CN113293186B - 一种低分子量鲟鱼软骨多糖及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种低分子量鲟鱼软骨多糖及其制备方法。本发明提供的低分子量鲟鱼软骨多糖的制备方法包括：将鲟鱼软骨经第一次酶解得到分子量大于10000Da的高分子量软骨多糖，将所述高分子量软骨多糖经过氧化氢溶液处理后，再经第二次酶解得到分子量小于5000Da的低分子量软骨多糖，所述第一次酶解使用的酶为硫酸软骨素专用提取酶，所述第二次酶解使用的酶为硫酸软骨素AC酶。该方法能够有效降低鲟鱼软骨多糖的分子量，同时显著提高其中具有抗结直肠肿瘤活性的软骨多糖的含量，制备得到的产物具有较高的抑制结直肠肿瘤细胞增殖的活性，且对于正常细胞没有毒性作用，具有开发抗肿瘤产品的潜力。

Description

一种低分子量鲟鱼软骨多糖及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种低分子量鲟鱼软骨多糖及其制备方法。
背景技术
软骨多糖(Cartilage polysaccharide，CP)是一种天然酸性黏多糖，通常与蛋白质结合在一起以糖胺聚糖的形式存在。软骨多糖的基本组成单位是D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖通过β-1,3糖苷键连接而成的二糖。
鲟鱼是现存起源最早的脊椎动物之一。鲟鱼全身遍布软骨，鲟鱼的头、脊索、鳍中软骨约占鱼体20％，从鲟鱼软骨中提取的软骨多糖具有调节机体免疫、抗关节炎、抗凝血、调脂降脂、抗动脉粥样硬化和神经元保护和修复作用，在医药、化妆品和食品工业中具有广泛的用途。目前报道的鲟鱼软骨多糖中较少涉及抗肿瘤活性的产品，对特定肿瘤细胞具有较高抑制活性的产品的报道更是甚少。
发明内容
本发明的目的是提供一种低分子量鲟鱼软骨多糖的制备方法。本发明的另一目的是提供该制备方法得到的低分子量软骨多糖，该软骨多糖具有较高的抑制结直肠肿瘤细胞增殖的活性。
本发明以具有抑制结直肠肿瘤细胞增殖活性的低分子量软骨多糖的开发为目的，提供具有特定功能的软骨多糖的制备方法。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种低分子量鲟鱼软骨多糖的制备方法，包括：
将鲟鱼软骨经第一次酶解得到分子量大于10000Da的高分子量软骨多糖，
将所述高分子量软骨多糖经过氧化氢溶液处理后，再经第二次酶解得到分子量小于5000Da的低分子量软骨多糖，
其中，所述第一次酶解使用的酶为硫酸软骨素专用提取酶，所述第二次酶解使用的酶为硫酸软骨素AC酶。
本发明在研发过程中发现，酶解产物对结直肠肿瘤细胞的抑制率与酶解效率并不呈现正相关的关系，小分子的糖越多，分子量越低并不代表对结直肠肿瘤细胞的抑制活性越强。将鲟鱼软骨经硫酸软骨素专用提取酶酶解后，先利用过氧化氢处理，再进行硫酸软骨素AC酶酶解，不仅能够降低鲟鱼软骨多糖的分子量，而且能够显著提高制备得到的鲟鱼软骨多糖中具有抑制结直肠肿瘤细胞增殖活性的低分子量软骨多糖的含量，提高其对于结直肠肿瘤细胞增殖的抑制活性。
优选地，所述过氧化氢溶液的浓度为2-4％。
进一步优选地，所述过氧化氢溶液处理为：将所述高分子量的软骨多糖按照质量体积比g：ml为(1-3)：10与所述过氧化氢溶液混合，于32-37℃处理1-2h，再于65-75℃加热处理8-12min。
在过氧化氢溶液处理后进行第二次酶解，其中，硫酸软骨素AC酶的用量为0.05-0.15IU/mg底物。
优选地，经过氧化氢溶液处理后，将底物溶液浓度调整为0.5-2mg/mL后，再进行第二次酶解。
优选地，第二次酶解的酶解条件为：pH5-7、34-38℃条件下酶解80-90min。
本发明发现，与软骨多糖降解酶ABC等降解酶相比，采用硫酸软骨素AC酶能够显著提高鲟鱼软骨多糖中具有抑制结直肠肿瘤活性的低分子量软骨多糖的含量，而且，上述用量的AC酶、底物浓度和酶解工艺也能够显著促进活性物质的含量提高。
在第二次酶解后，将酶解产物经无水乙醇沉淀10-14h，收集沉淀物，分离沉淀物中的低分子量软骨多糖。
上述低分子量软骨多糖的分离优选采用透析法：具体可为，将所述沉淀物溶解后，使用截留量为5000Da的透析袋进行透析22-26h，得到低分子量软骨多糖。
上述低分子量软骨多糖可为经冻干处理得到的冻干粉。
本发明所述方法的第一次酶解过程中，硫酸软骨素专用提取酶的用量为15-25mg硫酸软骨素专用提取酶/g鲟鱼软骨。
本发明发现，与现有技术常用的多酶复合酶解相比，仅采用硫酸软骨素专用提取酶进行酶解能够显著提高最终获得的低分子量鲟鱼软骨多糖中结直肠肿瘤抑制活性物质的含量。
优选地，第一次酶解的酶解条件为：pH 6-8、58-60℃条件下酶解4-5h。
在第一次酶解后，将酶解产物与三氯乙酸(TCA)混合后，去除蛋白质并得到滤液，再采用无水乙醇沉淀所述滤液，收集沉淀物。
优选地，对所述沉淀物进行盐析后再用无水乙醇沉淀，分离沉淀物中的高分子量软骨多糖。
上述低分子量软骨多糖的分离优选采用透析法：具体可为，将所述沉淀物溶解后，使用截留量为8000Da的透析袋进行透析40-50h，得到高分子量软骨多糖。
上述高分子量软骨多糖可为经冻干处理得到的冻干粉。
上述第一次酶解和第二次酶解后，还包括对酶解产物进行高温灭酶处理的步骤。
本发明所述的方法中，鲟鱼软骨的制备包括：将鲟鱼去头刨片后，经75-80℃高温水煮15-25min后，剔除鲟鱼肉得到鲟鱼软骨。
优选地，将所述鲟鱼软骨经无水乙醇浸泡后，冻干得到鲟鱼软骨粉。
作为本发明的优选方案，所述低分子量软骨多糖的制备方法包括如下步骤：
(1)将鲟鱼去头刨片，78-80℃水煮18-20min，剔除肉，得到鲟鱼软骨；
(2)将鲟鱼软骨采用无水乙醇浸泡1.2-1.8h，重复1次，冻干备用；
(3)将步骤(2)制备的鲟鱼软骨粉置于碳酸钠溶液中至浓度为0.08-0.12g/mL，按照酶和鲟鱼软骨粉的质量比为18-22mg/g加入硫酸软骨素专用提取酶，60℃酶解4.5h后，煮沸灭酶；
(4)将步骤(3)的灭酶产物冷却后，加入TCA静置1.8-2.2h,离心去除蛋白，收集滤液；
(5)在步骤(4)的滤液中加入2-3倍体积的无水乙醇，静置10-14h，离心收集沉淀；
(6)在步骤(5)的沉淀中加入沉淀重量18-22倍体积的水溶解，再加入氯化十六烷吡啶进行盐析，静置1.8-2.2h后离心收集沉淀；
(7)将步骤(6)得到的沉淀溶于pH为7的2.4-2.6mol/L的氯化钠溶液中，加无水乙醇，1.8-2.2h后离心收集沉淀，沉淀溶于适量水中，透析袋进行透析，截留分子量为8000道尔顿，透析45-50h，冻干制备备用；
(8)将步骤(7)的冻干产物按照质量体积比(g:mL)为(1.5-2.5)：10的比例溶于浓度为2.8-3.2％的过氧化氢溶液中，34-36℃处理1.4-1.6h后，再于68-70℃加热8-10min，冷却后调整底物浓度为0.75-1mg/mL，按照0.075-0.1IU/mg底物的比例加入硫酸软骨素AC酶，pH为5-7、35℃条件下搅拌80-90min，煮沸灭酶后，加入2-3倍体积的无水乙醇，沉淀10-14h后离心收集沉淀，去离子水溶解，使用截留量为5000Da的透析袋进行透析22-26h，冻干即得。
本发明还提供一种低分子量鲟鱼软骨多糖，其由以上所述的低分子量鲟鱼软骨多糖的制备方法制备得到。
优选地，所述低分子量鲟鱼软骨多糖的分子量为3000-4000Da。
本发明提供的低分子量鲟鱼软骨多糖具有较高的结直肠肿瘤细胞抑制活性，能够有效抑制结直肠肿瘤细胞(尤其是恶性肿瘤细胞)的增殖，并且对正常细胞没有毒性作用。
基于上述功能，本发明提供所述低分子量鲟鱼软骨多糖在制备抗肿瘤产品中的应用。
优选地，所述肿瘤为结直肠肿瘤。更优选为结直肠恶性肿瘤。
本发明的有益效果在于：本发明提供的低分子量鲟鱼软骨多糖的制备方法简单易行，能够有效降低鲟鱼软骨多糖的分子量，获得小分子量的软骨多糖，而且能够显著提高其中具有抗结直肠肿瘤活性的软骨多糖的含量，制备得到的产物具有较高的抑制结直肠肿瘤细胞增殖的活性，且对于正常细胞没有毒性作用，具有开发抗肿瘤产品的潜力，对于鲟鱼活性物质的开发和深加工具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实验例2中低分子量鲟鱼软骨多糖对细胞增殖率的影响，其中A为实施例1的低分子量鲟鱼软骨多糖对结直肠癌细胞HT-29的影响，B为实施例1的低分子量鲟鱼软骨多糖对正常结直肠细胞NCM460的影响，C为实施例2的低分子量鲟鱼软骨多糖对结直肠癌细胞HT-29的影响，D为对比例4的低分子量鲟鱼软骨多糖对结直肠癌细胞HT-29的影响，E为对比例3的低分子量鲟鱼软骨多糖对结直肠癌细胞HT-29的影响，F为对比例2的低分子量鲟鱼软骨多糖对结直肠癌细胞HT-29的影响，G为对比例1的低分子量鲟鱼软骨多糖对结直肠癌细胞HT-29的影响。
图2为本发明实验例2中鲟鱼软骨多糖对结直肠癌细胞HT-29周期分布的影响。
图3为本发明实验例2中鲟鱼软骨多糖对细胞NCM460周期分布的影响。
图4为本发明实验例2中鲟鱼软骨多糖对结直肠癌细胞HT-29凋亡的影响。
图5为本发明实验例2中鲟鱼软骨多糖对结直肠细胞NCM460凋亡的影响。
图6为本发明实验例2中鲟鱼软骨多糖对细胞Caspase-3活性的影响，其中左侧为结直肠癌细胞HT-29，右侧为正常结直肠细胞NCM460。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中使用的硫酸软骨素专用提取酶购自诺维信，其酶活单位为12000IU/mg；硫酸软骨素AC酶购自北京碧澄生物科技有限公司，其酶活单位为500IU/mL。
实施例1
本实施例提供一种低分子量软骨多糖的制备方法，其步骤如下：
(1)将鲟鱼清洗、去头刨片，80℃水煮20min，剔除肉等，得到干净的鲟鱼软骨；
(2)将步骤(1)的鲟鱼软骨采用无水乙醇浸泡1.5h，重复1次，冻干备用；
(3)将步骤(2)制备的鲟鱼软骨粉10g置于100mL碳酸钠溶液中，加入200mg硫酸软骨素专用提取酶，60℃酶解4.5h后，煮沸灭酶；
(4)将步骤(3)的灭酶产物冷却后，加入6.11mL的6.1mol/L的TCA静置2h,离心去除蛋白，收集滤液；
(5)在步骤(4)的滤液中加入3倍体积的无水乙醇，静置12h，离心收集沉淀；
(6)在步骤(5)得到的沉淀中加入沉淀重量20倍体积的水溶解，再加入2.3mg氯化十六烷吡啶进行盐析，静置2h后离心收集沉淀；
(7)将步骤(6)得到的沉淀溶于100mL、pH为7的2.5mol/L的氯化钠溶液中，加75mL无水乙醇，2h后离心收集沉淀，沉淀溶于适量水中，透析袋进行透析，截留分子量为8000道尔顿，透析48h，冻干制备备用；
(8)将步骤(7)的冻干产物2g溶于10mL浓度为3％的过氧化氢溶液中，35℃处理1.5h后，再于70℃加热10min，冷却后调整底物浓度为1mg/mL，按照0.1IU/mg底物的比例加入硫酸软骨素AC酶，pH为7、35℃条件下搅拌90min，煮沸灭酶后，加入2倍体积的无水乙醇，沉淀12h后离心收集沉淀，10ml去离子水溶解，使用截留量为5000Da的透析袋进行透析24h，冻干即得。
本实施例还提供由上述制备方法制备得到的低分子量鲟鱼软骨多糖。
实施例2
本实施例提供一种低分子量软骨多糖的制备方法，其与实施例1的区别仅在于步骤(8)，步骤(8)具体如下：
将步骤(7)的冻干产物2g溶于10mL浓度为3％的过氧化氢溶液中，35℃处理1.5h后，再于70℃加热10min，冷却后调整底物浓度为0.75mg/mL，按照0.075IU/mg底物的比例加入硫酸软骨素AC酶，pH为7、35℃条件下搅拌80min，煮沸灭酶后，加入2倍体积的无水乙醇，沉淀12h后离心收集沉淀，10ml去离子水溶解，使用截留量为5000Da的透析袋进行透析24h，冻干即得。
本实施例还提供由上述制备方法制备得到的低分子量鲟鱼软骨多糖。
对比例1
本对比例提供一种低分子量软骨多糖的制备方法，其与实施例1的区别仅在于步骤(8)，步骤(8)具体如下：
将步骤(7)的冻干产物2g溶于10mL浓度为3％的过氧化氢溶液中，35℃处理1.5h后，再于70℃加热10min，冷却后调整底物浓度为1.25mg/mL，按照0.125IU/mg底物的比例加入硫酸软骨素AC酶，pH为7、35℃条件下搅拌100min，煮沸灭酶后，加入2倍体积的无水乙醇，沉淀12h后离心收集沉淀，10ml去离子水溶解，使用截留量为5000Da的透析袋进行透析24h，冻干即得。
对比例2
本对比例提供一种低分子量软骨多糖的制备方法，其与实施例1的区别仅在于步骤(8)，步骤(8)具体如下：
将步骤(7)的冻干产物2g溶于10mL浓度为3％的过氧化氢溶液中，35℃处理1.5h后，再于70℃加热10min，冷却后调整底物浓度为0.5mg/mL，按照0.05IU/mg底物的比例加入硫酸软骨素AC酶，pH为7、35℃条件下搅拌70min，煮沸灭酶后，加入2倍体积的无水乙醇，沉淀12h后离心收集沉淀，10ml去离子水溶解，使用截留量为5000Da的透析袋进行透析24h，冻干即得。
对比例3
本对比例提供一种低分子量软骨多糖的制备方法，其与实施例1的区别仅在于步骤(8)中去除氢氧化钠的处理步骤，步骤(8)具体如下：
将步骤(7)的冻干产物2g溶于水中，调整底物浓度为1mg/mL，按照0.1IU/mg底物的比例加入硫酸软骨素AC酶，pH为7、35℃条件下搅拌90min，煮沸灭酶后，加入2倍体积的无水乙醇，沉淀12h后离心收集沉淀，10ml去离子水溶解，使用截留量为5000Da的透析袋进行透析24h，冻干即得。
对比例4
本对比例提供一种低分子量软骨多糖的制备方法，其与实施例1的区别仅在于步骤(8)中采用软骨多糖降解酶ABC进行酶解，步骤(8)具体如下：
将步骤(7)的冻干产物2g溶于10mL浓度为3％的过氧化氢溶液中，35℃处理1.5h后，再于70℃加热10min，冷却后调整底物浓度为1mg/mL，按照0.1IU/mg底物的比例加入软骨多糖降解酶ABC酶，pH为7、35℃条件下搅拌90min，煮沸灭酶后，加入2倍体积的无水乙醇，沉淀12h后离心收集沉淀，10ml去离子水溶解，使用截留量为5000Da的透析袋进行透析24h，冻干即得。
实验例1分子量的测定
通过HPGPC测定各实施例制备的低分子量软骨多糖的分子量和纯度。首先得到lgMp-RT(峰位分子量)，lgMw-RT(重均分子量)，lgMn-RT(数均分子量)校正曲线。
lgMp-RT校正曲线方程为：y＝-0.1871x+12.009，R2＝0.9933；
lgMw-RT校正曲线方程为：y＝-0.2014x+12.661，R2＝0.9912；
lgMn-RT校正曲线方程为：y＝-0.1812x+11.711，R2＝0.9919；
根据标准品曲线，得出计算公式进而计算出每个样品的分子量大小。经测定，降解前分子量为49760Da，经酶解处理后，实施例1和2中制备得到的具有对结肠癌HT-29细胞具有较高抑制活性的低分子量软骨多糖的分子量均低于5000Da，其中实施例1的低分子量软骨多糖的分子量为3940Da，显著低于降解前分子量。
实验例2低分子量软骨多糖对正常细胞和结直肠癌细胞的作用分析
对各实施例和对比例制备得到的低分子量软骨多糖对结直肠癌细胞的抑制效果进行分析，具体实验方法和实验结果如下：
1、实验材料
人结直肠癌细胞株HT-29和人结肠上皮细胞NCM460。
2、细胞培养
从液氮中取出冻存的细胞，遵从慢冻快融的原则，立即放入37℃水浴锅，迅速摇动两分钟，使其尽快融化。按标准操作规程将细胞转移到培养瓶中。在DMEM培养基中加入10％胎牛血清，1‰青、链霉素得到完全培养基，人源结肠癌细胞HT-29细胞生长于完全培养基中，二氧化碳细胞培养箱中37℃培养。细胞长满80％以上汇合度时，胰酶消化，传代培养。
3、细胞传代
(1)细胞贴壁生长后，24h更换DMEM培养液一次；
(2)吸去原培养液；PBS缓慢冲洗2次，避免血清对胰蛋白酶的消化效率的影响；
(3)添加1mL 0.25％的胰蛋白酶消化HT-29细胞，NCM460细胞则用1mL 0.06％的胰蛋白酶消化；
(4)显微镜下观察细胞形态，防止消化过度；
(5)加入新鲜DMEM培养液终止消化，缓慢多次吹打成分散单细胞，稀释后分装。
4、细胞增殖检测
结直肠癌细胞分别以5×104cell/mL密度加入96孔板中，二氧化碳培养箱静置培养，贴壁过夜；弃去原细胞培养液，每孔加入等体积的不同浓度的鲟鱼软骨多糖CS溶液(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL)，另设对照组和空白组，每个浓度设6个平行，继续培养24h后，向每个孔中添加10μL的CCK-8，37℃避光反应；酶标仪测定A450值，并按以下公式计算：
Figure BDA0003061041050000101
5、细胞周期的测定
将细胞密度按1×106cell/mL加入到6孔培养孔板中，二氧化碳培养箱中贴壁过夜。吸去原细胞培养液，每孔加入等体积的不同浓度的鲟鱼软骨多糖CS溶液(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL)，另设不添加任何受试物只加有细胞的对照组，作用24h后，进行如下处理：
(1)离心，收集细胞；
(2)PBS溶液洗涤细胞两次；
(3)将细胞分散在1mL 4℃预冷的70％的乙醇溶液中，于4℃固定细胞；
(4)4℃离心，PBS洗涤残留的乙醇；
(5)向沉淀中加入适量的PI(碘化丙啶)染色液，吹散混匀细胞，尽短时间内进行上机检测，在488nm处进行测定。
6、细胞凋亡的测定
将细胞密度按1×106cell/mL加入到6孔培养孔板中，二氧化碳培养箱中贴壁处理10-12h,吸去原细胞培养液，每孔加入等体积的不同浓度的鲟鱼软骨多糖CS溶液(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL)，另设不添加任何受试物只加有细胞的对照组，共培养24h后，进行如下处理：
(1)离心，收集细胞；
(2)PBS溶液洗涤细胞两次；
(3)适量的Annexin V-FITC结合液重悬细胞，并转移至无菌的离心管中；
(4)加入Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温下孵育15min；
(5)流式细胞仪上机前添加适量少许的PI(碘化丙啶)染色液。
7、Caspase-3活性测定
将细胞密度按1×106cell/mL加入到6孔培养孔板中，二氧化碳培养箱中贴壁处理10-12h,吸去原细胞培养液，加入头骨及脊骨软骨多糖，另设对照组以及阳性对照组。24h后，胰蛋白酶消化细胞，经PBS洗涤一次后，冰浴条件下，剧烈震荡使细胞裂解完全，高速离心后，小心的吸取上清液于新的无菌EP管中。在收集好的上清液中加入底物Ac-DEVD-ρNA(acetyl-Asp-Glu-Val-Aspρ-nitroanilide)，37℃下孵育2h后，用酶标仪测定A405。同时制作ρNA(ρ-nitroanilide)标准曲线并用Bradford法测定样品中的蛋白含量。最终的Caspase-3酶活力单位定义为每μg蛋白样品在37℃、2h内作用于底物Ac-DEVD-ρNA所产生的ρNA的nmol量。
8、实验结果
(1)各实施例和对比例的低分子量鲟鱼软骨多糖对结直肠癌细胞增殖的抑制率检测结果如表1所示。低分子量鲟鱼软骨多糖的添加的浓度为1000μg/mL，抑制率计算公式为：
抑制率＝(1-A处理/A对照)100％。
表1结直肠癌细胞的抑制率
软骨多糖样品 抑制率(％)
实施例1 85.2％
实施例2 68.29％
对比例1 58.09％
对比例2 50.11％
对比例3 40.21％
对比例4 39.22％
(2)不同浓度的低分子量软骨多糖对细胞活性的影响
利用CCK-8试剂盒测定并计算不同浓度低分子量的CS(实施例1-2以及对比例1-4)分别作用结肠癌细胞HT-29和正常人源的NCM460细胞24h后的细胞存活率，结果如图1所示。实施例1和2中不同浓度的低分子量软骨多糖均能够在不同程度上降低结肠癌细胞的存活率，且抑制率呈现剂量依赖效应。从实验结果中发现实施例1和2的低分子量软骨多糖对结肠癌细胞生长的抑制率均大于阳性对照(顺铂)的作用。
同时，对结直肠癌细胞HT-29抑制效果最大可达90％，增殖活性变化差异性极显著(P<0.01)。但是对与正常肠上皮细胞NCM460的抑制率均小于10％，显著低于阳性对照顺铂(28％)，说明，低分子量的CS对正常细胞毒性较小。
(3)低分子量软骨多糖对细胞周期的作用
细胞周期性循环运转，包括第一时间间隔期—G1、DNA复制合成期—S、第二时间间隔期—G2和细胞分裂期—M。G1期主要合成RNA和核糖体，为S期的DNA复制提供物质和能量。细胞进入有丝分裂的准备期—G2后，细胞会合成RNA及所需蛋白质。G2期细胞内DNA含量是G1的2倍，但是在S期DNA合成开始，含量则介于G1和G2之间。PI(propidium iodide)，俗称碘化丙啶，可以和双链DNA相结合产生荧光，PI作用细胞后，在特定的激发波波长条件下，通过细胞流式仪可以测定细胞内DNA含量，并分析细胞周期变化。
为了进一步分析CS抑制结肠癌增殖的作用方式，采用流式细胞仪对细胞周期进行分析。根据之前增殖实验的结果，选择对结肠癌细胞具有抑制能力的三个浓度为本实验的浓度剂量，实验结果如图2和图3所示。
结果表明，与对照组相比，三个浓度的鲟鱼低分子量的CS(实施例1)可以显著提高处于G0/G1期的细胞比例，对HT-29细胞由最初的47.2％提高至61.39％(P<0.05)，S期比例由36.13％缩短至20.12％(P<0.05)；CS使细胞发生G0/G1期阻滞，进而降低进入DNA合成期的细胞数量，抑制结直肠癌细胞增殖活性。同时发现，CS对HT-29细胞周期的阻滞效果强于对NCM460，与前述细胞增殖实验结果吻合。
(4)低分子量软骨多糖对细胞凋亡的作用
细胞凋亡涉及形态、生化反应、分子水平等一系列特征变化，使用单一的某一种方法很是难对细胞凋亡的情况进行全面以及精确的分析和评价的，因此，选取Annexin V-FITC/PI法、Caspase-3酶活性检测两种方法，分别侧重于凋亡早期和晚期的不同事件对鲟鱼低分子量的软骨多糖的凋亡调节作用进行评价。
①Annexin V-FITC/PI法检测
细胞凋亡发生早期，细胞膜内侧的PS(phosphatidylserin,磷酯酰丝氨酸)翻转至细胞膜外表面，Annexin V是一类磷脂结合蛋白，具有较高的亲和力以及依赖性，易与PS等发生结合。FITC可以标记Annexin V并带有荧光，能够在特定的激发波波长下分析细胞各个时期细胞凋亡情况，由于凋亡早期，细胞膜完整性较好，PI(propidium iodide,碘化丙啶)是无法穿透其细胞膜的，但可以透过凋亡晚期或坏死细胞的细胞膜而将细胞核染成红色。因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI则被排除在活细胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)之外，当FITC和PI结合后，晚期凋亡细胞呈现出双阳性(Annexin V+/PI+)的结果。
根据前述低分子量的CS抑制结直肠癌细胞增殖活性实验的结果，本实验分别选择了CS浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL作用于结肠癌细胞HT-29和正常结肠上皮细胞NCM460，24h后，测定细胞凋亡水平，其中实施例1的低分子量软骨多糖的结果如图4和图5所示。与对照相比，不同浓度的CS均可以显著提高结肠癌细胞的总凋亡率。而且CS作用下的结肠癌细胞HT-29中早期、晚期及总凋亡率均高于同浓度下的正常上皮细胞NCM460中的各个时期的凋亡率，与细胞抑制实验结果吻合。
②Caspase-3活性检测
Caspase家族是细胞凋亡过程中重要的作用分子，其中Caspase-3是凋亡信号的关键执行分子，可以特异性地作用与底物，促使细胞凋亡的发生。
CS与细胞作用24h后，测定Caspase-3的活性，其中实施例1的低分子量软骨多糖的结果如图6所示，与空白对照组相比，高浓度400μg/mL的CS可以显著提高结直肠癌细胞HT-29中Caspase-3活性，且存在剂量效应。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种低分子量鲟鱼软骨多糖的制备方法，其特征在于，包括：
将鲟鱼软骨经第一次酶解得到分子量大于10000Da的高分子量软骨多糖，
将所述高分子量软骨多糖经过氧化氢溶液处理后，再经第二次酶解得到分子量小于5000Da的低分子量软骨多糖，
所述第一次酶解使用的酶为硫酸软骨素专用提取酶，所述第二次酶解使用的酶为硫酸软骨素AC酶；
所述第一次酶解中，硫酸软骨素专用提取酶的用量为15-25mg硫酸软骨素专用提取酶/g鲟鱼软骨；酶解条件为：pH6-8、58-60℃条件下酶解4-5h；
在所述第一次酶解后，将酶解产物与三氯乙酸混合后，去除蛋白质并得到滤液，再采用无水乙醇沉淀所述滤液，收集沉淀物；对所述沉淀物进行盐析后再用无水乙醇沉淀，分离沉淀物中的所述高分子量软骨多糖；
所述过氧化氢溶液的浓度为2-4％；所述过氧化氢溶液处理为：将所述高分子量的软骨多糖按照质量体积比g：mL为(1-3)：10与所述过氧化氢溶液混合，于32-37℃处理1-2h，再于65-75℃加热处理8-12min；
所述第二次酶解中，硫酸软骨素AC酶的用量为0.05-0.15IU/mg底物；底物溶液的浓度为0.5-2mg/mL；酶解条件为：pH5-7、34-38℃条件下酶解80-90min；
在所述第二次酶解后，将酶解产物经无水乙醇沉淀10-14h，收集沉淀物，分离沉淀物中的所述低分子量软骨多糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述鲟鱼软骨的制备包括：将鲟鱼去头刨片后，经75-80℃高温水煮15-25min后，剔除鲟鱼肉得到鲟鱼软骨。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将所述鲟鱼软骨经无水乙醇浸泡后，冻干得到鲟鱼软骨粉。
4.权利要求1～3任一项所述的制备方法在制备抗结直肠肿瘤的产品中的应用。
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