CN111471120B - 一种硫酸软骨素的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种硫酸软骨素的制备方法，所述硫酸软骨素的制备方法包括以下步骤：预处理；第一次提取；第二次提取；第一次超滤浓缩；第一次醇沉；醇洗脱水。本发明还提供了一种上述硫酸软骨素在制备动脉粥样硬化疾病药物中的应用。本发明能够高效进行硫酸软骨素的制备工作，以酶解法为主，并辅以超声波振动手段，促进酶解过程的启动以及提高了酶解过程中的酶活，显著的提高硫酸软骨素的生产效率，且能够有效促进硫酸软骨素与聚集蛋白糖糖链上的相连接核心蛋白质的糖苷键断裂，并对酶解所产生的多肽链及杂质蛋白进行针对性的水解，能够有效降低产物中的蛋白质残留问题，显著提高所得成品硫酸软骨素的纯度。

Description

一种硫酸软骨素的制备方法及应用
技术领域：
本发明涉及医药制备技术领域，尤其涉及一种硫酸软骨素的制备方法及其应用。
背景技术：
硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate，CS)是一种黏多糖，吸水性较强，多呈白色粉末状，易吸湿，易溶于水，不不溶于乙醇、氯仿、丙酮等有机溶剂，广泛分布于人和一些动物如猪、牛、羊、鱼等的身体组织中，尤其是动物的软骨组织，如喉骨、鼻中骨、气管等，能够广泛应用于神经性头痛、神经痛、关节痛、偏头痛、动脉硬化症等症状，也可用于链霉素引起的听觉障碍及肝炎等症状的辅助治疗。
现有技术中，多采用酶解法或碱提酶解法提取硫酸软骨素，经过乙醇沉淀得到硫酸软骨素粗品。随着硫酸软骨素市场的不断成熟，对硫酸软骨素质量的要求也在进一步提高，目前的技术中，通常采用氧化水解法、乙醇分级沉淀法、等电点法、树脂吸附法等方法对制得的粗品进行精化提纯，以满足市场的需求，但是采用上述分布生产的方式，较为繁琐，不利于形成工业化的大规模生产，生产周期较长，成本较高，且生产成品中以蛋白质为主的杂质较多，通常无法将成品中的蛋白质下降至5％以下。
因此，本领域亟需一种硫酸软骨素的制备方法及其应用。
有鉴于此，提出本发明。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种能够更好使用硫酸软骨素的制备方法及应用，以解决现有技术中的至少一项技术问题。
具体的，本发明的第一方面，提供了一种硫酸软骨素的制备方法，所述硫酸软骨素的制备方法包括以下步骤：
预处理：将软骨原料加去离子水浸没并蒸煮，去除软骨表层附着的肌肉组织及油脂，蒸煮温度为50-60℃，蒸煮时长为12-18小时，并将蒸煮后的软骨原料使用粉碎机粉碎；
第一次提取：将预处理步骤后的软骨原料转移至超声波萃取器中，用去离子水浸没并加入按溶液体积计3％的氯化钠，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH为8-9，升温至40-60℃，加入按软骨重量计0.2-0.8％的复合酶，加入按溶液体积计0.1-0.2％有机缓冲液，维持溶液 pH8-9，保温40-60℃，在频率20000HZ的超声波条件下振动60-90分钟，收集提取液；
第二次提取：用去离子水浸没第一次提取步骤后的软骨原料，加入按溶液体积计3％的氯化钠，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH为8-9，升温至40-60℃，加入按软骨重量计0.1-0.4％的单酶，加入按溶液体积计0.1-0.2％有机缓冲液，维持溶液pH8-9，保温50-60℃，在频率 15000HZ的超声波条件下振动30-60分钟，收集提取液；
第一次超滤浓缩：将第一次提取及第二次提取步骤所得提取液混合，使用2000-3000分子量的超滤膜浓缩，得到浓缩液；
第一次醇沉：将第一次超滤浓缩步骤所得的浓缩液，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH 为6-7，加入按溶液体积计3％的氯化钠，再加入乙醇，使溶液乙醇浓度达到60-70％，收集沉淀物；
醇洗脱水：将第一次醇沉步骤所得的沉淀物，使用80％浓度的乙醇水溶液洗涤后，使用 95％浓度的乙醇水溶液脱水，干燥后得到成品硫酸软骨素；
其中，第一次提取步骤中所用复合酶为比例为1-2:1的碱性蛋白酶及胰酶，第二次提取步骤中所用单酶为碱性蛋白酶及胰酶中的一种，第一次提取、第二次提取中所用有机缓冲液为氯仿、丁醇、己醇、戊醇中的一种。
采用上述方案，能够高效进行硫酸软骨素的制备工作，以酶解法为主，并辅以超声波振动手段，促进酶解过程的启动以及提高了酶解过程中的酶活，显著的提高硫酸软骨素的生产效率，且能够有效促进硫酸软骨素与聚集蛋白糖糖链上的相连接核心蛋白质的糖苷键断裂，并对酶解所产生的多肽链及杂质蛋白进行针对性的水解，能够有效降低产物中的蛋白质残留问题，显著提高所得成品硫酸软骨素的纯度，同时本发明所通过的制备流程简洁，能够适用于工业化的大批量生产。
优选地，所述预处理步骤中，蒸煮温度为55℃，蒸煮时长为12小时。
优选地，所述第一次提取步骤中，升温温度为45℃，保温温度为45℃。
进一步地，所述第一次提取步骤中，按软骨重量计，复合酶的用量为0.8％，复合酶中碱性蛋白酶及胰酶的比例为1:1，按溶液体积计，有机缓冲液的用量为0.1％，超声波振动时长为90分钟。
采用上述方案，在满足复合酶比例、温度、有机缓冲液用量的条件下，本发明所采用超声波振动频率能够对复合酶产生正向影响，提高酶解过程的效率，从而显著提高硫酸软骨素的提取效率。
优选地，所述第二次提取步骤中，升温温度为50℃，保温温度为50℃。
进一步地，所述第二次提取步骤中，按软骨重量计，单酶的用量为0.4％，按溶液体积计，有机缓冲液的用量为0.1％，超声波振动时长为45分钟。
采用上述方案，在满足单酶种类、温度、有机缓冲液用量的条件下，本发明所采用超声波振动频率能够对复合酶产生正向影响，提高酶解过程的效率，从而显著提高硫酸软骨素的提取效率。
优选地，所述第一次醇沉之后，醇洗脱水之前，还包括步骤，第三次提取：将第一次醇沉步骤所得的沉淀物转移至超声波萃取器中，用去离子水浸没并加入按溶液体积计3％的氯化钠，使用盐酸溶液调节溶液pH为6-7，升温至40-50℃，加入按软骨重量计0.1-0.4％的单酶，加入按溶液体积计0.1-0.2％有机缓冲液，保温40-50℃，在频率20000HZ的超声波条件下振动30-60分钟，收集提取液，其中，所用单酶为链霉蛋白酶，所用有机缓冲液为氯仿、丁醇、己醇、戊醇中的一种。
进一步地，所述第三次提取步骤之后，醇洗脱水之前，还包括步骤，第二次超滤浓缩：将第三次提取步骤所得提取液，使用2000-3000分子量的超滤膜浓缩，得到浓缩液。
进一步地，所述第二次超滤浓缩步骤之后，醇洗脱水之前，还包括步骤，第二次醇沉：将第二次超滤浓缩步骤所得的浓缩液，使用盐酸溶液调节溶液pH为6-7，加入按溶液体积计3％的氯化钠，再加入乙醇，使溶液乙醇浓度达到70-80％，收集沉淀物。
采用上述方案，优化了硫酸软骨素的生产工艺，通过加设的第三次提取，能够充分利益不同水解酶的特异性，使酶解过程针对性的进行，有效的去除与硫酸软骨素相连接的多肽链，降低成品硫酸软骨素中的蛋白质残留问题。
优选地，所述第三次提取步骤中，升温温度为45℃，保温温度为45℃。
进一步地，所述第三次提取步骤中，按软骨重量计，单酶的用量为0.4％的，按溶液体积计，有机缓冲液的用量为0.1％，超声波振动时长为45分钟。
采用上述方案，在满足单酶种类、温度、有机缓冲液用量的条件下，本发明所采用超声波振动频率能够对复合酶产生正向影响，提高酶解过程的效率，从而显著提高硫酸软骨素的提取效率。
优选地，所述第一次醇沉之后，第三次提取之前，还包括步骤，沉淀物处理：将第一次醇沉步骤所得的沉淀物，与按重量计1-3％的石墨粉混合均匀。
进一步地，所述第三次提取步骤之后，第二次超滤浓缩之前，还包括步骤，过滤：将第三次提取步骤所得提取液加入真空抽滤机中，分别收集分离出的固体及液体。
采用上述方案，能够有效提高第三次提取的提取速率，并有效提高成品硫酸软骨素的纯度。
具体的，本发明的第二方面，提供了一种硫酸软骨素，所述硫酸软骨素采用上述制备方法制备。
具体的，本发明的第三方面，提供了一种如上述硫酸软骨素在制备动脉粥样硬化疾病药物中的应用。
采用上述方案，本发明所提供的硫酸软骨素能够有效去除血液中沉积的脂质及脂蛋白，去除心脏周围血管中的胆固醇，并加速了硫代巴比妥酸的分泌，可以有效的抗击动脉粥样硬化。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1.本发明能够高效进行硫酸软骨素的制备工作，以酶解法为主，并辅以超声波振动手段，促进酶解过程的启动以及提高了酶解过程中的酶活，显著的提高硫酸软骨素的生产效率；
2.本发明能够有效促进硫酸软骨素与聚集蛋白糖糖链上的相连接核心蛋白质的糖苷键断裂，并对酶解所产生的多肽链及杂质蛋白进行针对性的水解，能够有效降低产物中的蛋白质残留问题，显著提高所得成品硫酸软骨素的纯度，同时本发明所通过的制备流程简洁，能够适用于工业化的大批量生产；
3.本发明所提供复合酶比例、温度、有机缓冲液用量的条件下，采用超声波振动频率能够对复合酶产生正向影响，提高酶解过程的效率，从而显著提高硫酸软骨素的提取效率；
4.本发明优化了硫酸软骨素的生产工艺，通过加设的第三次提取，能够充分利益不同水解酶的特异性，使酶解过程针对性的进行，有效的去除与硫酸软骨素相连接的多肽链，降低成品硫酸软骨素中的蛋白质残留问题。
附图说明：
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明硫酸软骨素的制备方法一种实施方式的流程图；
图2为本发明硫酸软骨素的制备方法另一种实施方式的流程图。
具体实施方式：
这里将详细地对示例性实施例进行说明。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的装置和方法的例子。
在本发明使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实验例1
方案1
本方案提供了一种硫酸软骨素的制备方法，所述硫酸软骨素的制备方法包括以下步骤：
预处理：将猪软骨加去离子水浸没并蒸煮，去除软骨表层附着的肌肉组织及油脂，蒸煮温度为55℃，蒸煮时长为12小时，并将蒸煮后的软骨原料使用粉碎机粉碎；
第一次提取：将预处理步骤后的猪软骨转移至超声波萃取器中，用去离子水浸没并加入按溶液体积计3％的氯化钠，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH为8，升温至45℃，加入按软骨重量计0.8％的复合酶，所述复合酶采用比例为1:1的碱性蛋白酶及胰酶，加入按溶液体积计0.1％氯仿做为有机缓冲液，维持溶液pH9，保温45℃，在频率20000HZ的超声波条件下振动90分钟，收集提取液；
第二次提取：用去离子水浸没第一次提取步骤后的软骨原料，加入按溶液体积计3％的氯化钠，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH为8，升温至50℃，加入按软骨重量计0.4％的单酶，所述单酶采用碱性蛋白酶，加入按溶液体积计0.1％氯仿做为有机缓冲液，维持溶液pH8-9，保温50℃，在频率15000HZ的超声波条件下振动45分钟，收集提取液；
第一次超滤浓缩：将第一次提取及第二次提取步骤所得提取液混合，使用2000分子量的超滤膜浓缩，得到浓缩液；
第一次醇沉：将第一次超滤浓缩步骤所得的浓缩液，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH 为6，加入按溶液体积计3％的氯化钠，再加入乙醇，使溶液乙醇浓度达到70％，收集沉淀物；
醇洗脱水：将第二次醇沉步骤所得的沉淀物，使用80％浓度的乙醇水溶液洗涤后，使用 95％浓度的乙醇水溶液脱水，干燥后得到成品硫酸软骨素。
方案2
本方案与方案1大体相同，不同之处在于：第一次提取步骤中，升温温度为40℃，保温温度为40℃。
方案3
本方案与方案1大体相同，不同之处在于：第一次提取步骤中，升温温度为50℃，保温温度为50℃。
方案4
本方案与方案1大体相同，不同之处在于：第一次提取步骤中，升温温度为55℃，保温温度为55℃。
方案5
本方案与方案1大体相同，不同之处在于：第一次提取步骤中，升温温度为60℃，保温温度为60℃。
方案6
本方案与方案1大体相同，不同之处在于：第一次提取步骤中，超声波振动频率为15000HZ。
方案7
本方案与方案1大体相同，不同之处在于：第一次提取步骤中，超声波振动频率为25000HZ。
方案8
本方案与方案1大体相同，不同之处在于：第一次提取步骤中，加入按软骨重量计0.8％的复合酶，所述复合酶采用比例为2:1的碱性蛋白酶及胰酶。
方案9
本方案与方案1大体相同，不同之处在于：第一次提取步骤中，加入按软骨重量计0.4％的复合酶，所述复合酶采用比例为1:1的碱性蛋白酶及胰酶。
方案10
本方案与方案1大体相同，不同之处在于：第一次提取步骤中，加入按软骨重量计0.4％的复合酶，所述复合酶采用比例为2:1的碱性蛋白酶及胰酶。
方案11
本方案与方案1大体相同，不同之处在于：第一次提取步骤中，加入按软骨重量计1％的复合酶，所述复合酶采用比例为1:1的碱性蛋白酶及胰酶。
方案12
本方案与方案1大体相同，不同之处在于：第一次提取步骤中，加入按软骨重量计1％的复合酶，所述复合酶采用比例为2:1的碱性蛋白酶及胰酶。
方案13
本方案与方案1大体相同，不同之处在于：第一次提取步骤中，加入按溶液体积计0.2％氯仿做为有机缓冲液。
方案14
本方案与方案1大体相同，不同之处在于：第一次提取步骤中，不加入有机缓冲液。
方案1至方案14所用原料猪软骨质量一致，采用中华人民共和国药典(第四部)[S].2015:96-97，所记载的福林酚法测定方案1至方案14所制得成品硫酸软骨素中的蛋白质含量，采用中华人民共和国药典(第二部)[S].2015:1340-1341，所记载的酶解液相法测定方案1至方案14所制得成品硫酸软骨素中的硫酸软骨素含量，检测结果如表1所示。
表1复合酶酶解条件对成品硫酸软骨素纯度的影响
方案 蛋白质含量/％ 硫酸软骨素含量/％
1 5.7 91.4
2 8.4 86.8
3 9.6 83.1
4 8.9 87.2
5 7.2 86.5
6 8.7 87.9
7 8.3 86.3
8 7.9 88.6
9 8.8 85.0
10 9.4 82.7
11 10.5 80.9
12 12.4 79.3
13 8.5 83.8
14 12.7 76.2
在实际生产过程中，本申请人采用酶解法提取硫酸软骨素的生产过程中，采用超声波辅助进行提取硫酸软骨素，会显著降低硫酸软骨素的提取效率及提取质量，在申请人的进一步研究中，发现由于超声波所产生的空化效应及高速混合效应会导致酶活性的降低，进而显著降低硫酸软骨素的提取效率及提取质量。
如表1所示，使用本发明所提供的超声波振动频率、提取温度、复合酶用量及配比、有机缓冲液占比，能够有效的提高所得成品硫酸软骨素的纯度，即提高成品硫酸软骨素中的硫酸软骨素含量，降低成品硫酸软骨素中的蛋白质含量，且可知本发明所提供的超声波-酶解法的反应条件较为严格，最终所得成品硫酸软骨素中的硫酸软骨素含量及蛋白质含量所受影响因素众多，且单一变量与成品硫酸软骨素中的硫酸软骨素含量及蛋白质含量变化关系非线性变化。
实验例2
方案15
本方案提供了一种硫酸软骨素的制备方法，所述硫酸软骨素的制备方法包括以下步骤：
预处理：将猪软骨加去离子水浸没并蒸煮，去除软骨表层附着的肌肉组织及油脂，蒸煮温度为55℃，蒸煮时长为12小时，并将蒸煮后的软骨原料使用粉碎机粉碎；
第一次提取：将预处理步骤后的猪软骨转移至超声波萃取器中，用去离子水浸没并加入按溶液体积计3％的氯化钠，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH为8，升温至45℃，加入按软骨重量计0.8％的复合酶，所述复合酶采用比例为1:1的碱性蛋白酶及胰酶，加入按溶液体积计0.1％氯仿做为有机缓冲液，维持溶液pH9，保温45℃，在频率20000HZ的超声波条件下振动90分钟，收集提取液；
第二次提取：用去离子水浸没第一次提取步骤后的软骨原料，加入按溶液体积计3％的氯化钠，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH为8，升温至50℃，加入按软骨重量计0.4％的单酶，所述单酶采用碱性蛋白酶，加入按溶液体积计0.1％氯仿做为有机缓冲液，维持溶液pH8-9，保温50℃，在频率15000HZ的超声波条件下振动45分钟，收集提取液；
第一次超滤浓缩：将第一次提取及第二次提取步骤所得提取液混合，使用2000分子量的超滤膜浓缩，得到浓缩液；
第一次醇沉：将第一次超滤浓缩步骤所得的浓缩液，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH 为6，加入按溶液体积计3％的氯化钠，再加入乙醇，使溶液乙醇浓度达到70％，收集沉淀物；
醇洗脱水：将第一次醇沉步骤所得的沉淀物，使用80％浓度的乙醇水溶液洗涤后，使用 95％浓度的乙醇水溶液脱水，干燥后得到成品硫酸软骨素。
方案16
本方案与方案15大体相同，不同之处在于：第二次提取步骤中，升温温度为40℃，保温温度为40℃。
方案17
本方案与方案15大体相同，不同之处在于：第二次提取步骤中，升温温度为50℃，保温温度为50℃。
方案18
本方案与方案15大体相同，不同之处在于：第二次提取步骤中，升温温度为55℃，保温温度为55℃。
方案19
本方案与方案15大体相同，不同之处在于：第二次提取步骤中，升温温度为60℃，保温温度为60℃。
方案20
本方案与方案15大体相同，不同之处在于：第二次提取步骤中，超声波振动频率为10000HZ。
方案21
本方案与方案15大体相同，不同之处在于：第二次提取步骤中，超声波振动频率为20000HZ。
方案22
本方案与方案15大体相同，不同之处在于：第二次提取步骤中，加入按软骨重量计0.3％的单酶。
方案23
本方案与方案15大体相同，不同之处在于：第二次提取步骤中，加入按软骨重量计0.2％的单酶。
方案24
本方案与方案15大体相同，不同之处在于：第二次提取步骤中，加入按软骨重量计0.1％的单酶。
方案25
本方案与方案15大体相同，不同之处在于：第一次提取步骤中，加入按溶液体积计0.2％氯仿做为有机缓冲液。
方案26
本方案与方案15大体相同，不同之处在于：第一次提取步骤中，不加入有机缓冲液。
方案15至方案26所用原料猪软骨质量一致，采用中华人民共和国药典(第四部)[S].2015:96-97，所记载的福林酚法测定方案15至方案26所制得成品硫酸软骨素中的蛋白质含量，采用中华人民共和国药典(第二部)[S].2015:1340-1341，所记载的酶解液相法测定方案15至方案26所制得成品硫酸软骨素中的硫酸软骨素含量，检测结果如表2所示。
表2单酶酶解条件对成品硫酸软骨素纯度的影响
方案 蛋白质含量/％ 硫酸软骨素含量/％
15 5.7 91.4
16 8.5 83.9
17 9.1 82.3
18 9.0 83.6
19 7.9 87.1
20 9.5 83.4
21 9.2 82.8
22 6.9 88.9
23 8.3 82.5
24 9.8 82.8
25 11.6 78.6
26 13.1 77.3
如表2所示，在第二次提取过程中，由于采用的为单酶，对提取过程中的条件变化更加的敏感，体现为所得成品硫酸软骨素中的硫酸软骨素含量及蛋白质含量的变化更加显著，且在单酶提取过程中，单一变量与成品硫酸软骨素中的硫酸软骨素含量及蛋白质含量变化关系也为非线性变化，并在本发明所提供配比下能够具有最优硫酸软骨素含量及蛋白质含量的成品硫酸软骨素。
实施例1
本实施例提供了一种硫酸软骨素的制备方法，所述硫酸软骨素的制备方法包括以下步骤：
预处理：将猪软骨加去离子水浸没并蒸煮，去除软骨表层附着的肌肉组织及油脂，蒸煮温度为55℃，蒸煮时长为12小时，并将蒸煮后的软骨原料使用粉碎机粉碎；
第一次提取：将预处理步骤后的猪软骨转移至超声波萃取器中，用去离子水浸没并加入按溶液体积计3％的氯化钠，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH为8，升温至45℃，加入按软骨重量计0.8％的复合酶，所述复合酶采用比例为1:1的碱性蛋白酶及胰酶，加入按溶液体积计0.1％氯仿做为有机缓冲液，维持溶液pH9，保温45℃，在频率20000HZ的超声波条件下振动90分钟，收集提取液；
第二次提取：用去离子水浸没第一次提取步骤后的软骨原料，加入按溶液体积计3％的氯化钠，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH为8，升温至50℃，加入按软骨重量计0.4％的单酶，所述单酶采用碱性蛋白酶，加入按溶液体积计0.1％氯仿做为有机缓冲液，维持溶液pH8-9，保温50℃，在频率15000HZ的超声波条件下振动45分钟，收集提取液；
第一次超滤浓缩：将第一次提取及第二次提取步骤所得提取液混合，使用2000分子量的超滤膜浓缩，得到浓缩液；
第一次醇沉：将第一次超滤浓缩步骤所得的浓缩液，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH 为6，加入按溶液体积计3％的氯化钠，再加入乙醇，使溶液乙醇浓度达到70％，收集沉淀物；
沉淀物处理：将第一次醇沉步骤所得的沉淀物，与按重量计2％的石墨粉混合均匀；
第三次提取：将沉淀物处理步骤所得的混合物转移至超声波萃取器中，用去离子水浸没并加入按溶液体积计3％的氯化钠，使用盐酸溶液调节溶液pH为6，升温至45℃，加入按软骨重量计0.4％的单酶，加入按溶液体积计0.1％氯仿做为有机缓冲液，保温45℃，在频率 20000HZ的超声波条件下振动45分钟，收集提取液；
过滤：将第三次提取步骤所得提取液加入真空抽滤机中，分别收集分离出的固体及液体；
第二次超滤浓缩：将过滤步骤所得液体，使用2000分子量的超滤膜浓缩，得到浓缩液；
第二次醇沉：将第二次超滤浓缩步骤所得的浓缩液，使用盐酸溶液调节溶液pH为6，加入按溶液体积计3％的氯化钠，再加入乙醇，使溶液乙醇浓度达到80％，收集沉淀物；
醇洗脱水：将第二次醇沉步骤所得的沉淀物，使用80％浓度的乙醇水溶液洗涤后，使用 95％浓度的乙醇水溶液脱水，干燥后得到成品硫酸软骨素。
实施例2
本实施例提供了一种硫酸软骨素的制备方法，所述硫酸软骨素的制备方法包括以下步骤：
预处理：将猪软骨加去离子水浸没并蒸煮，去除软骨表层附着的肌肉组织及油脂，蒸煮温度为55℃，蒸煮时长为12小时，并将蒸煮后的软骨原料使用粉碎机粉碎；
第一次提取：将预处理步骤后的猪软骨转移至超声波萃取器中，用去离子水浸没并加入按溶液体积计3％的氯化钠，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH为8，升温至45℃，加入按软骨重量计0.8％的复合酶，所述复合酶采用比例为1:1的碱性蛋白酶及胰酶，加入按溶液体积计0.1％氯仿做为有机缓冲液，维持溶液pH9，保温45℃，在频率20000HZ的超声波条件下振动90分钟，收集提取液；
第二次提取：用去离子水浸没第一次提取步骤后的软骨原料，加入按溶液体积计3％的氯化钠，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH为8，升温至50℃，加入按软骨重量计0.4％的单酶，所述单酶采用碱性蛋白酶，加入按溶液体积计0.1％氯仿做为有机缓冲液，维持溶液pH8-9，保温50℃，在频率15000HZ的超声波条件下振动45分钟，收集提取液；
第一次超滤浓缩：将第一次提取及第二次提取步骤所得提取液混合，使用2000分子量的超滤膜浓缩，得到浓缩液；
第一次醇沉：将第一次超滤浓缩步骤所得的浓缩液，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH 为6，加入按溶液体积计3％的氯化钠，再加入乙醇，使溶液乙醇浓度达到70％，收集沉淀物；
醇洗脱水：将第一次醇沉步骤所得的沉淀物，使用80％浓度的乙醇水溶液洗涤后，使用 95％浓度的乙醇水溶液脱水，干燥后得到成品硫酸软骨素。
实施例3
本实施例与实施例1大体相同，不同之处在于：预处理步骤中，蒸煮温度为50℃，蒸煮时长为18小时。
实施例4
本实施例与实施例1大体相同，不同之处在于：预处理步骤中，蒸煮温度为55℃，蒸煮时长为15小时。
实施例5
本实施例与实施例1大体相同，不同之处在于：预处理步骤中，蒸煮温度为60℃，蒸煮时长为12小时。
实施例6
本实施例与实施例1大体相同，不同之处在于：第一次提取步骤中，超声波振动时长为 75分钟。
实施例7
本实施例与实施例1大体相同，不同之处在于：第一次提取步骤中，超声波振动时长为 60分钟。
实施例8
本实施例与实施例1大体相同，不同之处在于：第二次提取步骤中，超声波振动时长为 60分钟。
实施例9
本实施例与实施例1大体相同，不同之处在于：第二次提取步骤中，超声波振动时长为30分钟。
实施例10
本实施例与实施例1大体相同，不同之处在于：第三次提取步骤中，超声波振动时长为 60分钟。
实施例11
本实施例与实施例1大体相同，不同之处在于：第三次提取步骤中，超声波振动时长为 30分钟。
实施例12
本实施例与实施例1大体相同，不同之处在于：沉淀物处理步骤中，将第一次醇沉步骤所得的沉淀物，与按重量计1％的石墨粉混合均匀。
实施例13
本实施例与实施例1大体相同，不同之处在于：沉淀物处理步骤中，将第一次醇沉步骤所得的沉淀物，与按重量计3％的石墨粉混合均匀。
实施例14
本实施例与实施例1大体相同，不同之处在于：沉淀物处理步骤中，不加入石墨粉。
实施例15
本实施例与实施例1大体相同，不同之处在于：第一次提取、第二次提取及第三次提取过程中不采用超声波振动。
实施例16
本实施例提供了一种硫酸软骨素的制备方法，所述硫酸软骨素的制备方法包括以下步骤：
预处理：将猪软骨置于沸水中煮13min，去油脂、肉渣，剪成2.5cm见方小块；
提取：将预处理的喉骨350g加入20g/lNaOH溶液2450ml中浸没，置于超声波清洗仪中超声处理2.5h，纱布过滤得滤液；
超声除杂：将滤液再超声处理2h，除去蛋白质杂质得到处理液；
脱色：将处理液调pH至7，按软骨干重的7.8％加入白陶土，按处理液体积4.2％加入等重的活性炭，快速升温至90℃处理2h，快速冷却后，抽滤得滤液；
沉淀：按滤液体积的1％加入等重的NaCl，抽滤，调滤液的pH至5，搅拌下加入食用酒精至体积分数为70％，搅拌静置；
脱水：倾去上清液，用体积分数70％的酒精洗涤沉淀，抽滤，沉淀用食用酒精脱水5次，抽干，于66℃干燥17h，得成品硫酸软骨素。
方案1至方案16所用原料猪软骨质量一致，采用中华人民共和国药典(第四部)[S].2015:96-97，所记载的福林酚法测定方案1至方案16所制得成品硫酸软骨素中的蛋白质含量，采用中华人民共和国药典(第二部)[S].2015:1340-1341，所记载的酶解液相法测定方案1至方案16所制得成品硫酸软骨素中的硫酸软骨素含量，检测结果如表3所示。
表3不同生产条件对所得产品硫酸软骨素的影响
实施例 蛋白质含量/％ 硫酸软骨素含量/％
1 0.03 98.3
2 5.7 91.4
3 0.10 97.9
4 0.09 97.6
5 0.12 97.5
6 0.07 96.8
7 0.11 97.7
8 0.10 97.1
9 0.07 96.8
10 0.11 97.0
11 0.10 97.3
12 0.15 96.3
13 0.19 95.9
14 4.5 92.7
15 14.8 81.1
16 7.9 88.2
如表3所示，实施例1-5与实施例16间的对比可知，采用本发明所提供制备条件的各组实施例所得成品硫酸软骨素的硫酸软骨素含量，均高于传统超声波制备方法所制得硫酸软骨素，且成品硫酸软骨素中的蛋白质含量均低于传统超声波制备方法所制得硫酸软骨素，其次，添加第三次提取能够显著降低所制得硫酸软骨素中的蛋白质含量，其三，实施例1与实施例12-14间的对比可知，第三次提取步骤前的沉淀物处理步骤能够显著改变沉淀物的理化性质，提高第三次提取步骤的提取效果，最终影响成品硫酸软骨素的纯度，其四，实施例1 与实施例15间的对比可知，本发明所提供制备方法中第一次提取、第二次提取及第三次提取中超声波振动处理能够显著促进酶解过程，提高成品硫酸软骨素的纯度。
实施例17
本实施例用于验证本发明所制备的硫酸软骨素，对实验性高脂血症大鼠的血脂变化的影响。
实验动物：取标准实验SD大鼠，鼠龄3个月。
大鼠给药剂量：30.0mg/kg。
方法：取大鼠48只先在实验环境下给普通饲料喂养，观察7天，随机分为4组，分别为正常组、对照组、对比组、实验组，每组12只。
分组开始实验，除正常组给普通饲料喂养外，其余各组均给予高脂饲料喂养。连续饲养五周暂不给药。第六周开始灌胃给药，正常组及对照组给蒸馏水，对比组给Now Foods诺奥鲨鱼软骨素，实验组给本发明所制得硫酸软骨素，每日给药一次，连续给药三周，每周称重一次。4周末大鼠禁食12小时后眼眶采血，离出血清，测定各项血脂指标，包括总胆固醇CHOL、甘油三酯TG、高密度酯蛋白HDL-C、低密度酯蛋白LDL-C，进行统计学处理，比较各组间差异。并计算各给药组血脂指标升降百分率。
结果见表4，对照组与正常组比较：p＜0.01；对比组与实验组比较，p＜0.05。
表4硫酸软骨素对实验性高血脂症大鼠的血脂变化的影响
Figure BDA0002542428480000151
Figure BDA0002542428480000161
如表4所示，对比给药期的对照组与对比组及实验组可知，使用硫酸软骨素能够显著降低实验性大鼠体内的CHOL、TG、LDL-C三项指标，并使HDL-C趋向于正常水平，可知硫酸软骨素对动脉粥样硬化疾病药物具有治疗效果，其次，对比给药期的对比组与实验组可知，本发明的制备方法所制备的硫酸软骨素对比现有技术中的硫酸软骨素，对实验性大鼠体内的 CHOL、TG、LDL-C三项指标的降低以及HDL-C指标的回复正常的效果更加显著，可知本发明的制备方法所制备的硫酸软骨素在动脉粥样硬化疾病药物的实际表现优于现有技术中的硫酸软骨素。
实施例18
本实施例用于验证本发明所制备的硫酸软骨素，对实验性关节炎症大鼠的身体数值的影响。
实验动物：取标准实验SD大鼠，鼠龄3个月。
大鼠给药剂量：30.0mg/kg。
方法：取大鼠48只先在实验环境下给普通饲料喂养，观察7天，随机分为6组，分别为正常组、对照组、对比组、实验组，每组12只。
分组开始实验，除正常组给普通饲料喂养外，其余各组均给予佐剂性关节炎诱导，诱导通过在大鼠尾巴基部单次皮内注射1ml由在不完全弗罗因德佐剂中加热灭活的奶酪分支杆菌(Mycobacterium butyricum)构成的混合物进行试验性诱导关节炎。连续饲养一周暂不给药。第二周开始灌胃给药，正常组及对照组给蒸馏水，对比组给Now Foods诺奥鲨鱼软骨素，实验组给本发明所制得硫酸软骨素，每日给药一次，连续给药三周，每周称重一次。分别在佐剂性关节炎诱导前、喂药后第一周周末、喂药后第二周周末、喂药后第三周周末，使用适合于测量大鼠后爪的测径器，测量后爪体积的增加量，进而确定由于关节炎而形成的水肿，进行统计学处理，比较各组间差异。
结果见表5，对照组与正常组比较：p＜0.01；对比组与实验组比较，p＜0.05。
表5硫酸软骨素对实验性关节炎症大鼠的身体数值的影响
Figure BDA0002542428480000162
Figure BDA0002542428480000171
如表5所示，对比对照组与正常组、对比组及实验组可知，使用硫酸软骨素能够使实验性大鼠的体重向健康状态靠拢，并使后爪肿胀变化程度降低，故可知硫酸软骨素对关节炎症具有缓解作用，其次，对比对比组与实验组可知，本发明的制备方法所制备的硫酸软骨素对比现有技术中的硫酸软骨素，对实验性大鼠关节炎症表征近似，故可知本发明所的制备方法制备的硫酸软骨素在关节炎症的实际表现达到现有技术中硫酸软骨素的正常水平。
应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (5)

1.一种硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：所述硫酸软骨素的制备方法包括以下步骤：
预处理：将软骨原料加去离子水浸没并蒸煮，去除软骨表层附着的肌肉组织及油脂，蒸煮温度为50-60℃，蒸煮时长为12-18小时，并将蒸煮后的软骨原料粉碎；
第一次提取：将预处理步骤后的软骨原料转移至超声波萃取器中，用去离子水浸没并加入按溶液体积计3%的氯化钠，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH为8-9，升温至40-60℃，加入按软骨重量计0.2-0.8%的复合酶，加入按溶液体积计0.1-0.2%有机缓冲液，维持溶液pH8-9，保温40-60℃，在频率20000HZ的超声波条件下振动60-90分钟，收集提取液；
第二次提取：用去离子水浸没第一次提取步骤后的软骨原料，加入按溶液体积计3%的氯化钠，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH为8-9，升温至40-60℃，加入按软骨重量计0.1-0.4%的单酶，加入按溶液体积计0.1-0.2%有机缓冲液，维持溶液pH8-9，保温50-60℃，在频率15000HZ的超声波条件下振动30-60分钟，收集提取液；
第一次超滤浓缩：将第一次提取及第二次提取步骤所得提取液混合，使用2000-3000分子量的超滤膜浓缩，得到浓缩液；
第一次醇沉：将第一次超滤浓缩步骤所得的浓缩液，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH为6-7，加入按溶液体积计3%的氯化钠，再加入乙醇，使溶液乙醇浓度达到60-70%，收集沉淀物；
沉淀物处理：将第一次醇沉步骤所得的沉淀物，与按重量计1-3%的石墨粉混合均匀；
第三次提取：将处理得到的沉淀物转移至超声波萃取器中，用去离子水浸没并加入按溶液体积计3%的氯化钠，使用盐酸溶液调节溶液pH为6-7，升温至40-50℃，加入按软骨重量计0.1-0.4%的单酶，加入按溶液体积计0.1-0.2%有机缓冲液，保温40-50℃，在频率20000HZ的超声波条件下振动30-60分钟，收集提取液，其中，所用单酶为链霉蛋白酶，所用有机缓冲液为氯仿、丁醇、己醇、戊醇中的一种；
过滤：将第三次提取步骤所得提取液加入真空抽滤机中，分别收集分离出的固体及液体；
第二次超滤浓缩：将过滤步骤所得液体，使用2000-3000分子量的超滤膜浓缩，得到浓缩液；
第二次醇沉：将第二次超滤浓缩步骤所得的浓缩液，使用盐酸溶液调节溶液pH为6-7，加入按溶液体积计3%的氯化钠，再加入乙醇，使溶液乙醇浓度达到70-80%，收集沉淀物；
醇洗脱水：将第二次醇沉步骤所得的沉淀物，使用80%浓度的乙醇水溶液洗涤后，使用95%浓度的乙醇水溶液脱水，干燥后得到成品硫酸软骨素；
其中，第一次提取步骤中所用复合酶为比例为1-2:1的碱性蛋白酶及胰酶，第二次提取步骤中所用单酶为碱性蛋白酶及胰酶中的一种，第一次提取、第二次提取中所用有机缓冲液为氯仿、丁醇、己醇、戊醇中的一种。
2.根据权利要求1所述硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：所述第一次提取步骤中，按软骨重量计，复合酶的用量为0.8%，复合酶中碱性蛋白酶及胰酶的比例为1:1，按溶液体积计，有机缓冲液的用量为0.1%，超声波振动时长为90分钟。
3.根据权利要求2所述硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：所述第二次提取步骤中，按软骨重量计，单酶的用量为0.4%，按溶液体积计，有机缓冲液的用量为0.1%，超声波振动时长为45分钟。
4.根据权利要求3所述硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：所述第三次提取步骤中，按软骨重量计，单酶的用量为0.4%，按溶液体积计，有机缓冲液的用量为0.1%，超声波振动时长为45分钟。
5.一种如权利要求1-4任一项所述硫酸软骨素的制备方法所得的硫酸软骨素在制备动脉粥样硬化疾病药物中的应用。
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