CN114921511A

CN114921511A - 一种富含小分子硫酸软骨素的鱼软骨水解物制备方法

Info

Publication number: CN114921511A
Application number: CN202210745969.6A
Authority: CN
Inventors: 牟海津; 李青; 张伟星
Original assignee: Jingchangming Technology Trade Shanghai Co ltd
Current assignee: Jingchangming Technology Trade Shanghai Co ltd
Priority date: 2022-06-29
Filing date: 2022-06-29
Publication date: 2022-08-19
Anticipated expiration: 2042-06-29
Also published as: CN114921511B

Abstract

本发明提供一种富含小分子硫酸软骨素的鱼软骨水解物制备方法，还提供一种宠物壮骨食品及其制备方法。本发明以鲟鱼软骨为原料，通过高压预处理，蛋白酶和硫酸软骨素酶分级酶解来制备富含小分子量的硫酸软骨素和II型胶原蛋白肽的鲟鱼软骨水解物。本发明采用高压预处理，促进胶原蛋白和硫酸软骨素的解离，使酶更充分的和底物结合，制备出分子量小于500Da的硫酸软骨素和分子量小于1500Da的II型胶原蛋白肽。本发明将鲟鱼软骨酶解物、聚合度2‑6的壳寡糖、牡蛎肽、小分子玻尿酸、Vc与各种物质合理复配，制备出容易吸收、促进宠物骨骼发育、预防宠物骨类疾病的宠物壮骨食品，有利于提高宠物的生活质量。

Description

一种富含小分子硫酸软骨素的鱼软骨水解物制备方法

技术领域

本发明涉及宠物食品领域，具体为一种富含小分子硫酸软骨素的鱼软骨水解物制备方法。

背景技术

鲟鱼，也称鲟龙，和鲨鱼一样是地球上最古老和最原始的软骨鱼种，是淡水鱼类中个体最大、寿命最长的鱼类，具有很高的经济价值和科学价值。鲟鱼软骨中硫酸软骨素和II型胶原蛋白是近年研究人员关注的热点问题。鲟鱼软骨在鲟鱼体内所占比例约5.7％，软骨的主要成分为水、蛋白多糖和胶原纤维。鲟鱼软骨作为鲟鱼深加工后主要的副产物，含有丰富的硫酸软骨素和II型胶原蛋白，因此可以作为天然优质硫酸软骨素和胶原蛋白的提取原料。据报道鲟鱼头、脊索、鳍中软骨的硫酸软骨素含量高达30％，硫酸软骨素(Chondroitinsulfate，简称Chs)是从动物软骨组织中提取的天然酸性粘多糖，有ChsA、ChsB、ChsC、 ChsD和ChsE等多种异构体，它们均是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖交替连结而成的双糖聚合物，只是硫酸基团位置不同而已。它通常与蛋白质结合成糖蛋白的形式存在，当其水解时发生β消去反应，连接硫酸软骨素与蛋白质中丝氨酸羟基的O-糖苷键断裂，可以得到游离态的硫酸软骨素和蛋白质。硫酸软骨素为白色或微黄色粉末，具有吸湿性，易溶于水而成粘度较大的溶液，难溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙醇、丙酮和冰醋酸等有机溶剂。硫酸软骨素遇热不稳定，乙酰基易发生水解脱落，在酸性条件下更易水解成不同聚合度的低聚糖。鲟鱼软骨中蛋白质含量可以达到干重的50-60％。鲟鱼软骨中的蛋白质主要是II型胶原蛋白，II型胶原蛋白，是由3条相同的α1(Ⅱ)链构成的同型三聚体超螺旋结构。II型胶原蛋白能促进软骨细胞的增值，维持骨细胞基质平衡，对于增强骨健康有着重要作用。有研究证明补充II型胶原蛋白可以改善软骨细胞外基质结构，有效改善骨关节炎。

目前从鲟鱼软骨中提取硫酸软骨素的技术还存在一些没有解决的问题，硫酸软骨素在鲟鱼软骨中是通过O-糖苷键和糖蛋白结合在一起的，提取的时候常规的方法很难将硫酸软骨从蛋白中分离，现在采用的比较多的方法是用碱进行预处理，稀碱法提取时，虽然条件比较温和，硫酸软骨素结构不易降解，但是生产周期比较长，硫酸软骨素和蛋白水解不完全；浓碱法提取时，虽然蛋白和硫酸软骨素水解比较充分，但是硫酸软骨素易发生降解，影响产品质量。提取的硫酸软骨素通常以高分子量形式存在，但高分子量的硫酸软骨素，由于黏度高、结构复杂及细胞膜的选择通透性等因素，造成了生物利用率低、口服吸收效果不稳定。而低分子质量硫酸软骨素具有生物利用度高和活性强等特点，制备低分子量硫酸软骨素成为新的研究方向。

而且，随着现在生活的发展，人们对美好生活的需要增多，宠物已经成为我们日常生活中的一部分，宠物消费也随之形成一定的规模。宠物中最常见的是骨骼类疾病，这是困扰宠物生长发育的一个大问题，骨骼起到支架作用，骨骼发育不好，支撑力会下降，会对体内一些脏器进行压迫，也会出现一系列骨类疾病。宠物缺少骨成分，可能会出现肋骨外翻，前肢腕关节、肘关节变形，小型宠物容易出现“O”形腿，大中型宠物会引起前肢严重变形，如果发现不及时、治疗不得当，还可能引起永久性的趴爪或瘸腿。当宠物进入老年期以后，会因为内分泌等原因造成骨质疏松，骨质疏松主要是骨形成减少，骨吸收增加导致，因此需要一种补充骨成分，可以有效避免骨质疏松，提高宠物的生存质量。

发明内容

本发明目的在于提供一种富含小分子硫酸软骨素的鱼软骨水解物制备方法，以及一种宠物壮骨食品，解决了从软骨中提取硫酸软骨素和II型胶原蛋白分子量大，不好吸收的问题，同时也解决了两种物质分别提取的工艺繁琐、成本较高的问题，一次性地达到了针对宠物壮骨食品开发的高端原料生产的目的。

为达成上述目的，本发明提出如下技术方案：一种富含小分子硫酸软骨素的鱼软骨水解物制备方法，包括如下步骤：

步骤一：将鲟鱼软骨进行粉碎后加压解离，获得待酶解原料；

步骤二：用蛋白酶和硫酸软骨素酶对步骤一的待酶解原料进行复合酶解，并获得酶解液，硫酸软骨素酶为硫酸软骨素AC外切酶ChSase AC II；

步骤三：将步骤二中的酶解液经灭酶后，在8000rpm 10min的条件下离心后获得酶解上清液。

步骤四：将步骤三中的上清液喷雾干燥，即为酶解产物，获得的酶解产物中包括分子量小于1500Da的II型胶原蛋白肽和分子量小于500Da的硫酸软骨素，定义酶解产物为鲟鱼软骨水解物。

进一步的，在本发明中，所述硫酸软骨素AC外切酶ChSase AC II，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，在本发明中，所述步骤一中，将鲟鱼软骨洗净，烘干粉碎，置于高压釜中，压力为0.2MPa，温度设置在120-135℃，解离时间为1-4h。

进一步的，在本发明中，所述步骤二中，酶解所用的蛋白酶是胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的复合酶。

进一步的，在本发明中，所述胃蛋白酶添加量为2000-3500U/g，木瓜蛋白酶添加量为1500-4000U/g，温度40-60℃，反应时间4-8h。

进一步的，在本发明中，所述步骤二中，硫酸软骨素酶解添加量为500-2000 U/g，温度为20-40℃，pH为5-8，酶解时间5-9h。

一种宠物壮骨食品，如上述的一种富含小分子硫酸软骨素的鱼软骨水解物制备方法获得的鲟鱼软骨水解物，鲟鱼软骨水解物68-76％、聚合度2-6的壳寡糖10-13％、牡蛎肽5-9％、Vc3-7％、小分子玻尿酸1-3％。

一种宠物壮骨食品的制备方法，将上述的原料，按照合适的比例混合，以 300-500r/min的转速下在混合机中搅拌混匀，混匀后，高温杀菌，制备得到宠物壮骨食品。

有益效果，本申请的技术方案具备如下技术效果：

1、本发明通过对鲟鱼软骨进行高压处理，获得硫酸软骨素和II型胶原蛋白更容易分离的酶解原料，以便于硫酸软骨素酶和蛋白酶与酶解底物的充分接触，从而使后续的酶解更为彻底，再配合复合酶解，通过硫酸软骨素AC外切酶 ChSase AC II和蛋白酶获得分子量小于500Da的硫酸软骨素酶解产物，高压预处理和复合酶解两种技术结合，大大简化了制备工艺，无需复杂的分离纯化技术，降低制备成本。

2、硫酸软骨素外切酶CHASE AC II是一种裂解酶。ChSase AC II显示出一种外切作用模式，从硫酸软骨素多糖链的非还原端剪切二糖单位，利用β消除机制来裂解D-葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)之间的β-1,4- 糖苷键，同时在产物非还原端GlcA的C4-C5位形成不饱和双健，因此，硫酸软骨素外切酶CHASE AC II可以将鲟鱼软骨经过蛋白酶酶解后的酶解液中的硫酸软骨素进行降解，有效的将大分子量的硫酸软骨素降解成分子量小于500Da的硫酸软骨素。

3、本产品中的硫酸软骨素为小分子，小分子宠物吸收更加容易，更好的提高壮骨效果，同时复配壳聚糖，提高肠道的消化吸收能力，促进对壮骨成分的吸收。

4、本产品中应用了壳寡糖，壳聚糖很容易与透明质酸和硫酸软骨素形成聚电解质复合，壳聚糖与透明质酸的协同作用增强了透明软骨再生的性能。壳寡糖的分子量比壳聚糖小很多，壳寡糖可以溶于水，只有溶于水，才有可能被生物体吸收和利用，表现出生物活性，所以壳寡糖更容易被动物体吸收，本发明所涉及的一种宠物壮骨食品，可广泛用于不同年龄的宠物，也可与其它宠物饲料同时使用，可使宠物骨骼强健，活力充沛，具有壮骨的功效。

应当理解，前述构思以及在下面更加详细地描述的额外构思的所有组合只要在这样的构思不相互矛盾的情况下都可以被视为本公开的发明主题的一部分。

结合附图从下面的描述中可以更加全面地理解本发明教导的前述和其他方面、实施例和特征。本发明的其他附加方面例如示例性实施方式的特征和/或有益效果将在下面的描述中显见，或通过根据本发明教导的具体实施方式的实践中得知。

附图说明

附图不意在按比例绘制。在附图中，在各个图中示出的每个相同或近似相同的组成部分可以用相同的标号表示。为了清晰起见，在每个图中，并非每个组成部分均被标记。现在，将通过例子并参考附图来描述本发明的各个方面的实施例，其中：

图1为本发明酶解样品图。

图2为硫酸软骨素AC外切酶基因核酸电泳图。

图3为硫酸软骨素AC外切酶ChSase AC II酶解0.5h的产物液相图谱和各组分比例图。

图4为硫酸软骨素AC外切酶ChSase AC II酶解9h的产物液相图谱和各组分比例图。

图5为ChSase AC II作用机理示意图。

具体实施方式

为了更了解本发明的技术内容，特举具体实施例并配合所附图式说明如下。在本公开中参照附图来描述本发明的各方面，附图中示出了许多说明的实施例。本公开的实施例不必定义在包括本发明的所有方面。应当理解，上面介绍的多种构思和实施例，以及下面更加详细地描述的那些构思和实施方式可以以很多方式中任意一种来实施，这是因为本发明所公开的构思和实施例并不限于任何实施方式。另外，本发明公开的一些方面可以单独使用，或者与本发明公开的其他方面的任何适当组合来使用。

实施例一

一种富含小分子硫酸软骨素的鱼软骨水解物制备方法，工艺过程如下：

步骤一：取鲟鱼软骨30g，洗净，粉碎后，于高压釜中，高压135℃，压力为0.2MPa，解离时间为2h。

步骤二：将高压预处理后的原料，按照料液比1:20加水，加复合蛋白酶进行酶解，加入工业胃蛋白酶，添加量为2500U/g，木瓜蛋白酶添加量为2000U/g，温度60℃，反应时间8小时，酶解过程不断搅拌。

将来自食品级菌株毕赤酵母表达制备获得的硫酸软骨素AC外切酶ChSase AC II加入到上述酶解液中，硫酸软骨素AC外切酶酶解添加量1500U/g，温度 30℃，pH为6，酶解时间6h，酶解过程不断搅拌。

步骤三：将酶解液进行加热灭酶处理后，在8000rpm 10min的条件下离心后获得酶解上清液。

步骤四：将步骤三中的上清液喷雾干燥，即得到富含小分子量的硫酸软骨素和II型胶原蛋白肽的鲟鱼软骨水解物。

实施例二

步骤一：取鲟鱼软骨30g，洗净，粉碎后，于高压釜中，高压125℃，压力为0.2MPa，解离时间为1.5h。

步骤二：将高压预处理后的原料，按照料液比1:25加水，加复合蛋白酶进行酶解，其特征在于，加入工业胃蛋白酶，添加量为3000U/g，木瓜蛋白酶添加量为2500U/g，温度55℃，反应时间10小时，酶解过程不断搅拌。

将来自食品级菌株毕赤酵母表达制备获得的硫酸软骨素AC外切酶ChSase AC II加入到上述酶解液中，硫酸软骨素AC外切酶酶解添加量2000U/g，温度 30℃，pH为6.5，酶解时间8h，酶解过程不断搅拌。

实施例三

步骤一：取鲟鱼软骨30g，洗净，粉碎后，于高压釜中，高压130℃，压力为0.2MPa，解离时间为2h。

步骤二：将高压预处理后的原料，按照料液比1:25加水，加复合蛋白酶进行酶解，加入工业胃蛋白酶，添加量为3500U/g，木瓜蛋白酶添加量为2500U/g，温度50℃，反应时间9小时，酶解过程不断搅拌。

将来自食品级菌株毕赤酵母表达制备获得的硫酸软骨素AC外切酶ChSase AC II加入到上述酶解液中，硫酸软骨素AC外切酶酶解添加量2500U/g，温度 35℃，pH为6.0，酶解时间8h，酶解过程不断搅拌。

酶解的工艺实施例一为样品1，酶解的工艺实施例二为样品2，酶解的工艺实施例三为样品3，如图1所示为酶解完成的图片。

上述实施例使用的硫酸软骨素酶的表达和制备过程如下：

(1)表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达

提取节杆菌Arthrobacter sp.CS01的基因组，根据硫酸软骨素酶的基因序列设计合成如下引物：

F1:5’-CCGGAATTCATGACGCACGAAGTATCCCGACG-3’

R1:5’-ATTTGCGGCCGCCTAGCGGTGCAGCGTGACCTC-3’

选用50μL的PCR反应体系，根据带有限制性酶切位点的前后引物选择合适的Tm值，来进行目的基因的PCR扩增。

空载质粒的提取，质粒与目的基因的双酶切及切胶回收，质粒与目的基因的连接均参照试剂盒和产品说明书进行，将成功构建的重组表达载体命名为pPICZαA-ChSase II，pPICZαA-ChSase II使用LLB培养基(含25μg/mL博莱霉素)。使用PmeⅠ进行线性化表达载体，电转至毕赤酵母宿主P.pastoris X33感受态细胞，具体操作参照毕赤酵母表达操作手册。

(2)硫酸软骨素酶的制备

用灭菌牙签挑取，生长在YPD平板(含25μg/mL博莱霉素)上的 X33-pPICZαA-ChSase II的菌落，留种后，接种在50/250mL的YPD液体培养基， 28℃，200r/min振荡培养24h。用移液枪吸取1mL菌液至50/250mL BMGY 液体培养基中，30℃，200r/min振荡培养，每隔24h添加1％的甲醇进行诱导产酶，诱导3天(总共添加3次甲醇)。

收集摇瓶发酵得到的发酵液，采用Ni-Sepharose 6Fast Flow进行纯化，制备获得硫酸软骨素酶ChSase II。如图2所示为扩增的硫酸软骨素AC外切酶基因核酸电泳结果，结果显示条带单一且与理论分子量一致。

关于实施例中的酶解液产物硫酸软骨素的分子量分析。

取100mL 4％的硫酸软骨素底物溶液于37℃进行酶解实验，起始加入6ml 酶活约为9U/mL的硫酸软骨素酶液，160r/min搅拌，分别在0.5h，9h取样，利用高效液相色谱进行测定硫酸软骨素的分子量分布。酶解0.5h的产物液相图谱和各组分比例图结果如下图3所示。

酶解9h产物液相图谱机及各组分比例(500Da以下的峰面积为87％)如图 4所示。

一种富含硫酸软骨素和II型胶原蛋白肽的鲟鱼软骨水解物，由上述方法制得，胶原蛋白肽的分子量小于1500Da，硫酸软骨素分子量小于500Da。

鲟鱼软骨复合酶解后产物成分如下：

表1复合酶解液产物基本成分分析

通过上述分子量检测分析可知，本发明通过对鲟鱼软骨进行高压预处理，获得更容易分离硫酸软骨素和II型胶原蛋白的酶解原料，以便于硫酸软骨素酶和蛋白酶与酶解底物充分接触，从而使后续的酶解更为彻底；再配合复合酶解，获得分子量小于500Da的硫酸软骨素和分子量小于1500Da的I型胶原蛋白肽的鲟鱼软骨水解物。高压预处理和复合酶解两种技术结合，大大简化了制备工艺，无需复杂的分离纯化技术，降低制备成本。

上述鲟鱼软骨水解物可以用于壮骨宠物食品的开发，因其含有丰富的小分子量的硫酸软骨素和II型胶原蛋白肽。

因此还给出一种应用，具体为，壮骨食品的开发应用，即一种容易吸收、促进宠物骨骼发育、预防宠物骨类疾病的宠物壮骨食品，优选实施例A，包括以下重量份原料：

原料	比例
		鲟鱼软骨水解物	73％
聚合度2-6的壳寡糖	12％
		牡蛎肽	6.5％
Vc	5.5％
		小分子玻尿酸	2％
钙	1％

配方中各原料按照表中比例混合，300-500的r/min的转速下在混合机中搅拌混匀，混匀后，高温杀菌，制备得到宠物壮骨食品。

优选实施例B，包括以下重量份原料：

原料	比例
		鲟鱼软骨水解物	75.5％
聚合度2-6的壳寡糖	9.5％
		牡蛎肽	7.5％
Vc	4.5％
		小分子玻尿酸	1.5％
钙	1.5％

将通过本专利工艺制作而成的宠物壮骨食品，对关节肿胀的小鼠进行喂食，将关节肿胀情况相同的小鼠分为两组，一组喂食宠物壮骨食品和饲料，一组喂食其他的宠物食品和饲料。

将小鼠喂食3周以后，可以明显发现两组小鼠关节肿胀的情况不一致，观察到喂食宠物食品的小鼠的关节肿胀程度逐渐减轻。相比较不喂食宠物壮骨食品的小鼠，喂食宠物壮骨食品的小鼠的关节肿胀改善比正常恢复的小鼠情况要好。由此可以看出本专利发明的宠物壮骨食品有壮骨的效果。

硫酸软骨素在抗关节炎方面有显著的作用，硫酸软骨素可抑制机体关节中的损伤因子，如基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)、IL-1β的产生，从而减缓软骨损伤的过程，达到缓解关节炎的作用。硫酸软骨素还可以促进成骨细胞生长，诱导新骨生长，加速骨损伤的愈合过程。胶原蛋白为细胞外基质结构蛋白，在动物体内广泛存在，主要存在于动物的皮肤和骨组织中。胶原蛋白肽能够增加骨骼中的钙含量与骨密度，适当补充可以促进骨发育，预防骨质疏松。

本产品中的硫酸软骨素和II型胶原蛋白肽为小分子，小分子宠物吸收更加容易，更好的提高壮骨效果，同时复配壳寡糖，提高肠道的消化吸收能力，促进对壮骨成分的吸收。

本产品中应用了壳寡糖，壳聚糖很容易与透明质酸和硫酸软骨素形成聚电解质复合，壳聚糖与透明质酸的协同作用增强了透明软骨再生的性能。壳寡糖的分子量比壳聚糖小很多，壳寡糖可以溶于水，只有溶于水,才有可能被生物体吸收和利用,表现出生物活性,所以壳寡糖更容易被动物体吸收。

本发明所涉及的一种壮骨宠物食品，可广泛用于不同年龄的宠物，也可与其它宠物饲料同时使用，可使宠物骨骼强健，活力充沛，具有壮骨的功效。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 晶昌明科技贸易（上海）有限公司

<120> 一种富含小分子硫酸软骨素的鱼软骨水解物制备方法

<130> 2022-6-23

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 789（Artificial Sequence）

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Thr His Glu Val Ser Arg Arg His Ile Leu Gln Gly Thr Ala Ala

1 5 10 15

Leu Thr Phe Ala Gly Leu Leu Thr Ala Gly Phe Ala Pro Leu Ala Gln

20 25 30

Ala Ala Glu Ala Ala Thr Pro Ala Asn Leu Asp Ala Leu Arg Glu Arg

35 40 45

Trp Val Asp Gln Ile Thr Gly Arg Leu Leu Ile Asp Pro Ala Asp Pro

50 55 60

Asp Phe Lys Ala Ala Ile Ala Ser Gln Asp Arg Ala Val Asp Lys Ser

65 70 75 80

Val Ser Leu Leu Ala Pro Arg Pro Gly Lys Met Gly Val Phe Thr Asp

85 90 95

Ala Pro Phe Ser Ser Glu Ala Gln Met Val Thr Ser Tyr Lys Arg Leu

100 105 110

Ala Gln Met Ala Ala Ala Trp Ala Thr Pro Gly Ser Lys His Gln Gly

115 120 125

Ser Pro Val Leu Leu Asp Gln Ile Leu Gly Ala Leu Glu Asp Gly Asn

130 135 140

Thr Tyr Ile Tyr Asn Asp Gly Gln Ala Glu Tyr Gly Asn Trp Trp Ser

145 150 155 160

Trp Glu Ile Gly Thr Ser Lys Ala Ala Thr Asp Thr Leu Ala Ile Leu

165 170 175

Gly Ser Asn Val Ser Pro Asp Leu Ile Leu Pro Ser Glu Ala Ala Ile

180 185 190

Asp His Phe Ile Pro Asp Pro Thr Lys Gln Phe Pro Asp Ser Arg Gly

195 200 205

Lys Ile Leu Ser Glu Gly Ala Asn Arg Val Asp Ile Cys Gln Ala Ile

210 215 220

Ile Val Arg Ser Ile Val Gly Gly Asp Thr Ala Arg Leu Ala Ala Ala

225 230 235 240

Ile Ser Ala Leu Ser Ala Leu Trp Asn Tyr Pro Thr Ser Gly Asn Gly

245 250 255

Phe Tyr Ala Asp Gly Ser Phe Val Gln His Thr Thr Ile Pro Tyr Thr

260 265 270

Gly Thr Tyr Gly Val Val Leu Leu Gly Gly Leu Ala Lys Leu Phe Ser

275 280 285

Leu Leu Gly Gly Ser Asp His Ala Val Ser Asp Pro Ser Arg Thr Ile

290 295 300

Leu Phe Asn Thr Val Glu Asp Ser Phe Ala Pro Phe Leu His Asp Gly

305 310 315 320

Leu Met Met Asp Ser Val Arg Gly Arg Ala Ile Ser Arg Thr Gln Glu

325 330 335

Arg Gly Phe Asp Asp Gly Thr Ile Thr Ile Glu Ala Ile Leu Trp Leu

340 345 350

Ala Arg Ala Val Asp Ala Thr Thr Gly Asn Arg Trp Arg Ala Leu Cys

355 360 365

Lys Thr Met Asp Gly Arg Asn Gln Tyr Ser Asn Pro Leu Ala Gly Ala

370 375 380

Ser Ile Pro Arg Thr Ala Leu Leu Lys Glu Leu Ala Ala Ser Ala Thr

385 390 395 400

Tyr Trp Arg Ser Val Thr Ala Gly His Ser Phe Phe Pro Gly Met Asp

405 410 415

Arg Ser Val Tyr Arg Gly Lys Gly Trp Ala Ala Ala Leu Gly Leu Ser

420 425 430

Ser Arg Arg Thr Thr Trp Tyr Glu Cys Gly Asn Gly Glu Asn Asn Leu

435 440 445

Gly Ala Gln Thr Gly Ser Gly Met Thr Tyr Leu Tyr Ala Gly Asn Gln

450 455 460

Gly His Phe Asp Asp Asp Phe Trp Pro Thr Ala Asn Leu Ser Arg Leu

465 470 475 480

Pro Gly Ile Thr Val Asp Thr Thr Pro Leu Pro Pro Lys Val Glu Gly

485 490 495

Glu Trp Gly Ala Ala Thr Pro His Asn Glu Trp Thr Gly Gly Val Thr

500 505 510

Leu Asn Gly Thr Gly Ala Val Gly Met His Leu Val Gly Pro Gly Gly

515 520 525

Thr Gly Leu Gln Ala Arg Lys Ala Trp Phe His Val Ala Glu Met Val

530 535 540

Val Ala Leu Gly Ala Asp Ile His Thr Ala Ser Gly Ala Ala Val Glu

545 550 555 560

Ser Ile Met Glu His Arg Asn Leu Gly Ala Asp Gly Gly Gln Ala Met

565 570 575

Thr Val Asp Gly Arg Pro His Thr Ala Ala Ala Gly Thr Pro Val Ser

580 585 590

Tyr Gly His Pro Arg Trp Ala His Leu Glu Gly Thr Gly Gly Ser Ala

595 600 605

Val Asp Arg Glu Gly Asp Leu Thr Val Leu Arg Glu Gln Arg Thr Gly

610 615 620

Ala Trp Gly Thr Leu Tyr Glu Ala Arg Thr Pro Ala Val Val Ser Arg

625 630 635 640

Gln Tyr Ala Thr Leu Leu Phe Glu His Gly Thr Asp Pro Ala Tyr Pro

645 650 655

Ser Gly Met Ile Leu Pro Gly Ala Ser Ala Met Asp Thr Ala Lys Ala

660 665 670

Ala Gly Lys Ser Ala Pro Arg Val Leu Arg Asn Asp Lys Thr Gly Gln

675 680 685

Gly Leu Glu Leu Asp Lys Lys Thr Thr Ala Ala Leu Phe Trp Ala Pro

690 695 700

Gly Thr Val Gly Asn Leu Thr Ala Asp Gly Pro Ala Cys Val Leu Phe

705 710 715 720

Asn Gly Asn Pro Gly His Gly Val Leu Ala Val Ser Asp Pro Thr Gln

725 730 735

Thr Ala Thr Ser Val Thr Val Thr Ile Arg Asp Ala Arg Tyr Arg Arg

740 745 750

Ile Ser Ser Thr Val Gly Ala Thr Leu Ser Val Asp Arg Asp Gly Asn

755 760 765

Val Thr Ile Thr Ile Pro Thr Ala Gly Leu Leu Gly Arg Thr Val Glu

770 775 780

Val Thr Leu His Arg

785

Claims

1.一种富含小分子硫酸软骨素的鱼软骨水解物制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤三：将步骤二中的酶解液经灭酶后，在8000rpm 10min的条件下离心后获得酶解上清液；

步骤四：将步骤三中的上清液喷雾干燥，获得的即为酶解产物，获得的酶解产物中包括分子量小于500Da的硫酸软骨素和分子量小于1500Da的II型胶原蛋白肽，定义酶解产物为鲟鱼软骨水解物。

2.根据权利要求1所述的一种富含小分子硫酸软骨素的鱼软骨水解物制备方法，其特征在于：所述硫酸软骨素AC外切酶ChSase AC II，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种富含小分子硫酸软骨素的鱼软骨水解物制备方法，其特征在于：所述步骤一中，将鲟鱼软骨洗净，烘干粉碎，置于高压釜中，压力为0.2MPa，温度设置在120-135℃，解离时间为1-4h。

4.根据权利要求1所述的一种富含小分子硫酸软骨素的鱼软骨水解物制备方法，其特征在于：所述步骤二中，酶解所用的蛋白酶是胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的复合酶。

5.根据权利要求4所述的一种富含小分子硫酸软骨素的鱼软骨水解物制备方法，其特征在于：所述胃蛋白酶添加量为2000-3500U/g，木瓜蛋白酶添加量为1500-4000U/g，温度40-60℃，反应时间4-8h。

6.根据权利要求5所述的一种富含小分子硫酸软骨素的鱼软骨水解物制备方法，其特征在于：所述步骤二中，硫酸软骨素酶解添加量为500-2000U/g，温度为20-40℃，pH为5-8，酶解时间5-9h。

7.一种宠物壮骨食品，其特征在于：包括如权利要求1-6所述的一种富含小分子硫酸软骨素的鱼软骨水解物制备方法获得的鲟鱼软骨水解物，鲟鱼软骨水解物68-76％、聚合度2-6的壳寡糖10-13％、牡蛎肽5-9％、Vc3-7％、小分子玻尿酸1-3％。

8.根据权利要求7所述的一种宠物壮骨食品的制备方法，其特征在于：将权利要求7所述的原料，按照合适的比例混合，以300-500r/min的转速下在混合机中搅拌混匀，混匀后，高温杀菌，制备得到宠物壮骨食品。