CN113151385B - 一种制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,尤其涉及一种高效制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法。本发明所述畜禽软骨胶原蛋白的制备方法,在传统制备软骨胶原蛋白方法的基础上,进一步通过对酶解过程中提取压力的调整控制,通过微负压和常压提取交替进行的方式,可有效提高胶原蛋白的提取效率,进一步提高了软骨废料的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,尤其涉及一种高效制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法。
背景技术
我国畜牧业大国,尤其是随着畜禽养殖的迅猛发展,副产物随之大量增加,这些副产物的深加工必须跟上养殖业的发展步伐,才能提高畜禽养殖的经济效益,减少资源浪费,促进产业持续、快速、健康、稳定地发展。因此,加强畜禽副产物的开发利用具有十分重要的意义。传统畜禽副产物的开发利用主要包括对畜禽的血液、骨、内脏、皮毛、蹄等的综合加工利用,而如何发展更多具有科技含量高、附加值高的畜禽副产品利用项目,己成为畜禽副产品研究、开发的重点。
软骨尤其是动物软骨是各类肉制品加工产生的下脚料,不仅资源十分丰富且种类较多。据报道,动物软骨中富含硫酸软骨素和胶原蛋白等活性成分,该类生物活性大分子被广泛应用于医药、食品和化妆品等领域。硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate,CS)是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖构成的重复二糖单位组成的酸性黏多糖,临床上主要用于防治关节炎、治疗神经痛、关节痛、动脉硬化症、听觉障碍及肝炎等疾病,对冠心病、风湿性炎症及伤口愈合等也具有良好的疗效。胶原蛋白是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质,广泛存在于动物的皮肤、骨、牙齿、肌腱韧带和血管中。国内外研究表明,胶原蛋白及水解所得的胶原蛋白多肽在促进身体健康、提高免疫力及延缓衰老等方面具有重要作用。目前,国内生产企业大多以软骨为原料提取和分离硫酸软骨素,而软骨中占总蛋白90%的胶原蛋白则被酶解和变性,只能用作蛋白饲料或随废水排放,产品附加值较低,未能实现软骨资源的高值化利用。
畜禽动物中,畜禽骨骼由骨膜、骨质、骨髓构成,是蛋白质和钙质组成的网状结构,再构成管状,管内充满了含多种营养物质的骨髓,如构成脑组织的磷脂及防止老化的骨胶原、软骨素等,鲜骨中则含有蛋白质、脂肪、矿物质(如钙、磷、铁等)、骨胶原、软骨素以及维生素A、Bl、B2等。尤其是,畜骨蛋白是较为全价的可溶性蛋白质,其主要成分为胶原蛋白,生物学效价较高。传统的畜骨中的蛋白质提取主要是指对骨胶的提取,即粉碎后的畜骨经洗涤脱脂、加酸去杂、浸泡熬煮、浓缩成胶冻状的物质,以获得所需的骨蛋白。
如中国专利CN106244659A公开了一种制备畜禽软骨胶原蛋白的方法,其以新鲜软骨为原料,经脱脂、脱钙、除杂等处理制得胶原蛋白,再经醋酸胃蛋白酶消化、盐析及碱性蛋白酶解处理,经凝胶分离技术分离纯化得到胶原蛋白多肽。该工艺虽然实现了软骨副产物的深度开发,但整个工艺中胶原蛋白的提取效率以及胶原蛋白多肽的提取效率却并不理想。
发明内容
为此,本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法,以解决现有技术中畜禽软骨胶原蛋白多肽提取效率不理想的问题。
为解决上述技术问题,本发明所述的一种高效制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法,包括如下步骤:
(1)取除杂处理后的新鲜软骨进行预处理,备用;
(2)将预处理后的软骨加入酸性蛋白酶液,于微负压和常压交替状态下进行酶解处理,固液分离并收集上清液,经盐析处理,收集得到的絮状白色沉淀物;
(3)将得到的沉淀物配制得到溶液,并加入碱性蛋白酶进行酶解处理,收集酶解液;
(4)将所得酶解液过滤后采用凝胶分离技术进行分离提纯,收集出现蛋白质峰的洗脱液,经冷冻干燥,即得。
具体的,所述步骤(2)中,所述酸性蛋白酶液包括浓度为0.3-0.8mol/L的胃蛋白酶液,并以醋酸调节酶液pH值为2.5-3.0。
具体的,所述步骤(2)中,所述酸性蛋白酶液中还包括浓度为0.05-0.1mol/L的氯化胆碱。
具体的,其特征在于,所述微负压条件为>0~-0.1MPa。
具体的,所述微负压与常压的交替时间为1-4h。
具体的,所述步骤(2)中,所述酶解处理步骤的温度为2-6℃,酶解时间为20-36h。
具体的,所述步骤(3)中,所述碱性蛋白酶的质量浓度为1-2wt%,pH值为9-11。
具体的,所述步骤(3)中,所述酶解处理步骤的温度为60-65℃,酶解时间为2-3h。
具体的,所述步骤(4)中,所述分离提纯步骤包括:将预处理过的SepHadex-G50装入层析柱,用经过超声脱气后的流速为0.9m1/min的超纯水洗脱压实,将酶解液经过过滤器后装入层析柱中以0.5m1/min的流速在室温下进行分离提纯,收集出现蛋白质峰的洗脱液。
具体的,所述步骤(1)中,所述预处理步骤包括脱脂、脱钙、去除糖蛋白杂质的步骤。
本发明所述畜禽软骨胶原蛋白的制备方法,在传统制备软骨胶原蛋白方法的基础上,进一步通过对酶解过程中提取压力的调整控制,通过微负压和常压提取交替进行的方式,可有效提高胶原蛋白的提取效率,进一步提高了软骨废料的应用价值。
具体实施方式
本发明下述实施例中,对所述新鲜软骨的除杂及预处理步骤,按照中国专利CN106244659A中公开的预处理方法进行,具体包括:
将新鲜软骨剔除骨膜,剥去残留的肌肉、脂肪和筋膜,用生理盐水冲洗去残留的杂质;
将处理后的软骨轧成5x5cm的小块,放入杀菌锅内蒸煮1小时,蒸煮气压为0.1MPa,蒸煮温度为121℃,将软化后的软骨用清水洗去多余的油脂,放入干燥箱中以70℃的温度烘制6小时,烘制后用粉碎机粉碎成软骨粉;
取得到的软骨粉,按照1:10的用料比加入脱脂剂(氯仿:甲醇:水=1:2:0.8wt%),8℃的温度下搅拌脱脂处理2天,直到脱脂完全后滤去脱脂剂;
将脱脂后的物料按照1:10的用料比加入脱钙剂(0.5mol/L的EDTA溶液),在28℃的温度下搅拌脱钙处理2天,直到软骨变柔软透明状后滤去脱钙剂;
进一步在脱钙处理后软骨中加入浓度为4mol/L的盐酸胍,按每克软骨加入10mL盐酸胍计,在25℃的温度下搅拌处理2天,以去除糖蛋白杂质,随后于4℃、12000rpm的转速下离心处理30分钟,弃上清液,得沉淀物,备用。
本发明下述实施例中,对两次酶解处理后得到的胶原蛋白多肽的分离提出处理,按照中国专利CN106244659A中公开的预处理方法进行,具体包括:将预处理过的SepHadex-G50装入层析柱,用经过超声脱气后的流速为0.9m1/min的超纯水洗脱压实,将酶解液经过过滤器后装入层析柱中以0.5m1/min的流速在室温下进行分离提纯,收集出现蛋白质峰的洗脱液。
实施例1
本实施例所述高效制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法,包括如下步骤:
(1)取按照前述除杂及预处理步骤处理后的沉淀物1kg,备用;
(2)将所述预处理后的软骨,按照1:10倍量的料液比加入0.5mol/L的胃蛋白酶液(醋酸pH3.0),置于压力提取装置中,控制酶解温度为4℃,控制-0.1MPa的微负压环境和常压环境下进行交替酶解处理,其中,控制微负压环境酶解4h,常压环境酶解4h,总的酶解时间为30h,酶解结束后,经4℃、12000rpm的转速下离心处理30分钟,收集上清液,并加入20%的氯化钠溶液进行过夜盐析处理,再以4℃、12000rpm的转速离心处理,收集得到的絮状白色沉淀物;
(3)将得到的沉淀物溶于0.5mol/L的乙酸中,配成2mg/mL的胶原蛋白液,并按照1.2wt%的质量比加入碱性蛋白酶(调pH10.0),于60℃的温度下酶解2小时,收集酶解液;
(4)将所得酶解液过滤后采用凝胶分离技术进行分离提纯,收集出现蛋白质峰的洗脱液,经冷冻干燥,即得。
实施例2
本实施例所述高效制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法,包括如下步骤:
(1)取按照前述除杂及预处理步骤处理后的沉淀物1kg,备用;
(2)将所述预处理后的软骨,按照1:10倍量的料液比加入0.3mol/L的胃蛋白酶液(醋酸pH3.0),置于压力提取装置中,控制酶解温度为4℃,控制-0.1MPa的微负压环境和常压环境下进行交替酶解处理,其中,控制微负压环境酶解3h,常压环境酶解3h,总的酶解时间为30h,酶解结束后,经4℃、12000rpm的转速下离心处理30分钟,收集上清液,并加入20%的氯化钠溶液进行过夜盐析处理,再以4℃、12000rpm的转速离心处理,收集得到的絮状白色沉淀物;
(3)将得到的沉淀物溶于0.5mol/L的乙酸中,配成2mg/mL的胶原蛋白液,并按照1.2wt%的质量比加入碱性蛋白酶(调pH10.0),于60℃的温度下酶解2小时,收集酶解液;
(4)将所得酶解液过滤后采用凝胶分离技术进行分离提纯,收集出现蛋白质峰的洗脱液,经冷冻干燥,即得。
实施例3
本实施例所述高效制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法,包括如下步骤:
(1)取按照前述除杂及预处理步骤处理后的沉淀物1kg,备用;
(2)将所述预处理后的软骨,按照1:10倍量的料液比加入0.8mol/L的胃蛋白酶液(醋酸pH3.0),置于压力提取装置中,控制酶解温度为4℃,控制-0.1MPa的微负压环境和常压环境下进行交替酶解处理,其中,控制微负压环境酶解2h,常压环境酶解2h,总的酶解时间为30h,酶解结束后,经4℃、12000rpm的转速下离心处理30分钟,收集上清液,并加入20%的氯化钠溶液进行过夜盐析处理,再以4℃、12000rpm的转速离心处理,收集得到的絮状白色沉淀物;
(3)将得到的沉淀物溶于0.5mol/L的乙酸中,配成2mg/mL的胶原蛋白液,并按照1.2wt%的质量比加入碱性蛋白酶(调pH10.0),于60℃的温度下酶解2小时,收集酶解液;
(4)将所得酶解液过滤后采用凝胶分离技术进行分离提纯,收集出现蛋白质峰的洗脱液,经冷冻干燥,即得。
实施例4
本实施例所述高效制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法,包括如下步骤:
(1)取按照前述除杂及预处理步骤处理后的沉淀物1kg,备用;
(2)将所述预处理后的软骨,按照1:10倍量的料液比加入0.5mol/L的胃蛋白酶液(醋酸pH3.0,并含有浓度为0.05mol/L的氯化胆碱),置于压力提取装置中,控制酶解温度为4℃,控制-0.1MPa的微负压环境和常压环境下进行交替酶解处理,其中,控制微负压环境酶解4h,常压环境酶解4h,总的酶解时间为30h,酶解结束后,经4℃、12000rpm的转速下离心处理30分钟,收集上清液,并加入20%的氯化钠溶液进行过夜盐析处理,再以4℃、12000rpm的转速离心处理,收集得到的絮状白色沉淀物;
(3)将得到的沉淀物溶于0.5mol/L的乙酸中,配成2mg/mL的胶原蛋白液,并按照1.2wt%的质量比加入碱性蛋白酶(调pH10.0),于60℃的温度下酶解2小时,收集酶解液;
(4)将所得酶解液过滤后采用凝胶分离技术进行分离提纯,收集出现蛋白质峰的洗脱液,经冷冻干燥,即得。
对比例1
本对比例所述制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法同实施例1,其区别仅在于,所述步骤(2)的酶解过程一直处于-0.1MPa的微负压环境下。
对比例2
本对比例所述制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法同实施例1,其区别仅在于,所述步骤(2)的酶解过程一直处于常压环境下。
实验例
分别计算上述实施例1-4级对比例1-2中产物中胶原蛋白多肽的含量,具体检测方法参照中国专利CN102533915A中记载的方法,以市售的羟脯氨酸标准品为对照,采用Woessner比色法检测羟脯氨酸的含量,含氮量采用凯氏定氮法检测。具体包括:
所述胶原蛋白多肽产品中总蛋白的含量(%)=产品含氮量×6.25/产品质量(干品)×100;
所述产品中总蛋白的收率(%)=产品含氮量×6.25/软骨原料质量(1-含水量)×100。
测试结果见下表1所示。
表1胶原蛋白多肽含量
编号 | 总蛋白含量/% | 收率/% |
实施例1 | 94.3 | 30.1 |
实施例2 | 93.5 | 28.7 |
实施例3 | 93.8 | 28.9 |
实施例4 | 96.1 | 33.8 |
对比例1 | 87.4 | 23.0 |
对比例2 | 85.5 | 21.2 |
可见,本发明所述畜禽软骨胶原蛋白的制备方法,通过对酶解过程中提取压力的调整控制,通过微负压和常压提取交替进行的方式,可有效提高胶原蛋白的提取效率,进一步提高了软骨废料的应用价值。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (5)
1.一种制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)取除杂处理后的新鲜软骨进行预处理,备用;
(2)将预处理后的软骨加入酸性蛋白酶液,于微负压和常压交替状态下进行酶解处理,固液分离并收集上清液,经盐析处理,收集得到的絮状白色沉淀物;
(3)将得到的沉淀物配制得到溶液,并加入碱性蛋白酶进行酶解处理,收集酶解液;
(4)将所得酶解液过滤后采用凝胶分离技术进行分离提纯,收集出现蛋白质峰的洗脱液,经冷冻干燥,即得,其中
所述微负压条件为-0.1MPa,并且所述微负压与常压的交替时间为1-4h;其中
所述步骤(2)中,所述酸性蛋白酶液包括浓度为0.3-0.8mol/L的胃蛋白酶液,并以醋酸调节酶液pH值为2.5-3.0,所述酶解处理步骤的温度为2-6℃,酶解时间为20-36h;并且
所述步骤(3)中,所述酶解处理步骤的温度为60-65℃,酶解时间为2-3h。
2.根据权利要求1所述制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,所述酸性蛋白酶液中还包括浓度为0.05-0.1mol/L的氯化胆碱。
3.根据权利要求1或2所述制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法,其特征在于,所述步骤(3)中,所述碱性蛋白酶的质量浓度为1-2wt%,pH值为9-11。
4.根据权利要求1或2所述制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法,其特征在于,所述步骤(4)中,所述分离提纯步骤包括:将预处理过的SepHadex-G50装入层析柱,用经过超声脱气后的流速为0.9m1/min的超纯水洗脱压实,将酶解液经过过滤器后装入层析柱中以0.5m1/min的流速在室温下进行分离提纯,收集出现蛋白质峰的洗脱液。
5.根据权利要求1或2所述制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,所述预处理步骤包括脱脂、脱钙、去除糖蛋白杂质的步骤。
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Tenderizing Effect of High Hydrostatic Pressure on Bovine Intramuscular Connective Tissue;S. Ichinoseki等;FOOD Science;第71卷(第6期);E276-E281 * |
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