CN113880966A - 一种硫酸软骨素去除蛋白的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种硫酸软骨素去除蛋白的生产工艺，包括以下步骤：(1)蒸煮，(2)提取，(3)一次酶解，(4)过滤浓缩，(5)二次酶解，(6)超滤，(7)沉淀干燥。本发明提供的一种硫酸软骨素去除蛋白的生产工艺，工艺流程简单，使用两次酶解，一次酶解对动物软骨中的硫酸软骨素的蛋白等其他杂质进行粗分解，去除的硫酸软骨素中大量蛋白，然后在经过二次酶解对利用蛋白水解酶对硫酸软骨素的蛋白进行更深层次的水解去除，一次酶解后对滤液进行浓缩后在进行二次酶解，得到更高纯度的硫酸软骨素产品的同时，大大降低了用酶量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种硫酸软骨素去除蛋白的生产工艺。
背景技术
硫酸软骨素是广泛存在于动物软骨组织中的一类黏多糖，其基本单位是D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖硫酸酯。硫酸软骨素一般含有50-70个双糖基本结构，分子量约为10-50kDa。它作为结缔组织的重要组成部分，具有多种药理作用与生理功能。在我国硫酸软骨素用于治疗神经痛、神经性偏头痛、关节炎、肩关节痛和腹腔手术后疼痛等，预防和治疗链霉素引起的听觉障碍及各种噪声引起的听觉困难、耳鸣症等，效果显著。在西方发达国家，硫酸软骨素作为保健品长期应用于防治冠心病、心绞痛、心肌梗塞、冠状动脉机能不全、心肌缺血等疾病，无明显的毒副作用，能显著降低冠心病患者的发病率和死亡率。长期的临床应用发现，在动脉和静脉壁上沉积的脂肪等脂质可以被有效去除或减少，能显著降低血浆胆固醇，从而防止动脉粥样硬化的形成。
目前国内及国际上通常所用的生产工艺，在提取过程中，通过生物活性酶，酶解超滤膜拦截或大孔树脂吸附交换所得，得到含硫酸软骨素的料液，通过乙醇沉淀得到硫酸软骨素产品，这种工艺得到的硫酸软骨素含量不高，制备得到的硫酸软骨素中含的大量的分子链蛋白，蛋白在硫酸软骨素产品中含量多，对于腹腔肌肉注射有不好的反应，引起人体体温异常升高，即医学上所说的热原，注入人体的注射剂中含有热原量达1μg/kg就可引起不良反应，可使人体产生发冷、寒颤、发热、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃以上，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。该现象称为“热原反应”，因此需要对硫酸软骨素中的蛋白进行去除是十分有必要的。
中国专利CN113234181A公开了一种硫酸软骨素的制备方法采用连续二级酶解法充分水解蛋白质来提高硫酸软骨素的纯度。但是由于是两次酶解之间未对反应溶液进行浓缩，使得生产过程中的二级酶解的用酶量较大，酶解效果差。
中国专利CN111533826A公开了一种从猪骨中同时提取硫酸软骨素和骨胶原蛋白肽的方法，将酶解分成两次，第一次酶解利用碱性蛋白酶和胰蛋白酶的组合在较高pH条件下进行，第二次酶解利用角蛋白酶、菠萝蛋白酶和中性蛋白酶在较低pH条件下进行，可实现对骨胶原蛋白的更充分降解，获得小肽产品。但是同样在两次酶解之间未对反应液进行浓缩，从而导致第二次酶解的用酶量大的问题。
发明内容
本发明为了解决现有技术中的问题，有效的去除硫酸软骨素中的蛋白，用酶量少，降低了成本，适合工业化生产，为了实现上述目的，本发明提供了一种硫酸软骨素去除蛋白的生产工艺，包括以下步骤：(1)蒸煮，(2)提取，(3)一次酶解，(4)过滤浓缩，(5)二次酶解，(6)超滤，(7)沉淀干燥。
作为本发明的进一步优选方案，步骤(1)-(7)具体为：
(1)蒸煮：取动物软骨放在反应釜内，加入清水，蒸煮2-5小时；
(2)提取：将蒸煮后的物料降温至30-50℃，加入碱调节物料的pH值为12-14，碱解1-5小时；
(3)一次酶解：向步骤(2)的物料中加入酸调节物料的pH值为9.5-10，加入碱性蛋白酶或胰酶，搅拌6-7小时，加入酸调节物料的pH值为6-7，升温至60-70℃，静置1-2小时；
(4)过滤浓缩：将步骤(3)酶解后的物料将固体过滤后进行浓缩，得到浓缩液，浓缩方式采用离子吸附或超滤；
(5)二次酶解：使步骤(4)中的浓缩液的pH值保持6-7，温度为55-60℃，加入蛋白水解酶，搅拌6-7小时，升温至80℃，进行灭酶；
(6)超滤：对完成二次酶解后的浓缩液进行超滤，去除小分子的肽链、氨基酸；
(7)沉淀干燥：将步骤(6)得到的提取液降温至20-30℃，边搅拌边加酸调节提取液的pH为5.5-6.5，用80-90％乙醇沉淀2-4小时，把沉淀物用95％的乙醇脱水，60℃-70℃烘干，得到硫酸软骨素成品。
作为本发明的进一步优选方案，步骤(1)中所述动物软骨与清水的质量比为1：(1-2)。
作为本发明的进一步优选方案，步骤(3)中所述碱性蛋白酶或胰酶的加入量为物料的5-10‰。
作为本发明的进一步优选方案，步骤(4)所述所述离子吸附的具体步骤为：
(411)将滤液注入吸附罐内，加水调节至密度计1.1的读数为22-23，用阴离子树脂吸附1-2小时；
(412)然后加水将滤液调至密度计1.1的读数为14-15，阴离子树脂吸附1-2小时，弃去滤液；
(413)在吸附罐中加入40-55℃的水对吸附后阴离子树脂搅拌洗涤1-3次，每次20-30分钟，弃去洗涤液；
(414)将步骤(401)洗涤后的阴离子树脂加入质量百分比浓度为10％NaCl溶液中，搅拌1-2小时进行洗脱，得到浓缩液。
作为本发明的进一步优选方案，步骤(4)中所述超滤的具体步骤为：
(421)将过滤液的温度控制在35-42℃，用超滤膜进行超滤处理，其中膜的压力为0.3-0.6Mpa，膜截留相对分子量为5000道尔顿，得到浓缩液。
作为本发明的进一步优选方案，步骤(5)中所述蛋白水解酶的加酶量为物料的2-3‰。
作为本发明的进一步优选方案，步骤(6)中所述超滤的膜压力为0.3-0.6Mpa，膜截留相对分子量为3000-4000道尔顿。
本发明的有益效果：
1)本发明提供的一种硫酸软骨素去除蛋白的生产工艺，工艺流程简单，使用两次酶解，一次酶解对动物软骨中的硫酸软骨素的蛋白等其他杂质进行粗分解，去除的硫酸软骨素中大量蛋白，然后在经过二次酶解对利用蛋白水解酶对硫酸软骨素的蛋白进行更深层次的水解去除，是得到的硫酸软骨素成品符合腹腔肌肉注射的要求；
2)本发明一次酶解后对滤液进行浓缩后在进行二次酶解，得到更高纯度的硫酸软骨素产品的同时，大大降低了用酶量，对于工厂化生产，节约了大量的资金，减少酶解时间的同时，蛋白水解更完全，酶解后，再利用截留相对分子量为3000-4000道尔顿的超滤膜过滤掉水解后小肽、氨基酸，有效的去除了硫酸软骨素中的蛋白。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但是本发明不局限于这些实施例。
实施例1
一种硫酸软骨素去除蛋白的生产工艺，包括以下步骤：
(1)蒸煮：取500kg鱼头软骨放在反应釜内，加入800kg清水，蒸煮2.5小时；
(2)提取：将蒸煮后的物料降温至40-45℃，加入质量百分比浓度为10％NaOH调节物料的pH值为11.5-12，提取2小时；
(3)一次酶解：向步骤(2)的物料中加入质量百分比浓度为30％HCl调节物料的pH值为9.5-10，加入碱性蛋白酶5.7kg，搅拌6-7小时，加入质量百分比浓度为30％HCl调节物料的pH值为6-7，升温至60-70℃，静置1-2小时。
(4)过滤浓缩：将步骤(3)酶解后的物料将固体过滤后进行浓缩，浓缩方法采用离子吸附，具体步骤如下；
(411)将滤液注入第一吸附罐内，加水调节至密度计1.1的读数为22，用2250kg阴离子树脂吸附1.5小时；
(412)再将滤液注入第二吸附罐，加水调至密度计1.1的读数为14，用500kg阴离子树脂吸附11.5小时，弃去滤液；
(413)在吸附罐中加入40-55℃的水对吸附后阴离子树脂搅拌洗涤2次，每次20-30分钟，弃去洗涤液；
(414)将步骤(401)洗涤后的阴离子树脂加入质量百分比浓度为10％NaCl溶液中，搅拌1-2小时进行洗脱，得到浓缩液500kg；
(5)二次酶解：使步骤(4)中的浓缩液的pH值保持6-7，温度为55-60℃，加入0.5kg蛋白水解酶，搅拌6-7小时，升温至80℃，进行灭酶；
(6)超滤：使用膜压力为0.3Mpa，膜截留相对分子量为4000道尔顿的超滤膜对完成二次酶解后的浓缩液进行超滤，去除小分子的肽链、氨基酸；
(7)沉淀干燥：将步骤(6)得到的提取液降温至20-30℃，边搅拌边加质量百分比浓度为30％HCl调节提取液的pH为5.5-6，用80-90％乙醇沉淀2小时，把沉淀物用95％的乙醇脱水，60℃-70℃烘干，得到硫酸软骨素成品。
实施例2
一种硫酸软骨素去除蛋白的生产工艺，包括以下步骤：
(1)蒸煮：取800kg猪鼻软骨放在反应釜内，加入1000kg清水，蒸煮4小时；
(2)提取：将蒸煮后的物料降温至40-50℃，加入质量百分比浓度为10％NaOH调节物料的pH值为13.5-14，提取3小时；
(3)一次酶解：向步骤(2)的物料中加入质量百分比浓度为30％HCl调节物料的pH值为9.5-10，加入12.4kg胰酶，搅拌6-7小时，加入质量百分比浓度为30％HCl调节物料的pH值为6-7，升温至60-70℃，静置2小时；
(4)过滤浓缩：将步骤(3)酶解后的物料将固体过滤后进行浓缩，浓缩方法如下：
(401)将滤液注入吸附罐内，加水调节至密度计1.1的读数为23，用600kg阴离子树脂吸附2小时；
(402)然后加水将滤液调至密度计1.1的读数为15，阴离子树脂吸附2小时，弃去滤液；
(403)在吸附罐中加入40-55℃的水对吸附后阴离子树脂搅拌洗涤3次，每次20分钟，弃去洗涤液；
(404)将步骤(401)洗涤后的阴离子树脂加入浓度为10％NaCl溶液中，搅拌2小时进行洗脱，得到浓缩液600kg；
(5)二次酶解：使步骤(4)中的浓缩液的pH值保持6-7，温度为55-60℃，加入0.45kg蛋白水解酶，搅拌7小时，升温至80℃，进行灭酶；
(6)超滤：对完成二次酶解后的浓缩液进行超滤，超滤的膜压力为0.6Mpa，膜截留相对分子量为3000道尔顿，去除小分子的肽链、氨基酸；
(7)沉淀干燥：将步骤(6)得到的提取液降温至20-30℃，边搅拌边加酸调节提取液的pH为6-6.5，用80-90％乙醇沉淀4小时，把沉淀物用95％的乙醇脱水，60℃-70℃烘干，得到硫酸软骨素成品。
实施例3
一种硫酸软骨素去除蛋白的生产工艺，包括以下步骤：
(1)蒸煮：取800kg猪鼻软骨放在反应釜内，加入1000kg清水，蒸煮4小时；
(2)提取：将蒸煮后的物料降温至40-50℃，加入质量百分比浓度为10％NaOH调节物料的pH值为13.5-14，提取3小时；
(3)一次酶解：向步骤(2)的物料中加入质量百分比浓度为30％HCl调节物料的pH值为9.5-10，加入7.6kg碱性蛋白酶，搅拌6-7小时，加入质量百分比浓度为30％HCl调节物料的pH值为6-7，升温至60-70℃，静置2小时；
(4)过滤浓缩：将步骤(3)酶解后的物料将固体过滤后进行浓缩，浓缩方法采用超滤，具体步骤如下：
(421)将滤液的温度控制在35-40℃，用超滤膜进行超滤处理，其中膜的压力为0.6Mpa，膜截留相对分子量为5000道尔顿，得到浓缩液600kg。
(5)二次酶解：使步骤(4)中的浓缩液的pH值保持6-7，温度为55-60℃，加入0.16kg蛋白水解酶，搅拌7小时，升温至80℃，进行灭酶；
(6)超滤：对完成二次酶解后的浓缩液进行超滤，超滤的膜压力为0.6Mpa，膜截留相对分子量为3000道尔顿，去除小分子的肽链、氨基酸；
(7)沉淀干燥：将步骤(6)得到的提取液降温至20-30℃，边搅拌边加酸调节提取液的pH为6-6.5，用80-90％乙醇沉淀4小时，把沉淀物用95％的乙醇脱水，60℃-70℃烘干，得到硫酸软骨素成品。
对比例1
对比例1与实施例2的区别在于，步骤(4)中将步骤(3)酶解后的物料将固体过滤后不经过浓缩，直接进入到步骤(5)。
对比例2
对比例2与对比例1的区别在于，不经过步骤(5)二次酶解，对步骤(404)得到的洗脱液进行灭菌后，进行(步骤6)超滤。
实施例1-3，对比例1-2制得的硫酸软骨素的纯度如表1
表1：
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | |
| 纯度(CPC) | 98.1％ | 98.3％ | 98.2％ | 92.6％ | 90.2％ |
| 收率 | 24.34％ | 23.78％ | 23.14％ | 22.37％ | 22.46％ |
| 蛋白数 | 1.7％ | 1.5％ | 1.6％ | 7.8％ | 8.7％ |
上述实验结果表明，本发明硫酸软骨素去除蛋白的生产工艺对滤液进行浓缩后在进行二次酶解，大大降低了用酶量，对于工厂化生产，节约了大量的资金，减少酶解时间的同时，蛋白水解更完全，符合腹腔肌肉注射的要求。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
Claims (8)
1.一种硫酸软骨素去除蛋白的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：(1)蒸煮，(2)提取，(3)一次酶解，(4)过滤浓缩，(5)二次酶解，(6)超滤，(7)沉淀干燥。
2.根据权利要求1所述的一种硫酸软骨素去除蛋白的生产工艺，其特征在于，步骤(1)-(7)具体为：
(1)蒸煮：取动物软骨放在反应釜内，加入清水，蒸煮2-5小时；
(2)提取：将蒸煮后的物料降温至30-50℃，加入碱调节物料的pH值为12-14，碱解1-5小时；
(3)一次酶解：向步骤(2)的物料中加入酸调节物料的pH值为9.5-10，加入碱性蛋白酶或胰酶，搅拌6-7小时，加入酸调节物料的pH值为6-7，升温至60-70℃，静置1-2小时；
(4)过滤浓缩：将步骤(3)酶解后的物料将固体过滤后进行浓缩，得到浓缩液，浓缩方式采用离子吸附或超滤；
(5)二次酶解：使步骤(4)中的浓缩液的pH值保持6-7，温度为55-60℃，加入蛋白水解酶，搅拌6-7小时，升温至80℃，进行灭酶；
(6)超滤：对完成二次酶解后的浓缩液进行超滤，去除小分子的肽链、氨基酸；
(7)沉淀干燥：将步骤(6)得到的提取液降温至20-30℃，边搅拌边加酸调节提取液的pH为5.5-6.5，用80-90％乙醇沉淀2-4小时，把沉淀物用95％的乙醇脱水，60℃-70℃烘干，得到硫酸软骨素成品。
3.根据权利要求2所述的一种硫酸软骨素去除蛋白的生产工艺，其特征在于，步骤(1)中所述动物软骨与清水的质量比为1：(1-2)。
4.根据权利要求2所述的一种硫酸软骨素去除蛋白的生产工艺，其特征在于，步骤(3)中所述碱性蛋白酶或胰酶的加入量为物料的5-10‰。
5.根据权利要求2所述的一种硫酸软骨素去除蛋白的生产工艺，其特征在于，步骤(4)中所述离子吸附的具体步骤为：
(411)将滤液注入吸附罐内，加水调节至密度计1.1的读数为22-23，用阴离子树脂吸附1-2小时；
(412)然后加水将滤液调至密度计1.1的读数为14-15，阴离子树脂吸附1-2小时，弃去滤液；
(413)在吸附罐中加入40-55℃的水对吸附后阴离子树脂搅拌洗涤1-3次，每次20-30分钟，弃去洗涤液；
(414)将步骤(401)洗涤后的阴离子树脂加入质量百分比浓度为10％NaCl溶液中，搅拌1-2小时进行洗脱，得到浓缩液。
6.根据权利要求2所述的一种硫酸软骨素去除蛋白的生产工艺，其特征在于，步骤(4)中所述超滤的具体步骤为：
(421)将过滤液的温度控制在35-42℃，用超滤膜进行超滤处理，其中膜的压力为0.3-0.6Mpa，膜截留相对分子量为5000道尔顿，得到浓缩液。
7.根据权利要求2所述的一种硫酸软骨素去除蛋白的生产工艺，其特征在于，步骤(5)中所述蛋白水解酶的加酶量为物料的2-3‰。
8.根据权利要求2所述的一种硫酸软骨素去除蛋白的生产工艺，其特征在于，步骤(6)中所述超滤的膜压力为0.3-0.6Mpa，膜截留相对分子量为3000-4000道尔顿。
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2021
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