CN106699924A - 一种用复合酶提取猪鼻骨中的硫酸软骨素的方法 - Google Patents
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Abstract
一种能够从猪鼻骨中提取硫酸软骨素的方法,它先使用复合酶将猪鼻骨中的硫酸软骨素提取出来,再使用超滤膜对其进一步提纯,经过复合酶酶解、盐解、二次酶解、超滤膜纯化、脱水五个步骤从猪鼻骨中提取硫酸软骨素。结果此法与传统提取方法相比较,不需要乙醇,纯度和产率都有明显提高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,属于从猪鼻骨中提取硫酸软骨素的方法。
背景技术
硫酸软骨素(Chondroitin sulfate)是一种酸性粘多糖,广泛存在于哺乳动物的软骨、喉骨、鼻骨和气管中。硫酸软骨素是由葡萄糖醛酸和氨基己糖交替连结而成的双糖聚合物,它含有50~70 个双糖基本结构,分子量为10000~50000。按其化学组成和结构,可分为CSA、C、D、E、F、H 等多种同分异构体,药用硫酸软骨素是从动物软骨中提取的,主要是A、C及各种硫酸软骨素的混合物。CSA 和CSC 均由D2氨基葡萄糖醛和N2乙酰2D2氨基半乳糖组成,只是硫酸基团位置不同。
硫酸软骨素通常与蛋白质结合成糖蛋白的形式存在,当其水解时发生消去反应,连接硫酸软骨素与蛋白质中丝氨酸羟基的苷键断裂,可以得到游离态的硫酸软骨素。硫酸软骨素为白色或微黄色粉末,具有吸湿性,易溶于水而成粘度较大的溶液,难溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙醇、丙酮和冰醋酸等有机溶剂,并且遇热不稳定,乙酰基易发生水解脱落,在酸性条件下更易水解成不同聚合度的低聚糖。硫酸软骨素具有降血脂、抗凝血、抗炎症及抗肿瘤等生理活性,临床上可用于预防动脉粥状硬化、提高机体免疫力、治疗风湿病和肾炎及由链霉素引起的听觉障碍。硫酸软骨素与铜等金属离子结合可用于治疗皮肤病,与硝酸铋或氢氧化铝反应得到的络合物可用于治疗消化性溃疡,与苯甲酸酯、利多卡因或布比卡因作用生成的衍生物可用作麻醉剂。作为食品添加剂,硫酸软骨素可用于食品的乳化、保湿和祛除异味。在化妆品中添加硫酸软骨素,可调节皮肤的细胞代谢,促进营养的吸收,保持皮肤的水分和改善发质。
随着硫酸软骨素生物活性不断被揭示和其应用领域的不断扩展,有关硫酸软骨素的提取、纯化和分离技术已取得了一定的研究成果,但应用于生产实际还有许多需要改进和完善之处。目前,硫酸软骨素生产厂家主要采用的方法成本高,产率和纯度低。所以,本公司开发了复合酶法从猪鼻骨中提取硫酸软骨素,以降低成本,提高效益。
发明内容
本发明提供了一种全新的方法(复合酶法)从猪鼻骨中提取硫酸软骨素,能够有效地降低成本,并提高产品的产率和纯度。
为此,本发明通过以下技术方案予以实现:
1、复合酶酶解
将干燥的猪鼻骨粉碎至粉末,加入其4倍重量的水。加热至80℃,保温4~6小时,然后降温。降温至50~60℃时加入原料量1%~7%的复合酶(蛋白酶,淀粉酶,果胶酶的质量比为47∶31∶22),保温搅拌酶解12~15 小时。
2、盐解
用盐酸将复合酶水解液的pH调到6.2~7.5,按复合酶水解液体积的10%~14%加入浓度为2%的氯化钠溶液,搅拌溶解后,升温到85℃,保温2小时,然后降温至室温,用双层纱布过滤;留下滤液,测量质量待用。
3、二次酶解
用浓度为1%的氢氧化钠溶液将滤液调节pH到8.0~9.0,按滤液与胰蛋白酶1000∶1.3的质量比加入胰蛋白酶,于40~50℃酶解1.5小时后,再按1000∶1.8的质量比加入胃蛋白酶,40~50℃酶解2小时。
4、超滤膜纯化
用50nm孔径的管型聚丙烯腈超滤膜过滤上步得到的溶液,设定溶液的透过速度为50L/h·m²~80 L/ h·m²,同时加场强为1600V/m~1900V/m的直流电场(方向与溶液流动的方向一致)和频率为40000Hz~50000Hz的超声波场(功率为270瓦),弃掉滤液,所得到的糊状物即为较高纯度的硫酸软骨素。
5、脱水
最后,用95%以上的丙酮对产品进行脱水,再真空干燥,即可。
本发明的有益效果是:采用复合酶法分离猪鼻骨中的硫酸软骨素,并且增加了纯化过程,有效地降低了生产成本,并且提高了产品的产率和纯度。
四、具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例一:
1、复合酶酶解
称取100千克干燥的猪鼻骨粉碎至粉末,加入其400L的水。加热至80℃,保温5.5小时,然后降温。降温至59℃时加入原料量6%的复合酶(蛋白酶,淀粉酶,果胶酶的质量比为47∶31∶22),保温搅拌酶解14 小时。
2、盐解
用盐酸将复合酶水解液的pH调到7.3,按复合酶水解液体积的13%加入浓度为2%的氯化钠溶液,搅拌溶解后,升温到85℃,保温90min,然后降温至室温,用双层纱布过滤;留下滤液,测量质量待用。
3、二次酶解
用浓度为1%的氢氧化钠溶液将滤液调节pH到8.9,按滤液与胰蛋白酶1000∶1.3的质量比加入胰蛋白酶,于44℃酶解1.5小时后,再按1000∶1.8的质量比加入胃蛋白酶,于48℃酶解2小时。
4、超滤膜纯化
用50nm孔径的管型聚丙烯腈超滤膜过滤上步得到的溶液,设定溶液的透过速度为70L/h·m²,同时加场强为1850V/m的直流电场(方向与溶液流动的方向一致)和频率为48000Hz的超声波场(功率为270瓦),弃掉滤液,所得到的糊状物即为较高纯度的硫酸软骨素。
5、脱水
最后,用95%以上的丙酮对产品进行脱水,再真空干燥,即可。
6、对照
称取100千克同一批次的猪鼻骨,采用传统工艺提取其中的硫酸软骨素,乙醇用量25146L,产出硫酸软骨素20.36kg,纯度74.26%,产率48.24%。称取100千克同一批次的猪鼻骨,采用稀碱—酶解结合法工艺提取其中的硫酸软骨素,乙醇用量0L,产出硫酸软骨素27.29kg,纯度91.05%,产率79.28%。通过对比发现:传统工艺明显地成本高,效益低。通过对照发现:传统工艺明显地成本高,效益低。
实施例二:
1、复合酶酶解
称取100千克干燥的猪鼻骨粉碎至粉末,加入其400L的水。加热至80℃,保温5小时,然后降温。降温至53℃时加入原料量2%的复合酶(蛋白酶,淀粉酶,果胶酶的质量比为47∶31∶22),保温搅拌酶解13 小时。
2、盐解
用盐酸将复合酶水解液的pH调到6.3,按复合酶水解液体积的14%加入浓度为2%的氯化钠溶液,搅拌溶解后,升温到85℃,保温2小时,然后降温至室温,用双层纱布过滤;留下滤液,测量质量待用。
3、二次酶解
用浓度为1%的氢氧化钠溶液将滤液调节pH到8.1,按滤液与胰蛋白酶1000∶1.3的质量比加入胰蛋白酶,于45℃酶解1.5小时后,再按1000∶1.8的质量比加入胃蛋白酶,于46℃酶解2小时。
4、超滤膜纯化
用50nm孔径的管型聚丙烯腈超滤膜过滤上步得到的溶液,设定溶液的透过速度为55L/h·m²,同时加场强为1680V/m的直流电场(方向与溶液流动的方向一致)和频率为42000Hz的超声波场(功率为270瓦),弃掉滤液,所得到的糊状物即为较高纯度的硫酸软骨素。
5、脱水
最后,用95%以上的丙酮对产品进行脱水,再真空干燥,即可。
6、对照
称取100千克同一批次的猪鼻骨,采用传统工艺提取其中的硫酸软骨素,乙醇用量25146L,产出硫酸软骨素20.36kg,纯度74.26%,产率48.24%。称取100千克同一批次的猪鼻骨,采用稀碱—酶解结合法工艺提取其中的硫酸软骨素,乙醇用量0L,产出硫酸软骨素26.81kg,纯度90.94%,产率77.80%。通过对比发现:传统工艺明显地成本高,效益低。
实施例三:
1、复合酶酶解
称取100千克干燥的猪鼻骨粉碎至粉末,加入其400L的水。加热至80℃,保温5小时,然后降温。降温至56℃时加入原料量4%的复合酶(蛋白酶,淀粉酶,果胶酶的质量比为47∶31∶22),保温搅拌酶解12 小时。
2、盐解
用盐酸将复合酶水解液的pH调到6.8,按复合酶水解液体积的12%加入浓度为2%的氯化钠溶液,搅拌溶解后,升温到85℃,保温2小时,然后降温至室温,用双层纱布过滤;留下滤液,测量质量待用。
3、二次酶解
用浓度为1%的氢氧化钠溶液将滤液调节pH到8.4,按滤液与胰蛋白酶1000∶1.3的质量比加入胰蛋白酶,于46℃酶解1.5小时后,再按1000∶1.8的质量比加入胃蛋白酶,于44℃酶解2小时。
4、超滤膜纯化
用50nm孔径的管型聚丙烯腈超滤膜过滤上步得到的溶液,设定溶液的透过速度为67L/h·m²,同时加场强为1740V/m的直流电场(方向与溶液流动的方向一致)和频率为44000Hz的超声波场(功率为270瓦),弃掉滤液,所得到的糊状物即为较高纯度的硫酸软骨素。
5、脱水
最后,用95%以上的丙酮对产品进行脱水,再真空干燥,即可。
6、对照
称取100千克同一批次的猪鼻骨,采用传统工艺提取其中的硫酸软骨素,乙醇用量25146L,产出硫酸软骨素20.36kg,纯度74.26%,产率48.24%。称取100千克同一批次的猪鼻骨,采用稀碱—酶解结合法工艺提取其中的硫酸软骨素,乙醇用量0L,产出硫酸软骨素28.41kg,纯度97.31%,产率88.21%。通过对比发现:传统工艺明显地成本高,效益低。
Claims (5)
1.一种新的提取猪鼻骨中的硫酸软骨素的方法;其特征在于:先使用复合酶将猪鼻骨中的硫酸软骨素提取出来,再使用超滤膜对其进一步提纯。
2.根据权利要求1所述的的方法;其特征在于:提取猪鼻骨中的硫酸软骨素采用如下步骤:(1)复合酶酶解:将干燥的猪鼻骨粉碎至粉末,加入其4倍重量的水;加热至80℃,保温4~6小时,然后降温;降温至50~60℃时加入原料量1%~7%的复合酶(蛋白酶,淀粉酶,果胶酶的质量比为47∶31∶22),保温搅拌酶解12~15 小时;(2)盐解:用盐酸将复合酶水解液的pH调到6.2~7.5,按复合酶水解液体积的10%~14%加入浓度为2%的氯化钠溶液,搅拌溶解后,升温到85℃,保温2小时,然后降温至室温,用双层纱布过滤;留下滤液,测量质量待用;(3)二次酶解:用浓度为1%的氢氧化钠溶液将滤液调节pH到8.0~9.0,按滤液与胰蛋白酶1000∶1.3的质量比加入胰蛋白酶,于40~50℃酶解1.5小时后,再按1000∶1.8的质量比加入胃蛋白酶,40~50℃酶解2小时;(4)超滤膜纯化:用50nm孔径的管型聚丙烯腈超滤膜过滤上步得到的溶液,设定溶液的透过速度为50L/h·m²~80 L/ h·m²,同时加场强为1600V/m~1900V/m的直流电场(方向与溶液流动的方向一致)和频率为40000Hz~50000Hz的超声波场(功率为270瓦),弃掉滤液,所得到的糊状物即为较高纯度的硫酸软骨素;(5)脱水:最后,用95%以上的丙酮对产品进行脱水,再真空干燥,即可。
3.根据权利要求2所述的的方法,其特征在于:在用复合酶酶解时,待降温至56℃时加入复合酶,加的量为原料质量的4%。
4.根据权利要求2所述的的方法,其特征在于:在二次酶解时,用浓度为1%的氢氧化钠溶液将滤液调节pH到8.4,先加入胰蛋白酶,于46℃酶解1.5小时后,再加入胃蛋白酶,44℃酶解2小时。
5.根据权利要求2所述的的方法,其特征在于:在使用超滤膜纯化时,用50nm孔径的管型聚丙烯腈超滤膜过滤上步得到的溶液,设定溶液的透过速度为67L/ h·m²,同时加场强为1740V/m的直流电场(方向与溶液流动的方向一致)和频率为44000Hz的超声波场(功率为270瓦)。
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Cited By (2)
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---|---|---|---|---|
CN113234181A (zh) * | 2021-05-05 | 2021-08-10 | 山东广昊生物制品有限公司 | 一种硫酸软骨素的制备方法 |
CN113880966A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-01-04 | 潍坊世宇生物科技有限公司 | 一种硫酸软骨素去除蛋白的生产工艺 |
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