CN107260668B - 一种硫酸软骨素a纳米硒胶束粒子及其制备方法和应用 - Google Patents

一种硫酸软骨素a纳米硒胶束粒子及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子及其制备方法和应用，属于医药纳米材料技术领域。以硫酸软骨素A作为载体，将纳米硒通过物理吸附结合在硫酸软骨素A上形成纳米胶束粒子，其中硒的质量分数为0.1％～25％。本发明提供的硫酸软骨素A纳米硒胶束，结合了硫酸软骨素A和纳米硒双重药理活性，降低了无机硒的毒性，提高其生物利用度的同时结合硫酸软骨素A的生物活性，可以更好的将其发展成为预防和改善骨关节病的新型纳米胶束制剂。

Description

一种硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药纳米材料技术领域，涉及一种硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子及其制备方法和应用。
背景技术
硒是人体必需的微量元素，亚硒酸钠制剂在临床上可用于高血压、癌症、心肌炎、冠心病、克山病和大骨节病等疾病的预防和治疗中。然而，硒及其化合物有剧毒，硒的每日最大安全量为400μg，若过量服用硒可引起中毒。有报道显示有机纳米硒的毒性比无机硒小，生物活性比无机硒高，从而克服了无机含硒物质有效剂量与中毒剂量相差不大的弱点。故随着有机纳米硒的研制成功，以及纳米硒在生物安全性上面的深入研究，作为一种有效的补硒剂将得到广泛的认可和应用。
可生物降解的聚合物纳米粒子，特别是基于多糖的纳米微球和纳米微囊作为新型药物输送和控释载体，因其具有良好的生物相容性、超细粒径、合理的体内分布和高效的药物利用率，近年来日益受到广泛关注。可生物降解聚合物纳米微粒不仅可增强药物的稳定性、提高疗效、降低毒副作用，而且可有效地越过许多生物屏障和组织间隙到达病灶部位，从而更有效地对药物进行靶向输送和控制释。
硫酸软骨素在美国已经风行多年，除了作为药品外，大多是作为改善关节病的补充品和健康食品应用。硫酸软骨素对改善老年退行性关节炎、风湿性关节炎有一定的效果。现有技术中有报道人工合成化工品硫酸软骨素，人工合成硫酸软骨素虽然成本降低，但是由于存在过硫酸化问题，导致生成的硫酸软骨素产物在体内由于缺乏相应的代谢酶而无法代谢，有可能产生对身体不利的影响例如机体的免疫反应、过敏反应，胃肠道不适等症状，相较于生物活性硫酸软骨素生物相容性较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子及其制备方法和应用，该硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子毒性小，生物活性高。
本发明是通过以下技术方案来实现：
本发明公开了一种硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子，以硫酸软骨素A作为载体，将纳米硒通过物理吸附结合在硫酸软骨素A上形成纳米胶束粒子，其中硒的质量分数为0.1％～25％。
所述的硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子在水中自组装形成平均粒径为85nm、表面电荷为-47mV的纳米胶束。
本发明还公开了一种硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子的制备方法，包括以下步骤：
1)以质量份数计，取1份硫酸软骨素A、将0.1～1份硒化物及2～5份L-抗坏血酸；
2)将硫酸软骨素A加水充分搅拌至溶解，制得硫酸软骨素A水溶液，将硒化物加水充分搅拌至溶解，制得硒化物水溶液；在60Hz，30℃超声条件下，将硒化合水溶液加入硫酸软骨素A水溶液中，制得混合溶液；
3)将L-抗坏血酸加水充分搅拌至溶解，制得L-抗坏血酸水溶液，将该L-抗坏血酸水溶液逐滴加入步骤2)制得的混合溶液中，60Hz，30℃超声处理1h，然后将所得溶液装入透析袋中，放入去离子水溶液中透析处理，直至透析袋中的红色纳米硒不再渗出，收集透析袋中的胶体；
4)将胶体冷冻干燥后得到的红色物质即为硫酸软骨素A纳米硒，将该硫酸软骨素A纳米硒用去离子水再次分散，制得硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子。
所述硫酸软骨素A加入其3倍体积的水充分搅拌至溶解制得硫酸软骨素A水溶液；硒化物水溶液的体积为硫酸软骨素A水溶液体积的1/3；L-抗坏血酸水溶液的体积为硫酸软骨素A水溶液体积的2/3。
步骤3)所述透析处理是将所得溶液装入透析袋中，放入去离子水溶液中透析过夜，第2天更换去离子水继续透析，每隔4小时更换一次去离子水，直至透析袋中的红色纳米硒不再渗出。
所述透析采用截留分子量为3500的透析袋。
所述硒化物为亚硒酸盐。
所述亚硒酸盐为亚硒酸钠或亚硒酸氢钠。
本发明还公开了上述的硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子在制备预防/治疗骨关节病的药物中的应用。
所述的药物为拮抗T-2毒素诱导的软骨细胞凋亡的药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明所提供的硫酸软骨素纳米硒是以硫酸软骨素A为载体，硒通过物理吸附结合硫酸软骨素A形成的可生物降解的聚合物纳米胶束，该纳米胶束在水中溶解性好，可以自组装形成平均粒径为85nm、表面带-47mV左右的稳定纳米胶束粒子。经验证，该胶束粒子能够展现出丁达尔效应，说明形成了较好的胶体。
本发明公开的硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子细胞毒性低，生物活性高，可以改善大骨节病软骨细胞的亚显微结构(线粒体、溶酶体)，促进细胞生长，并且能够保护软骨细胞达到拮抗T-2毒素诱导的软骨细胞凋亡的作用。因而可以用于制备预防/治疗骨关节病的药物，与作为常规的用于治疗大骨节病的药物亚硒酸钠相比，本发明提供的硫酸软骨素A纳米硒胶束，结合了硫酸软骨素A和纳米硒双重药理活性，降低了无机硒的毒性，提高其生物利用度的同时结合硫酸软骨素A的生物活性，可以更好的将其发展成为预防和改善骨关节病的新型纳米胶束制剂，胶束制剂相较于纳米粒子，一般粒径在100nm，分散性好，并且冻干粉的充分散性良好，可溶于水中，更适用于注射类药物制剂，亦作为其他补硒制剂的合成原料之一。
本发明利用硫酸软骨素A、亚硒酸盐原料，在超声和透析下通过L-抗坏血酸还原制得硫酸软骨素A纳米硒胶束，其工艺简洁、操作简单，是一种绿色环保的合成方法。制备时硫酸软骨素A和亚硒酸盐的投料比可以在一个范围变动，而在加工成药品或保健品时需要结合硒的生理需求量、界限中毒剂量、日建议膳食补充量和最高安全摄入量等数据来综合考虑每日最适补充剂量。
附图说明
图1为本发明实施例1～6制得的硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子(SeCSA1-6)与硫酸软骨素(CS)的红外光谱对比谱图；
图2为本发明实施例1～6制得的硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子(SeCSA1-6)与硫酸软骨素(CS)的XRD衍射对比谱图；
图3为本发明实施例1～6制得的硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子(SeCSA1-6)与硫酸软骨素(CS)的丁达尔效应图；
图4为本发明实施例1～6制得的硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子(SeCSA1-6)与硫酸软骨素(CS)的粒径分布图；
图5为本发明实施例1～6制得的硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子(SeCSA1-6)与硫酸软骨素(CS)的表面电位图；
图6为硫酸软骨素A纳米硒胶束(SeCSA4)与前期合成的CSS的溶解性比较图
图7为不同干预下软骨细胞的荧光显微镜图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
1)称取0.495g硫酸软骨素A溶解于3ml蒸馏水中，充分搅拌均匀，制得硫酸软骨素A水溶液；将0.011g亚硒酸钠(Na2SeO3)溶解于1ml水中，制得亚硒酸钠水溶液；在60Hz，30℃超声条件下，将硒化合水溶液加入硫酸软骨素A水溶液中，制得混合溶液；
2)将0.033g L-抗坏血酸加2ml水充分搅拌至溶解，制得L-抗坏血酸水溶液，然后在搅拌下，将该L-抗坏血酸水溶液逐滴加入步骤1)制得的混合溶液中，60Hz，30℃，超声处理1h，然后将所得溶液装入透析袋中，放入去离子水溶液中透析过夜，第2天更换去离子水继续透析，每隔4小时更换一次去离子水，直至透析袋中的红色纳米硒不再渗出，收集透析袋中的胶体；
3)将胶体冷冻干燥后得到的红色物质即为硫酸软骨素A纳米硒，将该硫酸软骨素A纳米硒用去离子水再次分散，制得硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子。由原子荧光分光光度计测得硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子中硒元素的含量为0.68％。
实施例2
1)称取0.490g硫酸软骨素A溶解于3ml蒸馏水中，充分搅拌均匀，制得硫酸软骨素A水溶液；将0.022g亚硒酸钠(Na2SeO3)溶解于1ml水中，制得亚硒酸钠水溶液；在60Hz，30℃超声条件下，将硒化合水溶液加入硫酸软骨素A水溶液中，制得混合溶液；
2)将0.066g L-抗坏血酸加2ml水充分搅拌至溶解，制得L-抗坏血酸水溶液，然后在搅拌下，将该L-抗坏血酸水溶液逐滴加入步骤1)制得的混合溶液中，60Hz，30℃，超声处理1h，然后将所得溶液装入透析袋中，放入去离子水溶液中透析过夜，第2天更换去离子水继续透析，每隔4小时更换一次去离子水，直至透析袋中的红色纳米硒不再渗出，收集透析袋中的胶体；
3)将胶体冷冻干燥后得到的红色物质即为硫酸软骨素A纳米硒，将该硫酸软骨素A纳米硒用去离子水再次分散，制得硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子。由原子荧光分光光度计测得硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子中硒元素的含量为1.82％。
实施例3
1)称取0.475g硫酸软骨素A溶解于3ml蒸馏水中，充分搅拌均匀，制得硫酸软骨素A水溶液；将0.055g亚硒酸钠(Na2SeO3)溶解于1ml水中，制得亚硒酸钠水溶液；在60Hz，30℃超声条件下，将硒化合水溶液加入硫酸软骨素A水溶液中，制得混合溶液；
2)将0.165g L-抗坏血酸加2ml水充分搅拌至溶解，制得L-抗坏血酸水溶液，然后在搅拌下，将该L-抗坏血酸水溶液逐滴加入步骤1)制得的混合溶液中，60Hz，30℃，超声处理1h，然后将所得溶液装入透析袋中，放入去离子水溶液中透析过夜，第2天更换去离子水继续透析，每隔4小时更换一次去离子水，直至透析袋中的红色纳米硒不再渗出，收集透析袋中的胶体；
3)将胶体冷冻干燥后得到的红色物质即为硫酸软骨素A纳米硒，将该硫酸软骨素A纳米硒用去离子水再次分散，制得硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子。由原子荧光分光光度计测得硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子中硒元素的含量为3.97％。
实施例4
1)称取0.450g硫酸软骨素A溶解于3ml蒸馏水中，充分搅拌均匀，制得硫酸软骨素A水溶液；将0.110g亚硒酸钠(Na2SeO3)溶解于1ml水中，制得亚硒酸钠水溶液；在60Hz，30℃超声条件下，将硒化合水溶液加入硫酸软骨素A水溶液中，制得混合溶液；
2)将0.330g L-抗坏血酸加2ml水充分搅拌至溶解，制得L-抗坏血酸水溶液，然后在搅拌下，将该L-抗坏血酸水溶液逐滴加入步骤1)制得的混合溶液中，60Hz，30℃，超声处理1h，然后将所得溶液装入透析袋中，放入去离子水溶液中透析过夜，第2天更换去离子水继续透析，每隔4小时更换一次去离子水，直至透析袋中的红色纳米硒不再渗出，收集透析袋中的胶体；
3)将胶体冷冻干燥后得到的红色物质即为硫酸软骨素A纳米硒，将该硫酸软骨素A纳米硒用去离子水再次分散，制得硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子。由原子荧光分光光度计测得硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子中硒元素的含量为9.05％。
实施例5
1)称取0.400g硫酸软骨素A溶解于3ml蒸馏水中，充分搅拌均匀，制得硫酸软骨素A水溶液；将0.219g亚硒酸钠(Na2SeO3)溶解于1ml水中，制得亚硒酸钠水溶液；在60Hz，30℃超声条件下，将硒化合水溶液加入硫酸软骨素A水溶液中，制得混合溶液；
2)将0.657g L-抗坏血酸加2ml水充分搅拌至溶解，制得L-抗坏血酸水溶液，然后在搅拌下，将该L-抗坏血酸水溶液逐滴加入步骤1)制得的混合溶液中，60Hz，30℃，超声处理1h，然后将所得溶液装入透析袋中，放入去离子水溶液中透析过夜，第2天更换去离子水继续透析，每隔4小时更换一次去离子水，直至透析袋中的红色纳米硒不再渗出，收集透析袋中的胶体；
3)将胶体冷冻干燥后得到的红色物质即为硫酸软骨素A纳米硒，将该硫酸软骨素A纳米硒用去离子水再次分散，制得硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子。由原子荧光分光光度计测得硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子中硒元素的含量为14.20％。
实施例6
1)称取0.350g硫酸软骨素A溶解于3ml蒸馏水中，充分搅拌均匀，制得硫酸软骨素A水溶液；将0.328g亚硒酸钠(Na2SeO3)溶解于1ml水中，制得亚硒酸钠水溶液；在60Hz，30℃超声条件下，将硒化合水溶液加入硫酸软骨素A水溶液中，制得混合溶液；
2)将0.985g L-抗坏血酸加2ml水充分搅拌至溶解，制得L-抗坏血酸水溶液，然后在搅拌下，将该L-抗坏血酸水溶液逐滴加入步骤1)制得的混合溶液中，60Hz，30℃，超声处理1h，然后将所得溶液装入透析袋中，放入去离子水溶液中透析过夜，第2天更换去离子水继续透析，每隔4小时更换一次去离子水，直至透析袋中的红色纳米硒不再渗出，收集透析袋中的胶体；
3)将胶体冷冻干燥后得到的红色物质即为硫酸软骨素A纳米硒，将该硫酸软骨素A纳米硒用去离子水再次分散，制得硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子。由原子荧光分光光度计测得硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子中硒元素的含量为20.20％。
1、硫酸软骨素纳米硒的IR谱图
硫酸软骨素A的红外吸收光谱在3400cm-1(-OH，存在多糖经基)，1620cm-1(>C＝O)，1560cm-1(C-N，存在乙酞氨基)，1200cm-1至800cm-1间(存在硫酸基)有特征吸收峰。如图1所示的硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子(SeCS，SeCS1-6为投料比不同制备的不同硒含量的硫酸软骨素A纳米硒，其中硒的含量分别为0.68％、1.82％、3.97％、9.05％、14.20％和20.20％)与硫酸软骨素A(CS)的红外光谱对比谱图，横坐标为波数，可以看到所制备的硫酸软骨素A纳米硒红外图谱峰位没有明显改变减弱，峰强在1310cm-1随着硒含量的增加峰强加强的变化较明显。纳米硒与硫酸软骨素结合的方式可能为物理吸附、共价结合或者分子间氢键。
2、硫酸软骨素纳米硒的XRD谱图
如图2所示，将SeCS1-6与亚硒酸钠(Na2SeO3)比较可以发现二者的峰位和强度完全不同，说明在硫酸软骨素A中硒的存在方式已经发生变化；而SeCS与CS的XRD衍射对比谱图，横坐标以2θ表示衍射仪扫描角度，纵坐标为强度；可以看出，二者晶体衍射的峰位和强度均未发生较大的变化，说明纳米硒的引入并没有改变硫酸软骨素A的非晶结构。
3、硫酸软骨素A纳米硒胶束的丁达尔效应
将SeCS1-6与CS制备成浓度为0.1％的水溶液，超声10min后依次摆开，用激光笔分别从SeCS1(左侧)和CS(右侧)照射，结果如图3，发现SeCS1-6可见丁达尔现象，而CS无论从左侧还是右侧照射均无丁达尔效应(当一束光线透过胶体，从入射光的垂直方向可以观察到胶体里出现的一条光亮的“通路”，这种现象叫丁达尔现象，也叫丁达尔效应)，说明SeCS1-6均能形成较好的胶体。
4、硫酸软骨素A纳米硒的粒径和表面电位
以去离子水分散不同浓度的硫酸软骨素A纳米硒制成0.1％的胶体，超声10min后，置于马尔文纳米粒度电位仪(Zetasizer)检测，粒径结果如图4所示，与CS相比SeCS的分散性较好，分散系数PDI可从0.58降至0.078，粒径分布在30nm-270nm，随着引入纳米硒的浓度增加先减小再增大；表面电位结果如图5所示，与CS相比SeCS表面负电荷的绝对值随着引入纳米硒的浓度增加先降低再升高。
5、溶解度与稳定性试验
鉴于SeCS4的PDI最小，表面电位的绝对值最大，因此将SeCS4与本课题组早期研发的硫酸软骨素纳米硒粒子(CSS)相比较，结果如图6，SeCS4和CSS的浓度分别为0.2％和0.5％。比较颜色可以发现SeCS4较红，溶解性良好，而CSS颜色较浅，并且超声后尚有一些不溶解的纳米粒子。静置1h后SeCS4变化不大，而CSS中可见更多不溶解的纳米粒子，因此可以判断新形成的SeCS4较原先工艺合成的CSS溶解性好，性质稳定，是可以作为医用注射剂的潜在可能制剂。
6、硫酸软骨素纳米硒的生物活性
鉴于SeCS4的PDI最小，表面电位的绝对值最大，相较于其他SeCS纳米胶束较稳定，所以生物活性的研究选择SeCS4作为研究对象，细胞实验分为4组分别是对照组(KBD患者软骨细胞)、补硒组(SeCS4 100ng/ml，硒的含量为9.1％)、T-2组(T-2毒素浓度为20ng/ml)、T-2+补硒组。干预1天后，用Live/Dead死活细胞染料染色，观察不同组细胞的数量，图7为不同干预下软骨细胞的荧光显微镜图(红色代表死细胞，绿色代表活细胞)，可以发现SeCS4组软骨细胞数量教对照组增多，T-2毒素组较对照组细胞数量减少，并且可见死亡细胞(箭头)，SeCS4与T-2毒素同时使用时细胞数较T-2组稍多。
综上所述，本发明采用生物活性较高的硫酸软骨素A作为纳米硒的载体替代之前的人工合成化工品硫酸软骨素，硫酸软骨素A是多种硫酸软骨素(A、B、C、D、E等)中的一种，由D-葡糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖以β-1,4-糖苷键连接而成的重复二糖单位组成的多糖，并在N-乙酰氨基半乳糖的C-4位羟基上发生硫酸酯化。硫酸软骨素A也是构成软骨细胞外基质的一种主要的硫酸化多糖，在关节软骨的细胞外基质中的生物大分子有蛋白聚糖的聚集体聚集蛋白聚糖和胶原纤维等，而构成蛋白聚糖的主要聚糖为糖胺聚糖，其中以硫酸软骨素A、C含量最多。
本发明中的硫酸软骨素A为高分子聚合物，呈现非晶体结构，硫酸软骨素A是关节软骨基质中的一种重要的成分，与关节应力引起的损伤有关，且与应力相关信号通路密切相关，本发明通过硫酸软骨素A物理吸附作用将纳米硒包裹于形成的胶束粒子的中心，并在胶束表面形成负电荷，以增大胶束表面电位的绝对值，所以自组装形成的纳米胶束更加稳定，而且冻干所得的冻干粉的再分散性亦大大提高。

Claims (8)

1.一种硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子，其特征在于，以硫酸软骨素A作为载体，将纳米硒通过物理吸附结合在硫酸软骨素A上形成纳米胶束粒子，其中硒的质量分数为0.1％～25％，所述的硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子在水中自组装形成平均粒径为85nm、表面电荷为-47mV的纳米胶束。
2.一种硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以质量份数计，取1份硫酸软骨素A、将0.1～1份硒化物及2～5份L-抗坏血酸；
2)将硫酸软骨素A加水充分搅拌至溶解，制得硫酸软骨素A水溶液，将硒化物加水充分搅拌至溶解，制得硒化物水溶液；在60Hz，30℃超声条件下，将硒化物 水溶液加入硫酸软骨素A水溶液中，制得混合溶液；
3)将L-抗坏血酸加水充分搅拌至溶解，制得L-抗坏血酸水溶液，将该L-抗坏血酸水溶液逐滴加入步骤2)制得的混合溶液中，60Hz，30℃超声处理1h，然后将所得溶液装入透析袋中，放入去离子水溶液中透析处理，直至透析袋中的红色纳米硒不再渗出，收集透析袋中的胶体，所述透析采用截留分子量为3500的透析袋；
4)将胶体冷冻干燥后得到的红色物质即为硫酸软骨素A纳米硒，将该硫酸软骨素A纳米硒用去离子水再次分散，制得硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子。
3.根据权利要求2所述的硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子的制备方法，其特征在于，硫酸软骨素A加入其3倍体积的水充分搅拌至溶解制得硫酸软骨素A水溶液；硒化物水溶液的体积为硫酸软骨素A水溶液体积的1/3；L-抗坏血酸水溶液的体积为硫酸软骨素A水溶液体积的2/3。
4.根据权利要求2所述的硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子的制备方法，其特征在于，步骤3)所述透析处理是将所得溶液装入透析袋中，放入去离子水溶液中透析过夜，第2天更换去离子水继续透析，每隔4小时更换一次去离子水，直至透析袋中的红色纳米硒不再渗出。
5.根据权利要求2所述的硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子的制备方法，其特征在于，所述硒化物为亚硒酸盐。
6.根据权利要求5所述的硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子的制备方法，其特征在于，所述亚硒酸盐为亚硒酸钠或亚硒酸氢钠。
7.权利要求1所述的硫酸软骨素A纳米硒胶束粒子在制备预防/治疗骨关节病的药物中的应用。
8.如权利要求7的应用，其特征在于，所述的药物为拮抗T-2毒素诱导的软骨细胞凋亡的药物。
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