CN102993333A - 一种硫酸软骨素提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种硫酸软骨素的提取方法，该方法采用超声波作为辅助由预处理、灭活、水解、抽滤、离心、干燥粉碎六步骤组成。该方法工艺简单、无污染，所得的硫酸软骨素质量高，纯度达到了87.96%，是生物医药领域一重大进步。

Description

一种硫酸软骨素提取方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种硫酸软骨素提取方法。

背景技术

硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)又名牛磺软骨素、康得宁，广泛存在于人和一些动物如猪、牛、羊、鱼等的软骨组织中。CS 在临床上主要用于治疗神经痛、关节炎、耳鸣以及促进溃疡愈合和防治高血脂等，动物口服后未发现临床毒性症状。除此之外，CS 也广泛应用于食品、化妆品行业。多年来，硫酸软骨素一直是医药类的小品种，产销量小。近年来，硫酸软骨素作为一种新型药用活性成分，在医药制剂、医学材料、日化产品、化妆品、生发剂、保健品等领域应用广泛，越来越受到人们的重视，市场需求趋旺。我国生产和出口量逐年大幅度增长，现已成为生化药物的第三出口，发展前景看好。

目前，硫酸软骨素普遍提取的方法主要有盐解、碱解、酶解法以及碱 - 酶法，其分离纯化的方法有乙醇沉淀法、离子交换色谱法、季铵盐配合法、吸附法和纤维素分离法等。但是上述方法在现有生产工艺中普遍存在一个问题:生产工艺繁琐不易操作、碱酸乙醇使用量大、硫酸软骨素品质不高、生产成本高昂，生产周期较长，产率低并且污染严重，不适合企业规模化生产需求。

CN101250237B提供了一种硫酸软骨素无溶剂提取方法，该方法通过无溶剂化学反应，弥补了一般有机化学反应产生杂质的不足，但是其要利用球磨机中研磨体所产生的高强度机械力作用来达到使硫酸软骨素组织中硫酸软骨素连接在核心蛋白上糖肽键发生锻炼，该方法对设备和技术的要求高，操作难度大，不利于企业规模化生产。CN102093490A提供了一种高纯度硫酸软骨素的制备方法，该方法在传统工艺的基础上通过使用阳离子交换方法，在一定程度上提高了硫酸软骨素的收率和纯度，但是该方法工艺繁琐，易不能逃脱传统工艺的局限。

实践中，由于制备硫酸软骨素的原料软骨原料表面附着许多脂肪和肌肉组织，这些组织往往成为了硫酸软骨素提取的主要杂质，又加上硫酸软骨素本身比较粘稠，这就使得硫酸软骨素的提取过滤非常困难，这也就直接导致规模化生产硫酸软骨素过滤效率低，生产周期长。本发明人经多方研究，通过超声波辅助，探索得出一种由超声波辅助提取的碱-双酶法提取硫酸软骨素。

发明内容

本发明提供一种硫酸软骨素提取方法，以期在缩短硫酸软骨素生产周期，降低硫酸软骨素提取的污染情况的同时提高产品的质量，使得硫酸软骨素的生产适合现代企业的规模化生产，为企业和社会创造更大的经济效益。

为实现上述发明目的，本发明一种硫酸软骨素的提取方法，其具体实施的技术方案为：

本发明所述一种硫酸软骨素提取方法，其特征在于该方法由预处理、灭活、水解、抽滤、离心、干燥粉碎六步骤组成。

本发明所述一种硫酸软骨素的提取方法，其特征在于该方法实施的具体步骤为：

（1）预处理：将牛喉管置于沸水中煮 8～10min 后捞出，去除表面的油脂等残留物自然风干后粉碎。

（2）灭活：将预处理的软骨浸于NaOH 溶液中，置于超声波隔音箱中，在功率为491W条件下超声处理130~140min，然后用HCl调节pH值至 6.8，添加一定量木瓜蛋白酶，恒温水浴 1h，升温到 90℃保温 15~20min 灭酶。

（3）水解：调最适 pH 值，按一定量料液比加入胃蛋白酶，一定温度条件下水解一定时间，升温至90℃灭酶15~20min。

（4）抽滤：按滤液体积的 1% 加入活性炭，按原料干质量的 10% 加入高岭土，90℃吸附搅拌 30min，快速冷却后抽滤，将清液pH 值调节至 6.8～7.2，加入NaCl，然后缓慢加入无水乙醇，使体积分数达到70%。

（5）离心：静置过夜收集沉淀，离心15~20min，用乙醇洗涤 1～2 次，

（6）干燥粉碎：抽滤，置于恒温干燥箱中干燥，粉碎即得产品。

本发明所述的一种硫酸软骨素制备方法，其特征在于该方法pH为5.4～8、酶解温度30～50℃、酶解时间90～120min。

本发明所述的一种硫酸软骨素制备方法，其特征在于该方法步骤（2）浸泡软骨的溶液为5%的NaOH 溶液，灭酶时间为20min。

本发明所述一种硫酸软骨素的提取方法，其特征在于该方法步骤（3）胃蛋白酶添加量1～2:1000，灭酶时间为15min。

本发明所述一种硫酸软骨素的提取方法，其特征在于该方法步骤（4） NaCl的添加量为滤液体积 3%。

本发明所述一种硫酸软骨素的提取方法，其特征在于该方法步骤（5）离心速度为6000r/min，离心时间为15min。

本发明所述一种硫酸软骨素的提取方法，其特征在于该方法步骤（6）干燥的温度为60℃。

本发明具有以下优点：

1.本方法提取的硫酸软骨素纯度高、质量好。

2.本方法工艺简单，容易操作，适合企业规模化生产。

具体实施方式

下面的实施可更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

将牛喉管置于沸水中煮 8～10min 后捞出，去除表面的油脂等残留物自然风干后粉碎。将预处理的软骨浸于 5% 的 NaOH 溶液中，置于超声波隔音箱中，在功率中国肉类食品综合研究中心加工工艺为491W条件下超声处理139min，然后用HCl调节pH值至 5.5～7.5，添加一定量木瓜蛋白酶，45℃恒温水浴 1h，升温到 90℃保温 20min 灭酶。调最适 pH 值，按一定量料液比加入胃蛋白酶，一定温度条件下水解一定时间，升温至90℃灭酶 15min，按滤液体积的 1% 加入活性炭，按原料干质量的 5～15% 加入高岭土，90℃吸附搅拌 30min，快速冷却后抽滤，将清液pH 值调节至 6.8～7.2，加入滤液体积 3% 的 NaCl，然后缓慢加入无水乙醇，使体积分数达到70%，静置过夜收集沉淀，6000r/min 离心 15min，用乙醇洗涤 1～2 次，抽滤，置于恒温干燥箱中 60℃干燥，粉碎即得产品。

红外光谱法对样品进行结构鉴定：所得产品用红外光谱对样品结构验证，用标准品对照，得：   图1： CS标准品红外光谱图；          图2 提取样品CS红外光谱图。

     由图1、2可见，与标准品相比，提取样品在相应的波段均存在特征吸收峰，在约3400cm^-1处有特征吸收峰，说明存在－OH和—NH伸缩振动，2920cm^-1附近存在-CH₂伸缩振动。1650cm^-1附近存在NH弯曲振动， 1560cm^-1和1410cm^-1处分别存在－COO不对阵伸缩振动和－COO对称伸缩振动，在约1560cm^-1及840 cm^-1处有硫酸基特征吸收峰。说明提取的样品是CS.

产品各项指标检测：

      水分测定：采用常压恒温干燥法；蛋白质含量测定；采用Bradford法；澄清度测定：采用分光光度法测定640nm波长处50g/L溶液的吸光度， pH值测定；将产品配制成50mg/mL溶液，用pH计测定其pH值；CS纯度测定；采用氨基己糖测定法。

     CS纯度=氨基己糖含量×2.82

     CS得率=（产品质量/原料质量）×100

     鉴定且纯度达到87.96%，其他各项指标均符合《中华人民共和国卫生部药品标准》要求。

Claims (8)

1.一种硫酸软骨素提取方法，其特征在于该方法由预处理、灭活、水解、抽滤、离心、干燥粉碎六步骤组成。

2.根据权利要求1所述一种硫酸软骨素的提取方法，其特征在于该方法实施的具体步骤为：

预处理：将牛喉管置于沸水中煮 8～10min 后捞出，去除表面的油脂等残留物自然风干后粉碎；

灭活：将预处理的软骨浸于NaOH 溶液中，置于超声波隔音箱中，在功率为491W条件下超声处理130~140min，然后用HCl调节pH值至 6.8，添加一定量木瓜蛋白酶，恒温水浴 1h，升温到 90℃保温 15~20min 灭酶；

水解：调最适 pH 值，按一定量料液比加入胃蛋白酶，一定温度条件下水解一定时间，升温至90℃灭酶15~20min；

抽滤：按滤液体积的 1% 加入活性炭，按原料干质量的 10% 加入高岭土，90℃吸附搅拌 30min，快速冷却后抽滤，将清液pH 值调节至 6.8～7.2，加入NaCl，然后缓慢加入无水乙醇，使体积分数达到70%；

离心：静置过夜收集沉淀，离心15~20min，用乙醇洗涤 1～2 次；

干燥粉碎：抽滤，置于恒温干燥箱中干燥，粉碎即得产品。

3.根据权利要求1所述的一种硫酸软骨素制备方法，其特征在于该方法pH为5.4～8、酶解温度30～50℃、酶解时间90～120min。

4.根据权利要求2所述的一种硫酸软骨素制备方法，其特征在于该方法步骤（2）浸泡软骨的溶液为5%的NaOH 溶液，灭酶时间为20min。

5.根据权利要求2所述一种硫酸软骨素的提取方法，其特征在于该方法步骤（3）胃蛋白酶添加量1～2:1000，灭酶时间为15min。

6.根据权利要求2所述一种硫酸软骨素的提取方法，其特征在于该方法步骤（4） NaCl的添加量为滤液体积 3%。

7.根据权利要求2所述一种硫酸软骨素的提取方法，其特征在于该方法步骤（5）离心速度为6000r/min，离心时间为15min。

8.根据权利要求2所述一种硫酸软骨素的提取方法，其特征在于该方法步骤（6）干燥的温度为60℃。

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