CN103864891B - 一种韭菜籽抗氧化三肽及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源于韭菜籽的抗氧化三肽的氨基酸序列、制备方法及其在生物医药和食品方面的应用。该抗氧化三肽序列为Gly-Ser-Gln（GSQ），体外实验表明，该多肽可以有效清除DPPH、ABTS和超氧阴离子等自由基，同时对过氧化氢诱导正常肝细胞的损害具有保护作用。本发明所涉及的抗氧化三肽具有结构简单、抗氧化活力强等特点，可作为现有人工合成抗氧化剂的优良替代，对新型抗氧化保健品和药物开发与应用方面具有重要价值。

Description

一种韭菜籽抗氧化三肽及其制备与应用

技术领域

本发明涉及一种韭菜籽天然抗氧化三肽及其制备方法和在食品、生物制药领域中的应用，属于食品和生物医学领域。

背景技术

我国是一个农业大国，农作物的种类繁多，但由于受加工技术条件的所限农作物的加工大都处于初级阶段，其加工后的残余物中仍有较大含量的蛋白质，而它们大多主要用于饲料工业或自然排放，不仅浪费了资源，同时也造成环境污染。植物活性肽概念的提出及分离检测技术的提高，使人们开始逐渐重视对富含蛋白质的农副产品的深加工并从中获得多种活性肽，如酪蛋白磷酸肽、降血压肽和易消化吸收肽等，植物来源活性肽的研究和开发对提高我国农产品深加工的附加值具有重要作用。

抗氧化剂近些年来在国内外发展很快，用途也越来越广。自从Harman提出自由基理论以来，人们认识到人体内氧化产生的自由基与人的衰老和许多疾病有关，因此抗氧化剂不仅用于含脂肪食品的抗氧化，而且作为功能因子用于保健食品及化妆品等的开发。抗氧化剂的种类很多，然而化学合成的抗氧化剂如BHA、BHT等，由于其本身具有毒副作用，各国政府纷纷对其强制规定了ADI值控制其过量添加。于是人们把目光逐步转向从各种植物和动物组织中提取天然抗氧化剂。抗氧化活性多肽由于低毒、高效等特点，作为食品和机体的抗氧化剂，被认为是人工合成抗氧化剂的理想替代者。

抗氧化肽能有效地清除体内过剩的活性氧自由基，保护细胞和线粒体的正常结构和功能，防止脂质过氧化的发生，而氧化与人类及其他动物的许多疾病诸如癌症、老化、动脉硬化等的发病机理有关。适当摄入具有抗氧化活性的物质可以降低体内自由基水平，防止脂质过氧化，帮助机体抵御疾病。目前使用植物和动物蛋白为原料，制备抗氧化肽的专利也有很多，主要采用酶解蛋白质的方法制备抗氧化多肽，而直接分离纯化得的抗氧化肽较为少见。

韭菜籽为我国常见食用蔬菜百合科植物韭菜AlliumtuberosumRottl干燥成熟的种子，韭菜籽（药典中常称为韭子）为我国传统中药品种，始载于《名医别录》，列为中品。据药典记载，韭菜籽具有温补肝肾、壮阳固精之功效。韭菜籽作为壮阳补肾用入药在我国民间已有数千年的历史。2002年我国卫生部将其列为药食两用植物天然产物。韭菜籽这种植物种子资源在我国十分丰富，产量居世界首位。目前国内外一直以来对韭菜尤其是其种子韭菜籽的研究很少。国外还未对韭菜籽进行过化学成分和功效等方面的研究，国内化学成分方面的研究也并不多，迄今为止,对其活性多肽或药理研究国内外都还几乎没有报道。因此，有必要充分利用我国十分丰富的韭菜（韭菜籽）植物资源，对其进行深入系统研究，为实现韭菜籽中药现代化和开发新型、高效、安全的健康食品和药品提供科学依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种韭菜籽抗氧化三肽，及其制备方法和在食品、生物制药领域中的应用，为实现韭菜籽中药现代化和开发新型、高效、安全的健康食品和药品提供科学依据。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种韭菜籽抗氧化三肽，所述抗氧化三肽氨基酸序列为Gly-Ser-Gln。

所述多肽衍生物为抗氧化三肽的氨基酸被氨基化，或者环化，或者L-型氨基酸变为D-型氨基酸。

韭菜籽抗氧化三肽的制备方法，从天然韭菜籽中分离纯化或人工合成方法得到。

具体步骤包括如下：

1）韭菜籽抗氧化三肽的制备：韭菜籽经中药粉碎机粉碎，按料液比1：10比例加入体积分数为10%（V/V）醋酸溶液，超声波辅助提取20min，在室温下搅拌提取8h后，12000rpm离心10min，过滤取上清液，冷冻干燥，即为韭菜籽粗提物；

2）分离纯化：取韭菜籽粗提物利用SephadexG-50凝胶色谱进行分离，以去离子水为洗脱液，流速0.3mL/min，测量洗脱组分214nm波长处的吸光值，收集具有最佳抗氧化活性的峰，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进一步分离，RP-HPLC的洗脱梯度为0~5min，体积分数为5%（V/V）乙腈；5~40min，体积分数为5%~30%（V/V）乙腈；40-50min，体积分数为30%（V/V）乙腈；流速为2.0mL/min，检测波长214nm，收集体积分数为16%（V/V）乙腈浓度的洗脱峰，冷冻干燥即得所述抗氧化三肽。

韭菜籽抗氧化三肽在抗氧化保健品及药物开发方面的应用。

本发明的优点在于：

所述抗氧化三肽具有强活性，对DPPH，超氧阴离子和ABTS自由基都有强的清除作用，并对自由基诱导的细胞损伤具有保护作用，表明其在抗氧化活性开发和应用方面有重要价值。该抗氧化三肽的活性见实施实例2与实施实例3。

附图说明

图1：韭菜籽提取物SephedexG-50凝胶过滤色谱图。

图2：凝胶色谱洗脱峰2反相高效液相色谱图。

图3：抗氧化三肽的质谱图。

图4：韭菜籽抗氧化三肽对DPPH自由基清除作用。

图5：韭菜籽抗氧化三肽对ABTS自由基清除作用。

图6：韭菜籽抗氧化三肽对超氧阴离子自由基清除作用。

图7：韭菜籽抗氧化三肽的还原力测定。

图8：韭菜籽抗氧化三肽对肝细胞LO2的保护作用（*P<0.05，**P<0.01）。

具体实施方式

本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不仅限于下述的实施实例。

实施例1

本发明所述抗氧化三肽的分离纯化包括SephadexG-50凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）两个步骤。

提取韭菜籽提取物：韭菜籽经高速中药粉碎机粉碎，用10%（V/V）乙酸浸泡，超声波辅助提取20min，在室温下搅拌提取6h，12000rpm离心15min，取上清液冷冻干燥，-80℃低温保存。

SephadexG-50凝胶过滤色谱：按上述方法获得韭菜籽提取物冻干粉，溶解于去离子水中，12000rpm离心15min。取上清液用0.22μm孔径微滤膜过滤。SephadexG-50凝胶柱（1.6cm×100cm）用去离子水平衡，将已过滤的样品上柱。用去离子水洗脱，流速0.3mL/min，于214nm波长处检测洗脱液吸光值，绘制洗脱曲线，如图1所示。收集洗脱峰峰2，冷冻干燥，-80℃低温保存备用。

高效液相色谱：去离子水溶解上述峰2冻干粉，采用RP-HPLC进一步分离。液相色谱系统为LC-20A，装配Gemini5μC18（250mm×10mm）反相柱（Phenomenex，UK），用水和乙腈（含0.05%（V/V）三氟乙酸）构成的洗脱系统进行梯度洗脱。洗脱条件：0~5min，5%（V/V）乙腈；5~40min，5%~30%（V/V）乙腈；40-50min,30%（V/V）乙腈；洗脱流速2.0mL/min，检测波长214nm，洗脱曲线如图2所示。收集16%（V/V）乙腈浓度的洗脱峰CLP-2（保留时间为22.5~24.8min），冷冻干燥即为本发明所述抗氧化三肽。

将收集到的抗氧化组分CLP-2冷冻干燥，采用高效液相色谱检验所得到的组分纯度。经检测，该抗氧化肽组分纯度达到95%，可测定其氨基酸序列。

用液相色谱与质谱连用（LC-MS/MS）方法测定氨基酸序列（图3），得到CLP-2的氨基酸序列GSQ。

实施例2

实施实例1中得到的天然抗氧化三肽活性进行研究：

DPPH自由基清除作用：0.4mL不同浓度的样品与等体积的4%（W/V）DPPH无水乙醇溶液充分混合，室温下避光静置30min，于517nm下测定吸光值。用去离子水和还原型谷胱甘肽代替样品分别作空白对照和阳性对照。样品的DPPH自由基清除活力按下列公式（1）计算：

（1）

式中，A₀：空白对照组吸光值；A_s：样品组吸光值

ABTS自由基清除作用：用蒸馏水配制7mmol/L的ABTS⁺溶液和2.45mmol/L的过硫酸钾溶液（使用前必须先在室温下放置16h），分别将ABTS⁺和过硫酸钾溶液按1∶1体积比混合,临用前用pH7.4，5mmol/L的磷酸盐缓冲溶液将混合液稀释至吸光值A₇₃₄为0.70±0.02。取0.5mL不同浓度的样品和0.5mL的ABTS自由基溶液混合静置10min后于734nm下测其吸光值。用去离子水和还原型谷胱甘肽代替样品分别作空白对照和阳性对照。ABTS自由基清除活力按下列公式（2）计算：

（2）

式中，A₀：空白对照组吸光值；A_s：样品组吸光值。

超氧阴离子自由基清除作用：取0.4mL样品溶液加入50mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液（pH8.3）0.4mL，以蒸馏水代替样品做为空白对照管。震荡混匀，25℃水浴中保温10min后加入1.5mmol/L的邻苯三酚盐酸溶液0.1mL（25℃水浴预热），迅速混匀反应5min，每隔30s在320nm处测定吸光度值A₃₂₀。用去离子水和还原型谷胱甘肽代替样品分别作空白对照和阳性对照。作吸光值随时间变化的回归方程，曲线斜率为邻苯三酚自氧化速率，样品对超氧阴离子的清除活力按下列公式（3）计算：

（3）

式中，ΔA₀/min：空白对照组吸光值曲线斜率；ΔA_s/min：样品组吸光值曲线斜率。

还原力活性：0.2mL不同浓度样品，加入1%（W/V）铁氰化钾溶液0.5mL和pH6.6的磷酸盐缓冲液（0.2mol/L）0.5mL，将混和液在50℃保温20min，然后加入10%（W/V）三氯乙酸0.5mL，混匀后在5000rpm下离心10min。取上清液0.5mL，加入0.5mL蒸馏水和1.0mol/LFeCl₃溶液（0.1mL），静置10min，在700nm波长处测定吸光值。吸光值与样品的还原能力有关，溶液的吸光值越大，该样品的还原能力越强。

经本实施实例测定，韭菜籽天然抗氧化三肽GSQ对DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基都具有较强的清除活力，EC₅₀值（自由基清除率达到50%时的多肽浓度）分别为0.61mg/mL，0.04mg/mL和0.70mg/mL（图4，图5，图6），同时该三肽还具有一定的还原能力（图7）。

实施实例3

本发明所述抗氧化三肽对过氧化氢诱导正常肝细胞损伤的保护作用：

经复苏的正常肝细胞（LO2）用含有10%胎牛血清、2.0mmol/L谷氨酸盐和100U/mL青霉素-链霉素的改良型RPMI-1640培养基在湿润的，含5%二氧化碳，温度为37℃的环境下贴壁培养24~48h。用胰酶在37℃下消化后加入RPMI-1640培养基终止消化，加入适量的RPMI-1640培养基进行吹打使细胞充分分散，接种到96孔板中继续培养24h，使细胞的最终浓度为1.5×10⁵/孔。将不同浓度的三肽GSQ处理细胞24h后再用300μmol/L过氧化氢处理细胞24h后，用MTT法检测每孔肝细胞的活细胞数。

由检测结果可知（图8），该抗氧化三肽浓度为0.01mg/mL时，就表现出对过氧化氢诱导正常肝细胞损伤的保护作用，随着三肽浓度的增加，对细胞的保护活性增强。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCELISTING

<110>福州大学

<120>一种韭菜籽抗氧化三肽及其制备与应用

<130>1

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>3

<212>PRT

<213>韭菜籽抗氧化三肽

<400>1

GlySerGln

1

Claims (3)

1.一种韭菜籽抗氧化三肽，其特征在于：所述抗氧化三肽氨基酸序列为Gly-Ser-Gln。

2.一种如权利要求1所述的韭菜籽抗氧化三肽的制备方法，其特征在于：从天然韭菜籽中分离纯化或人工合成方法得到。

3.一种如权利要求1所述的一种韭菜籽抗氧化三肽在制备抗氧化保健品的应用。