚料，不仅资源十分丰富且种类较多。据报道，动物软骨中富含硫酸软骨素和胶原蛋白等活性成分，该类生物活性大分子被广泛应用于医药、食品和化妆品等领域。硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate，CS)是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖构成的重复二糖单位组成的酸性黏多糖，临床上主要用于防治关节炎、治疗神经痛、关节痛、动脉硬化症、听觉障碍及肝炎等疾病，对冠心病、风湿性炎症及伤口愈合等也具有良好的疗效。胶原蛋白是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质，广泛存在于动物的皮肤、骨、牙齿、肌腱韧带和血管中。国内外研究表明，胶原蛋白及水解所得的胶原蛋白多肽在促进身体健康、提高免疫力及延缓衰老等方面具有重要作用。目前，国内生产企业大多以软骨为原料提取和分离硫酸软骨素，而软骨中占总蛋白90％的胶原蛋白则被酶解和变性，只能用作蛋白饲料或随废水排放，产品附加值较低，未能实现软骨资源的高值化利用。
畜禽动物中，畜禽骨骼由骨膜、骨质、骨髓构成，是蛋白质和钙质组成的网状结构，再构成管状，管内充满了含多种营养物质的骨髓，如构成脑组织的磷脂及防止老化的骨胶原、软骨素等，鲜骨中则含有蛋白质、脂肪、矿物质(如钙、磷、铁等)、骨胶原、软骨素以及维生素A、Bl、B2等。尤其是，畜骨蛋白是较为全价的可溶性蛋白质，其主要成分为胶原蛋白，生物学效价较高。传统的畜骨中的蛋白质提取主要是指对骨胶的提取，即粉碎后的畜骨经洗涤脱脂、加酸去杂、浸泡熬煮、浓缩成胶冻状的物质，以获得所需的骨蛋白。
如中国专利CN106244659A公开了一种制备畜禽软骨胶原蛋白的方法，其以新鲜软骨为原料，经脱脂、脱钙、除杂等处理制得胶原蛋白，再经醋酸胃蛋白酶消化、盐析及碱性蛋白酶解处理，经凝胶分离技术分离纯化得到胶原蛋白多肽。该工艺虽然实现了软骨副产物的深度开发，但整个工艺中胶原蛋白的提取效率以及胶原蛋白多肽的提取效率却并不理想。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，以解决现有技术中畜禽软骨胶原蛋白多肽提取效率不理想的问题。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种高效制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，包括如下步骤：
(1)取除杂处理后的新鲜软骨进行预处理，备用；
(2)将预处理后的软骨加入酸性蛋白酶液，于微负压和常压交替状态下进行酶解处理，固液分离并收集上清液，经盐析处理，收集得到的絮状白色沉淀物；
(3)将得到的沉淀物配制得到溶液，并加入碱性蛋白酶进行酶解处理，收集酶解液；
(4)将所得酶解液过滤后采用凝胶分离技术进行分离提纯，收集出现蛋白质峰的洗脱液，经冷冻干燥，即得。
具体的，所述步骤(2)中，所述酸性蛋白酶液包括浓度为0.3-0.8mol/L的胃蛋白酶液，并以醋酸调节酶液pH值为2.5-3.0。
具体的，所述步骤(2)中，所述酸性蛋白酶液中还包括浓度为0.05-0.1mol/L的氯化胆碱。
具体的，其特征在于，所述微负压条件为＞0～-0.1MPa。
具体的，所述微负压与常压的交替时间为1-4h。
具体的，所述步骤(2)中，所述酶解处理步骤的温度为2-6℃，酶解时间为20-36h。
具体的，所述步骤(3)中，所述碱性蛋白酶的质量浓度为1-2wt％，pH值为9-11。
具体的，所述步骤(3)中，所述酶解处理步骤的温度为60-65℃，酶解时间为2-3h。
具体的，所述步骤(4)中，所述分离提纯步骤包括：将预处理过的SepHadex-G50装入层析柱，用经过超声脱气后的流速为0.9m1/min的超纯水洗脱压实，将酶解液经过过滤器后装入层析柱中以0.5m1/min的流速在室温下进行分离提纯，收集出现蛋白质峰的洗脱液。
具体的，所述步骤(1)中，所述预处理步骤包括脱脂、脱钙、去除糖蛋白杂质的步骤。
本发明所述畜禽软骨胶原蛋白的制备方法，在传统制备软骨胶原蛋白方法的基础上，进一步通过对酶解过程中提取压力的调整控制，通过微负压和常压提取交替进行的方式，可有效提高胶原蛋白的提取效率，进一步提高了软骨废料的应用价值。
具体实施方式
本发明下述实施例中，对所述新鲜软骨的除杂及预处理步骤，按照中国专利CN106244659A中公开的预处理方法进行，具体包括：
将新鲜软骨剔除骨膜，剥去残留的肌肉、脂肪和筋膜，用生理盐水冲洗去残留的杂质；
将处理后的软骨轧成5x5cm的小块，放入杀菌锅内蒸煮1小时，蒸煮气压为0.1MPa，蒸煮温度为121℃，将软化后的软骨用清水洗去多余的油脂，放入干燥箱中以70℃的温度烘制6小时，烘制后用粉碎机粉碎成软骨粉；
取得到的软骨粉，按照1：10的用料比加入脱脂剂(氯仿：甲醇：水＝1：2：0.8wt％)，8℃的温度下搅拌脱脂处理2天，直到脱脂完全后滤去脱脂剂；
将脱脂后的物料按照1：10的用料比加入脱钙剂(0.5mol/L的EDTA溶液)，在28℃的温度下搅拌脱钙处理2天，直到软骨变柔软透明状后滤去脱钙剂；
进一步在脱钙处理后软骨中加入浓度为4mol/L的盐酸胍，按每克软骨加入10mL盐酸胍计，在25℃的温度下搅拌处理2天，以去除糖蛋白杂质，随后于4℃、12000rpm的转速下离心处理30分钟，弃上清液，得沉淀物，备用。
本发明下述实施例中，对两次酶解处理后得到的胶原蛋白多肽的分离提出处理，按照中国专利CN106244659A中公开的预处理方法进行，具体包括：将预处理过的SepHadex-G50装入层析柱，用经过超声脱气后的流速为0.9m1/min的超纯水洗脱压实，将酶解液经过过滤器后装入层析柱中以0.5m1/min的流速在室温下进行分离提纯，收集出现蛋白质峰的洗脱液。
实施例1
本实施例所述高效制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，包括如下步骤：
(1)取按照前述除杂及预处理步骤处理后的沉淀物1kg，备用；
(2)将所述预处理后的软骨，按照1：10倍量的料液比加入0.5mol/L的胃蛋白酶液(醋酸pH3.0)，置于压力提取装置中，控制酶解温度为4℃，控制-0.1MPa的微负压环境和常压环境下进行交替酶解处理，其中，控制微负压环境酶解4h，常压环境酶解4h，总的酶解时间为30h，酶解结束后，经4℃、12000rpm的转速下离心处理30分钟，收集上清液，并加入20％的氯化钠溶液进行过夜盐析处理，再以4℃、12000rpm的转速离心处理，收集得到的絮状白色沉淀物；
(3)将得到的沉淀物溶于0.5mol/L的乙酸中，配成2mg/mL的胶原蛋白液，并按照1.2wt％的质量比加入碱性蛋白酶(调pH10.0)，于60℃的温度下酶解2小时，收集酶解液；
(4)将所得酶解液过滤后采用凝胶分离技术进行分离提纯，收集出现蛋白质峰的洗脱液，经冷冻干燥，即得。
实施例2
本实施例所述高效制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，包括如下步骤：
(1)取按照前述除杂及预处理步骤处理后的沉淀物1kg，备用；
(2)将所述预处理后的软骨，按照1：10倍量的料液比加入0.3mol/L的胃蛋白酶液(醋酸pH3.0)，置于压力提取装置中，控制酶解温度为4℃，控制-0.1MPa的微负压环境和常压环境下进行交替酶解处理，其中，控制微负压环境酶解3h，常压环境酶解3h，总的酶解时间为30h，酶解结束后，经4℃、12000rpm的转速下离心处理30分钟，收集上清液，并加入20％的氯化钠溶液进行过夜盐析处理，再以4℃、12000rpm的转速离心处理，收集得到的絮状白色沉淀物；
(3)将得到的沉淀物溶于0.5mol/L的乙酸中，配成2mg/mL的胶原蛋白液，并按照1.2wt％的质量比加入碱性蛋白酶(调pH10.0)，于60℃的温度下酶解2小时，收集酶解液；
(4)将所得酶解液过滤后采用凝胶分离技术进行分离提纯，收集出现蛋白质峰的洗脱液，经冷冻干燥，即得。
实施例3
本实施例所述高效制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，包括如下步骤：
(1)取按照前述除杂及预处理步骤处理后的沉淀物1kg，备用；
(2)将所述预处理后的软骨，按照1：10倍量的料液比加入0.8mol/L的胃蛋白酶液(醋酸pH3.0)，置于压力提取装置中，控制酶解温度为4℃，控制-0.1MPa的微负压环境和常压环境下进行交替酶解处理，其中，控制微负压环境酶解2h，常压环境酶解2h，总的酶解时间为30h，酶解结束后，经4℃、12000rpm的转速下离心处理30分钟，收集上清液，并加入20％的氯化钠溶液进行过夜盐析处理，再以4℃、12000rpm的转速离心处理，收集得到的絮状白色沉淀物；
(3)将得到的沉淀物溶于0.5mol/L的乙酸中，配成2mg/mL的胶原蛋白液，并按照1.2wt％的质量比加入碱性蛋白酶(调pH10.0)，于60℃的温度下酶解2小时，收集酶解液；
(4)将所得酶解液过滤后采用凝胶分离技术进行分离提纯，收集出现蛋白质峰的洗脱液，经冷冻干燥，即得。
实施例4
本实施例所述高效制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，包括如下步骤：
(1)取按照前述除杂及预处理步骤处理后的沉淀物1kg，备用；
(2)将所述预处理后的软骨，按照1：10倍量的料液比加入0.5mol/L的胃蛋白酶液(醋酸pH3.0，并含有浓度为0.05mol/L的氯化胆碱)，置于压力提取装置中，控制酶解温度为4℃，控制-0.1MPa的微负压环境和常压环境下进行交替酶解处理，其中，控制微负压环境酶解4h，常压环境酶解4h，总的酶解时间为30h，酶解结束后，经4℃、12000rpm的转速下离心处理30分钟，收集上清液，并加入20％的氯化钠溶液进行过夜盐析处理，再以4℃、12000rpm的转速离心处理，收集得到的絮状白色沉淀物；
(3)将得到的沉淀物溶于0.5mol/L的乙酸中，配成2mg/mL的胶原蛋白液，并按照1.2wt％的质量比加入碱性蛋白酶(调pH10.0)，于60℃的温度下酶解2小时，收集酶解液；
(4)将所得酶解液过滤后采用凝胶分离技术进行分离提纯，收集出现蛋白质峰的洗脱液，经冷冻干燥，即得。
对比例1
本对比例所述制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法同实施例1，其区别仅在于，所述步骤(2)的酶解过程一直处于-0.1MPa的微负压环境下。
对比例2
本对比例所述制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法同实施例1，其区别仅在于，所述步骤(2)的酶解过程一直处于常压环境下。
实验例
分别计算上述实施例1-4级对比例1-2中产物中胶原蛋白多肽的含量，具体检测方法参照中国专利CN102533915A中记载的方法，以市售的羟脯氨酸标准品为对照，采用Woessner比色法检测羟脯氨酸的含量，含氮量采用凯氏定氮法检测。具体包括：
所述胶原蛋白多肽产品中总蛋白的含量(％)＝产品含氮量×6.25/产品质量(干品)×100；
所述产品中总蛋白的收率(％)＝产品含氮量×6.25/软骨原料质量(1-含水量)×100。
测试结果见下表1所示。
表1胶原蛋白多肽含量
| 编号 | 总蛋白含量/％ | 收率/％ |
| 实施例1 | 94.3 | 30.1 |
| 实施例2 | 93.5 | 28.7 |
| 实施例3 | 93.8 | 28.9 |
| 实施例4 | 96.1 | 33.8 |
| 对比例1 | 87.4 | 23.0 |
| 对比例2 | 85.5 | 21.2 |
可见，本发明所述畜禽软骨胶原蛋白的制备方法，通过对酶解过程中提取压力的调整控制，通过微负压和常压提取交替进行的方式，可有效提高胶原蛋白的提取效率，进一步提高了软骨废料的应用价值。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (5)
1.一种制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取除杂处理后的新鲜软骨进行预处理，备用；
（2）将预处理后的软骨加入酸性蛋白酶液，于微负压和常压交替状态下进行酶解处理，固液分离并收集上清液，经盐析处理，收集得到的絮状白色沉淀物；
（3）将得到的沉淀物配制得到溶液，并加入碱性蛋白酶进行酶解处理，收集酶解液；
（4）将所得酶解液过滤后采用凝胶分离技术进行分离提纯，收集出现蛋白质峰的洗脱液，经冷冻干燥，即得，其中
所述微负压条件为-0.1MPa，并且所述微负压与常压的交替时间为1-4h；其中
所述步骤（2）中，所述酸性蛋白酶液包括浓度为0.3-0.8mol/L的胃蛋白酶液，并以醋酸调节酶液pH值为2.5-3.0，所述酶解处理步骤的温度为2-6℃，酶解时间为20-36h；并且
所述步骤（3）中，所述酶解处理步骤的温度为60-65℃，酶解时间为2-3h。
2.根据权利要求1所述制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述酸性蛋白酶液中还包括浓度为0.05-0.1mol/L的氯化胆碱。
3.根据权利要求1或2所述制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述碱性蛋白酶的质量浓度为1-2wt%，pH值为9-11。
4.根据权利要求1或2所述制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述分离提纯步骤包括：将预处理过的SepHadex-G50装入层析柱，用经过超声脱气后的流速为0.9m1/min的超纯水洗脱压实，将酶解液经过过滤器后装入层析柱中以0.5m1/min的流速在室温下进行分离提纯，收集出现蛋白质峰的洗脱液。
5.根据权利要求1或2所述制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述预处理步骤包括脱脂、脱钙、去除糖蛋白杂质的步骤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110394971.9A CN113151385B (zh) | 2021-04-13 | 2021-04-13 | 一种制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110394971.9A CN113151385B (zh) | 2021-04-13 | 2021-04-13 | 一种制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113151385A CN113151385A (zh) | 2021-07-23 |
| CN113151385B true CN113151385B (zh) | 2023-05-23 |
Family
ID=76890351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110394971.9A Active CN113151385B (zh) | 2021-04-13 | 2021-04-13 | 一种制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113151385B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113943770B (zh) * | 2021-11-18 | 2023-04-07 | 中国海洋大学 | 一种鱼皮胶原蛋白及其提取方法 |
| CN114457138A (zh) * | 2022-02-25 | 2022-05-10 | 浙江工业大学 | 一种ⅱ型胶原蛋白肽多糖去除的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109232772A (zh) * | 2018-09-26 | 2019-01-18 | 荀照垒 | 一种动物软骨提取硫酸软骨素和胶原蛋白的方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103705431B (zh) * | 2014-01-09 | 2015-11-11 | 山东省淡水渔业研究院 | 一种鱼源胶原抗氧化肽美容面膜及其制备方法 |
| CN103993061B (zh) * | 2014-05-20 | 2018-03-23 | 海南美合泰生物科技有限公司 | 一种鱼胶原蛋白的生产方法 |
| CN106244659A (zh) * | 2016-10-26 | 2016-12-21 | 内蒙古蒙肽生物工程有限公司 | 制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法 |
| WO2019072219A1 (zh) * | 2017-10-11 | 2019-04-18 | 倪少伟 | 基于结缔组织的蛋白肽制备方法与所制备蛋白肽及其用途 |
| CN108703249A (zh) * | 2018-06-05 | 2018-10-26 | 中泰宜佳健康科技（北京）有限责任公司 | 一种胶原蛋白产品及其制备方法 |
| CN109275917A (zh) * | 2018-12-17 | 2019-01-29 | 深圳馋嘴猫美食网络科技有限公司 | 一种含有海洋鱼皮胶原低聚肽的多肽组合物 |
-
2021
- 2021-04-13 CN CN202110394971.9A patent/CN113151385B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109232772A (zh) * | 2018-09-26 | 2019-01-18 | 荀照垒 | 一种动物软骨提取硫酸软骨素和胶原蛋白的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Tenderizing Effect of High Hydrostatic Pressure on Bovine Intramuscular Connective Tissue;S. Ichinoseki等;FOOD Science;第71卷(第6期);E276-E281 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113151385A (zh) | 2021-07-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113151385B (zh) | 一种制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法 | |
| CN109349419B (zh) | 一种修复人体细胞的复合牦牛骨胶原蛋白肽粉 | |
| CN112062834B (zh) | 一种深海鱼鱼皮胶原蛋白肽及其提取制备方法 | |
| JP6650861B2 (ja) | 傷口の癒合、コラーゲン増殖、血管新生、免疫細胞の活性化を促進し、また傷口の感染を減少させることができるペプチド及びその応用 | |
| CN101744090B (zh) | 一种甲鱼小分子多肽的制造方法 | |
| CN112608968B (zh) | 一种以罗非鱼鳞原料生产鱼胶原蛋白肽的方法 | |
| CN104357522A (zh) | 一种利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法 | |
| CN110564802A (zh) | 一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法 | |
| CN102732592A (zh) | 酶法制备淡水鱼骨明胶的方法 | |
| CN1875988A (zh) | 低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物的制备方法及产品和用途 | |
| CN107523602A (zh) | 一种乌鸡活性肽的提取方法 | |
| CN110863026A (zh) | 一种牛或羊脊骨骨髓肽的制备方法以及组合物 | |
| CN113512108A (zh) | 海洋鱼皮胶原低聚肽及其制备方法和应用 | |
| CN102827906B (zh) | 一种ii型胶原和硫酸软骨素的综合提取工艺 | |
| CN104388512A (zh) | 一种制取水解胶原蛋白的方法 | |
| CN107488696B (zh) | 一种鸡骨双酶解方法 | |
| CN111471120B (zh) | 一种硫酸软骨素的制备方法及应用 | |
| CN113122604B (zh) | 一种海肠胶及其制备方法和应用 | |
| CN115449535A (zh) | 一种骨源胶原三肽及其制备方法 | |
| CN110818791B (zh) | 一种鱼胶原蛋白的制备方法 | |
| CN113388050A (zh) | 一种利用鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法 | |
| CN102031279A (zh) | 一种超低分子胶原蛋白的提取方法 | |
| CN102210455A (zh) | 一种复合天然胶原蛋白的保健食品及其制造方法 | |
| CN103992746A (zh) | 一种利用罗非鱼皮制备不同凝胶强度药用明胶的方法 | |
| CN114933648B (zh) | 一种以鱼鳞生产胶原二肽的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |