CN103467621A - 一种高纯度鲟鱼硫酸软骨素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从鲟鱼骨中制备高纯度硫酸软骨素的方法。利用鲟鱼头骨和脊骨为原料,经硫酸软骨素提取专用酶与碱性蛋白酶联合酶解新工艺,制得鲟鱼硫酸软骨素粗品。上述粗品经季铵盐纯化,乙醇沉淀,透析后即可制得硫酸软骨素纯品。本制备方法,可使鲟鱼硫酸软骨素产品纯度高达95%左右,葡萄糖醛酸含量高达40%左右,工艺简单,用酶量少,且鲟鱼软骨蛋白可以回收利用,因而极大的提高了经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种从鲟鱼头骨及脊骨中提取制备高纯度硫酸软骨素的方法。
背景技术
鲟鱼迄今已有2亿多年的历史,称之为“水中活化石”。中国是鲟鱼品种最多,分布最广,资源最为丰富的国家之一,目前我国鲟鱼养殖量已达到世界鲟鱼养殖总量的80%。鲟鱼全身遍布软骨,鲟鱼的头、脊索、鳍中软骨约占鱼体10%,从鲟鱼软骨中提取的硫酸软骨素具有独特的医药和保健价值,它可以调节机体免疫、抗关节炎、抗凝血、调脂降脂、抗动脉粥样硬化和神经元保护和修复作用;添加于食品中具有保湿、掩盖异味、改善口感等作用,添加于化妆品中可以改善皮肤细胞代谢和保持皮肤水分等作用,因而在医药、化妆品和食品工业中有广泛的用途,市场前景巨大。
硫酸软骨素是一种天然酸性粘多糖,通常与蛋白质结合在一起以蛋白多糖的形式存在。目前国内外主要从猪、牛、羊等畜禽结缔组织,即畜禽软骨、喉骨、鼻骨和气管等组织中提取硫酸软骨素。在提取工艺上,国内主要采用中性盐法、碱法、酶法、超声波法、乙酸抽提法等,而以鲟鱼为原料提取硫酸软骨素的方法目前还仅局限于超声波-酶解法、碱-酶法:郝淑贤(201210483108,一种利用鲟鱼软骨制备硫酸软骨素的方法)利用超声波酶解方法从鲟鱼软骨中提取硫酸软骨素的得率为31.0%,纯度81.3%;李刚(200810101962.0,一种鲟鱼软骨素的提取、应用及其制备方法)利用碱-酶法从鲟鱼鱼头及脊骨中提取产品得率达30%左右;杨贤庆(200610124066.7,一种鲟鱼软骨素提取方法)利用碱-酶法从鲟鱼软骨中提取粗产品得率为16.30%,其中氨基己糖的含量为23.66%;这些方法在应用中硫酸软骨素纯度普遍较低,且存在有不同的缺陷,碱的使用不仅使产品颜色变深,且会造成环境污染;超声波去除杂质较难,且产品质量和色泽达不到要求,得率较低,限制了生产上应用。酶法由于作用专一性强,产品纯度高、颜色洁白,对环境污染小,因而正发展成为硫酸软骨素行业生产工艺改进的方向。利用酶解法制备硫酸软骨素需要保证酶的品质,在目前硫酸软骨素提取酶市场中,常使用猪胰脏、胰酶粉、木瓜蛋白酶等不同叫法的固体酶制剂,这些酶在生产应用时用酶量大,大量生产易增加后续产品除杂的难度,而且由于其本身品质波动变化,从而难以保证产品质量稳定。为了实现硫酸软骨素生产的规模化、使生产在连续、标准、规范的基础上进行,采用新的酶法工艺,特别是复合酶法的改进和实施将成为今后行业的发展趋势。
采用硫酸软骨素提取专用酶和碱性蛋白酶可实现从软骨中直接分离纯化硫酸软骨素,经三氯乙酸除杂、乙醇沉淀和季铵盐沉淀即可得到高纯度的硫酸软骨素。这是一种新型鲟鱼硫酸软骨素酶解工艺,目前还未见报道。硫酸软骨素提取专用酶和碱性蛋白酶本身质量稳定,联合使用可以减少酶用量,缩短提取时间,不需使用碱,且可以从废液中回收蛋白,这对于提高产品质量稳定性、提高硫酸软骨素得率和纯度、简化生产工艺,开拓国内鲟鱼硫酸软骨素市场和进一步研究利用其生理功能具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用鲟鱼软骨制备高纯度硫酸软骨素的方法,具体包括以下步骤:
(1)预处理:以新鲜鲟鱼头骨和脊骨为原料,将其放入锅中水煮1小时,取出放冷后剔除头部、脊索软骨上残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织,然后将其切碎后加入10倍量(v/m)95%的乙醇浸泡2小时,之后更换乙醇重复浸泡一遍。将软骨冷冻干燥后粉碎,称重,备用。
(2)酶解:将(1)中鲟鱼软骨粉溶于25倍量(v/m)pH值为7的碳酸钠溶液中,碳酸钠溶液pH值用12mol/L盐酸溶液调节。向溶液中加入0.005~0.025倍软骨粉重量的鲟鱼硫酸软骨素提取专用酶,优选0.015倍,控温50~60℃,优选55℃,机械搅拌3~5小时,优选4小时,之后煮沸10分钟使酶失活。待溶液冷却后向其加入0.03~0.07倍软骨粉重量的碱性蛋白酶,优选0.05倍,控温50~70℃,优选60℃,机械搅拌1~3小时,优选2小时,之后煮沸10分钟使酶失活。
(3)三氯乙酸除蛋白:将步骤(2)中的酶解液进行过滤,得滤液,滤液冷却至4℃后向其中加入1/19倍滤液体积6.1mol/L三氯乙酸。静置3小时沉淀析出,之后于4℃离心15分钟收集滤液。
(4)醇沉:向步骤(3)中的滤液中加入4倍量(v/v)乙醇,静置过夜后于4℃离心15分钟去除上清液,所得沉淀在80℃烘干,得到鲟鱼硫酸软骨素粗品。
(5)季铵盐沉淀:将(4)中的硫酸软骨素粗品溶解于50倍量(m/m)水中,向其中加入0.5~1.5倍硫酸软骨素粗品重量的氯化十六烷吡啶进行混合,优选1倍量,并于15~25℃条件下,优选20℃,静置1~2小时,优选1.5小时,之后于4℃离心15分钟去收集沉淀
(6)醇沉:将步骤(5)中的沉淀溶解于62.5倍量(v/m)2.5mol/L的氯化钠溶液中,向其中加入0.65~0.85倍体积乙醇,优选0.75倍量,用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6~8,优选pH值至7,静置120分钟待沉淀析出,之后于4℃离心15分钟收集沉淀。
(7)膜透析:将步骤(6)中的沉淀溶解于100倍量(v/m)水中,将溶液用透析膜进行透析,其中透析膜截留分子量为7000道尔顿,透析2天。
(8)真空干燥:将步骤(7)中的透析液于-50℃真空干燥过夜,即得硫酸软骨素纯品。
有益效果:
(1)利用硫酸软骨素提取专用酶与碱性蛋白酶提取鲟鱼硫酸软骨素,大大缩短了提取时间,提高了产品得率与纯度,减少碱的用量,还可以从废液中回收蛋白,从而减轻了对环境污染,增加了经济效益,有利于工业化生产。
(2)采用单因素实验、正交实验方法优化酶解提取工艺,发现酶浓度、酶解温度和酶解时间对硫酸软骨素提取效果影响依次减弱,进而以硫酸软骨素得率,葡萄糖醛酸含量,蛋白质含量为指标进行综合考察进,优化得出适宜的酶解条件为:硫酸软骨素提取专用酶用量1.5%,酶解温度55℃,酶解时间4小时,碱性蛋白酶用量5%,酶解温度60℃,酶解时间2小时。
(3)透析能将小分子蛋白质、糖、脂类物质及盐过滤掉,进一步提高了产品纯度。
附图说明
图1鲟鱼头骨中提取的硫酸软骨素纯品
图2鲟鱼脊骨中提取的硫酸软骨素纯品
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明,但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
(1)预处理:以15g新鲜鲟鱼头骨原料,将其放入锅中水煮1小时,取出放冷后剔除头骨上残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织,然后将其切碎后(约10g)加入100mL95%的乙醇浸泡2小时,之后更换乙醇重复浸泡一遍。将软骨冷冻干燥后粉碎,称重,备用。
(2)酶解:将步骤(1)中所制得6g鲟鱼软骨粉溶于150mLpH值为7的碳酸钠溶液中,向其中加入30~150mg的鲟鱼硫酸软骨素提取专用酶,优选90mg,控温50~60℃,优选55℃,机械搅拌3~5小时,优选4小时,之后煮沸10分钟使酶失活。待溶液冷却后向其加入180~420mg,优选300mg,控温50~70℃,优选60℃,机械搅拌1~3小时,优选2小时,之后煮沸10分钟使酶失活。
(3)三氯乙酸除蛋白:将步骤(2)中的酶解液进行过滤,得滤液140mL,滤液冷却至4℃后向其中加入7.37mL6.1mol/L三氯乙酸。静置3小时沉淀析出,之后于4℃离心15分钟,得滤液145mL。
(4)醇沉:向步骤(3)中145mL滤液中加入580mL乙醇,静置过夜后于4℃离心15分钟得沉淀,所得沉淀在80℃烘干,得到鲟鱼硫酸软骨素粗品2.58g。
(5)季铵盐沉淀:将(4)中2.58g硫酸软骨素粗品溶解于129mL水中,向其中加入1.29~3.87g氯化十六烷吡啶进行混合,优选2.58g,并于15~25℃下,优选20℃,静置1~2小时,优选1.5小时,之后于4℃离心15分钟得沉淀2g。
(6)醇沉:将步骤(5)中的2g沉淀溶解于125mL2.5mol/L的氯化钠溶液中,向其中加入81.25~106.25mL乙醇,优选93.75mL。用0.1mol/l氢氧化钠溶液调节pH值至6~8,优选溶液pH值调至7,静置120分钟待沉淀析出,之后于4℃离心15分钟得沉淀1.56g。
(7)膜透析:将步骤(6)中的1.56g沉淀溶解于156mL水中,将溶液用透析袋进行透析,其中透析袋截留分子量为7000道尔顿,透析2天。
(8)真空干燥:将步骤(7)中的透析液于-50℃温度下真空干燥过夜,即得1.17g硫酸软骨素成品。样品检测分析结果见表1。
实施例2
(1)预处理:以10g新鲜鲟鱼脊骨原料,将其放入锅中水煮1小时,取出放冷后剔除脊骨上残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织,然后将其切碎后(约8g)加入80mL95%的乙醇浸泡2小时,之后更换乙醇重复浸泡一遍。将软骨冷冻干燥后粉碎,称重,备用。
(2)酶解:将(1)中5g鲟鱼软骨粉溶于125mLpH值为7的碳酸钠溶液,加入25~125mg鲟鱼硫酸软骨素提取专用酶,优选75mg,控温50~70℃,优选60℃,机械搅拌3~5小时,优选4小时,之后煮沸10分钟使酶失活。待溶液冷却后向其加入150~350mg碱性蛋白酶,优选250mg,控温50~70℃,优选60℃,机械搅拌1~3小时,优选2小时,之后煮沸10分钟使酶失活。
(3)三氯乙酸除蛋白:将步骤(2)中的酶解液进行过滤,得滤液116mL,滤液冷却至4℃后向其中加入6.11mL6.1mol/L三氯乙酸。静置3小时沉淀析出,之后于4℃离心15分钟,得滤液120mL。
(4)醇沉:向步骤(3)中120mL滤液中加入480mL乙醇,静置小时后于4℃离心15分钟得沉淀4.32g,所得沉淀在80℃烘干,得到鲟鱼硫酸软骨素粗品2.3g。
(5)季铵盐沉淀:将(4)中的2.3g硫酸软骨素粗品溶解于115mL水中,向其中加入1.15~3.45mg氯化十六烷吡啶进行混合,优选2.3mg,并于15~25℃下,优选20℃,静置1~2小时,优选1.5小时,之后于4℃离心15分钟得沉淀1.8g。
(6)醇沉:将步骤(5)中的1.8g沉淀溶解于112.5mL2.5mol/L的氯化钠溶液中,向其中加入72.13~95.63mL乙醇,优选84.38mL,用0.1mol/l氢氧化钠溶液调节pH值至6~8,优选pH值调至7,静置120分钟待沉淀析出,之后于4℃离心15分钟得沉淀1.4g。
(7)膜透析:将步骤(6)中的1.4g沉淀溶解于140mL水中,将溶液用透析袋进行透析,其中截留分子量为7000道尔顿,透析2天。
(8)真空干燥:将步骤(7)中的透析液于-50℃温度下真空干燥过夜,即得1.1g硫酸软骨素成品。样品检测分析结果见表2。
将上述提取工艺制得的硫酸软骨素进行分析,结果如下:
表1实施例1样品检测结果分析
表2实施例2样品检测结果分析
Claims (5)
1.一种高纯度鲟鱼硫酸软骨素的制备方法,其特征是,包括以下步骤:
(1)预处理:以新鲜鲟鱼头骨和脊骨为原料,将其放入锅中水煮1小时,取出放冷后剔除头部、脊索软骨上残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织,用10倍量(v/m)95%乙醇浸泡2小时,之后更换乙醇重复浸泡一遍,冷冻干燥后粉碎备用。
(2)酶解:将步骤(1)中所得鲟鱼软骨粉溶于25倍量(v/m)pH值为7的氯化钠溶液中,碳酸钠溶液pH值用12mol/L盐酸溶液调节。向溶液中加入硫酸软骨素提取专用酶进行酶解,酶解完后煮沸10分钟使酶失活,之后加入碱性蛋白酶进行酶解,酶解完后煮沸10分钟使酶失活,过滤收集酶解液。
(3)三氯乙酸除蛋白:将步骤(2)中的酶解液进行冷却,冷却至4℃后向其中加入1/19倍量(v/v)6.1mol/L三氯乙酸。静置3小时沉淀析出,之后于4℃离心15分钟收集滤液。
(4)醇沉、干燥:向步骤(3)中的滤液中加入4倍量(v/v)乙醇,于4℃离心15分钟收集沉淀,将沉淀在80℃烘干后得到鲟鱼硫酸软骨素粗品。
(5)季铵盐沉淀:将(4)中的硫酸软骨素粗品溶解于50倍量(m/m)水中,向其中加入氯化十六烷吡啶进行混合,于4℃离心15分钟收集沉淀。
(6)醇沉:将步骤(5)中的沉淀溶解于62.5倍量(v/m)2.5mol/L的氯化钠溶液中,向其中加入乙醇,于4℃离心15分钟收集沉淀。
(7)膜透析、干燥:将步骤(6)中的沉淀溶解于100倍量(v/m)水中,将溶液用截留分子量为7000Da透析袋进行透析。将透析液于-50℃真空干燥后即得硫酸软骨素纯品。
2.根据权利要求1中所述制备硫酸软骨素的方法,其特征在于步骤(2)中所述添加量为0.005~0.025倍,优选为0.015倍,酶解温度为50~60℃,优选为55℃,酶解时间为3~5小时,优选为4小时。
3.根据权利要求1中所述制备硫酸软骨素的方法,其特征在于步骤(2)中所述碱性蛋白酶添加量为软骨粉重量的0.03~0.07倍,优选为0.05倍,酶解温度为50~70℃,优选为60℃,酶解时间为1~3小时,优选为2小时。
4.根据权利要求1中所述制备硫酸软骨素的方法,其特征在于步骤(5)中所述添加量为0.5~1.5倍,优选为1倍,作用温度为15~25℃,优选为20℃,作用时间为1~2小时,优选为1.5小时。
5.根据权利要求1中所述制备硫酸软骨素的方法,其特征在于步骤(6)中所述乙醇添加量为氯化钠溶液体积的0.65~0.85倍,优选0.75倍,添加乙醇后用0.1mol/L氢氧化钠溶液调 节溶液pH值到6~8,优选pH值为7。
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