DE3925109A1 - Extrakte der pflanze acanthospermum hispidum - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen Extrakt der Pflanze Acantho­ spermum hispidum, der die wasserlöslichen Bestandteile mit einem Molekulargewicht von < 2000 enthält.

Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung des Extrakts von Acanthospermum hispidum als Arzneimittel. Außerdem be­ trifft die Erfindung die Verwendung von Extrakten der Pflanze Acanthospermum hispidum zur Immunmodulation (Beein­ flussung des Immunstatus) von Säugern, zur Behebung von Strahlenschäden, sowie zur Prophylaxe und Therapie von vira­ len und und retroviralen Erkrankungen bei Säugern und zur Therapie von Tumoren.

Schließlich betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung eines Extraktes aus Teilen der Pflanze Acanthospermum hispi­ dum und Auftrennung der Inhaltsstoffe aufgrund des Moleku­ largewichtes.

Acanthospermum hispidum (compositae) ist eine aus Südamerika stammende Pflanze, die sich in den Tropen weltweit verbrei­ tet hat. In der traditionellen Medizin der westafrikanischen Naturvölker wird Acanthospermum hispidum (A.h.) zur Herstel­ lung von Tees (Extrakten) für die Behandlung von Gelbsucht verwendet. Außerdem benutzt man A.h. zur Behandlung von Herpes labialis, wobei der Blättersaft auf die erkrankte Stelle getupft wird.

Die therapeutische Wirkung dieser Extrakte (wie auch des Blättersaftes) bei der Behandlung von Herpes labialis ist folgende: Nachlassen der Schmerzen 1-3 Stunden nach Appli­ kation, Verkürzung des Heilungsprozesses auf 2-3 Tage und Verlängerung der Rezidivintervalle. Wird dieses Naturheil­ mittel innerhalb der ersten Stunden nach Auftreten der Symptome angewandt, führt es meistens zur völligen Unter­ drückung der Läsionbildung. Der Extrakt ist ebenfalls wirk­ sam gegen Herpes genitalis.

Eine Übersicht der Inhaltsstoffe des A.h. ist aus der Mono­ graphie "The Biology and Chemistry of the Compositae", her­ ausgegeben von V.H. Heywood, J.B. Harborne und B.L.Turner, Academic Press, London, New York, San Francisco, 1977, er­ sichtlich. Melampolide, Galactoside, Acetylene sind von der Gruppe F. Bohlmann in Berlin aus A.h. isoliert und deren chemische Struktur aufgeklärt worden. (Phytochemistry, 1979, Bd. 18, Seiten 625-630; Planta Medica, 1986, Seiten 154-155; Phytochemistry, 1976, Bd. 15, Seiten 1776-1778). Die ätheri­ schen Öle dieser Pflanze sind auf ihre mikrobielle und anti­ fungizide Wirkung untersucht worden (S.R. Jain et al., Planta Medica 1972; Bd. 22, Seite 136 und S.R. Jain und A. Kar, Planta Medica, 1971, Bd. 20, Seite 118). Toxikologische Untersuchungen über die Verwendung von A.h. als Futter­ pflanze haben B. Ali und I. Adam an Ziegen und Mäusen durch­ geführt (J. Comp. Pathology, 1978, Bd. 88, Seiten 443-448 und Seiten 533-544).

Bislang jedoch konnte Acanthospermum hispidum oder ein Ex­ trakt aus dieser Pflanze keine breitere Verwendung finden, da aufgrund der Toxizität einiger Inhaltsstoffe eine orale Verabreichung nicht möglich war.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine nicht­ toxische, jedoch therapeutisch aktive Präparation aus Acan­ thospermum hispidum bereitzustellen. Diese Aufgabe wird durch den überraschenden Befund gelöst, daß mit der Entfer­ nung von niedrigmolekularen Bestandteilen aus einem Extrakt von Acanthospermum hispidum auch die toxische Wirkung des Extraktes verschwindet.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Extrakt der Pflanze Acanthospermum hispidum, der die wasserlöslichen Bestand­ teile mit einem Molekulargewicht < 2000 enthält.

Gegenstand der Erfindung ist ferner der genannte Extrakt der Pflanze Acanthospermum hispidum zur Verwendung als Arznei­ mittel, insbesondere als Immunmodulator, bei der Behebung von Strahlenschäden, bei der Prophylaxe und Therapie von Vi­ ruserkrankungen oder Retroviruserkrankungen bei Säugern und bei der Therapie von Tumoren.

Vorzugsweise sind die Extrakte der Erfindung wäßrige Ex­ trakte von Acanthospermum hispidum. Es wurden jedoch auch andere Extraktionsmittel wie Äthanol, Chloroform, Isopropa­ nol, Benzin und dgl. verwendet. Nachstehend wird die Erfin­ dung am Beispiel eines wäßrigen Extraktes erläutert.

Zur Gewinnung des Extraktes werden frische oder getrocknete Blätter von Acanthospermum hispidum bei 4°C bis 100°C, vor­ zugsweise bei Zimmertemperatur in Wasser suspendiert und ho­ mogenisiert. Die unlöslichen Bestandteile werden zunächst durch Zentrifugation und Filtration abgetrennt. Der Über­ stand, bzw. das Filtrat, werden gefriergetrocknet, so daß flüchtige Substanzen aus dem Extrakt entfernt werden.

Das Produkt wird dann in destilliertem Wasser gelöst, von unlöslichen Bestandteilen abzentrifugiert und einer Behand­ lung zur Entfernung der Bestandteile mit niedrigem Moleku­ largewicht unterzogen. Vorzugsweise wird 1 Stunde bei 100 000 g zentrifugiert und die Dialyse erfolgt gegen phos­ phat-gepufferte, physiologische Kochsalzlösung (PBS). In einer anderen Ausführungsform werden die niedermolekularen Bestandteile durch eine Ammoniumsulfatfällung abgetrennt. Durch diese Schritte werden Bestandteile mit einem Moleku­ largewicht von < 2000 aus dem Extrakt entfernt. Die nachste­ hend beschriebenen biologischen Aktivitäten sind in der makromolekularen Fraktion enthalten.

Die enzymatische Behandlung des Extraktes mit Trypsin, Chy­ motrypsin, Pronase, Amyloglukosidase oder DNAse verändern dessen Aktivität nicht. Sie wird auch nicht durch Hitze (5 Minuten, 100°C) zerstört, wohl aber durch saure Hydrolyse oder durch Perjodatoxidation. Der Anteil an Aminosäuren ist sehr niedrig, ca. 0,2%. Folgende Zucker sind in dem Extrakt enthalten: Rhamnose, Fucose, Ribose, Arabinose, Xylose, Man­ nose, Glucose und Galactose.

Der wäßrige Extrakt der Erfindung (nachstehend als "A.h.-Ex­ trakt" bezeichnet) zeigt eine Reihe von biologischen Aktivi­ täten:

1. Direkte antivirale und antiretrovirale Aktivität

Sie wurde gezeigt bei VSV (Vesikuläres Stomatitisvirus), bei MHV3 (Maus Hepatitis Virus 3) und bei HIV (Humanes Immundeffizienz-Virus).

VSV bzw. HIV wurden mit A.h.-Extrakt inkubiert und an­ schließend mit Mäusefibroblastenzellkulturen (VSV) bzw. MT4-Zellen (HIV) titriert, um die Virus-neutralisierende Wirkung von A.h.-Extrakt zu messen.

Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen eine nachhaltige Virusneutralisation selbst durch stark verdünnte A.h.-Ex­ trakte. Der mögliche Einsatz von A.h.-Extrakt zur Thera­ pie von infizierten Individuen wurde gemessen an Mäusen, die mit MHV3 infiziert waren und entweder subkutan oder oral verschiedene Dosen von A.h.-Extrakt erhielten. Ge­ genüber Kontrollmäusen, die ebenfalls infiziert waren, jedoch keinen Extrakt von A.h. erhielten, wurde eine deutlich erhöhte Überlebensrate nach Gabe von A.h.-Ex­ trakt über 5 Tage festgestellt.

2. Positive Beeinflussung des Immunstatus von Säugern

Sie wurde gezeigt an menschlichen und Mäusezellkulturen durch Gabe von A.h.-Extrakt.

Neben der Virus-neutralisierenden Wirkung wurde auch eine positive Beeinflussung des Immunstatus beobachtet. Dazu wurden Versuche in verschiedenen Systemen durchgeführt.

Um zu untersuchen, ob die Proliferation von B-Lymphozyten induziert werden kann, wurden Milzzellen der Maus (CBF) mit verschiedenen A.h.-Mengen inkubiert. Die Prolifera­ tion der Milzzellen wurde mit ³H-Thymidin oder mit alka­ lischer Phosphatase bestimmt.

In den Überständen von Milzzellkulturen nach 5 Tagen wurde die IgM-Konzentration gemessen und damit die Stimu­ lation der IgM-Synthese in Milzzellkulturen der Maus be­ stimmt. In weiteren Versuchen wurden Knochenmarksmakro­ phagen (KMM) der Maus dazu benutzt, um die Stimulation der Sauerstoffradikalproduktion bzw. die Induktion der Proliferation von ausgereiften Knochenmarksmakrophagen zu messen. Analog wurden entsprechende Versuche zur Stimula­ tion der Sauerstoffradikalproduktion in Humangranulozyten und zur Induktion der Proliferation von peripheren Human­ lymphozyten durchgeführt. In all diesen Fällen zeigte sich eine deutliche stimulierende bzw. induzierende Wir­ kung von A.h.-Extrakt auf die betreffenden Zellkulturen.

Eine Induktion der Bildung von Interferon konnte in Kno­ chenmarksmakrophagen der Maus nachgewiesen werden. Dazu wurden Knochenmarksmakrophagen mit verschiedenen Verdün­ nungen von A.h.-Extrakt für 1 Stunde inkubiert und die Zellen nach Waschen für weitere 24 Stunden ohne A.h.-Ex­ trakt weiter kultiviert. Nachgewiesen wurde das gebildete Interferon in den Überständen dieser Kulturen durch Neu­ tralisation von Viren. Als System wurde dazu Stomatitis­ virus der Maus benutzt.

3. Therapie von Strahlenschäden

Sie wurde durchgeführt an Knochenmarksmakrophagen der Maus, die mit einer weichen Röntgenstrahlenquelle be­ strahlt wurden. Die deutlich erhöhte Überlebensrate von mit A.h.-Extrakt behandelten Zellen gegenüber unbehandel­ ten Zellen wurde mittels der Reduktion eines Farbstoffes bestimmt.

4. Tumortherapeutische Aktivität

Sie wurde gezeigt in der Wirkung gegenüber dem Meth A- Fibrosarkom der Maus.

Nachdem die Untersuchungen über die Wirkung von A.h.-Ex­ trakten ergaben, daß sowohl spezifische wie unspezifische Abwehrmechanismen des Organismus stimuliert werden, zeigte sich erstaunlicherweise auch, daß A.h.-Extrakte eine sehr starke antitumorale Wirkung besitzen, die in vivo an tumortherapeutischen Modellen mit Erfolg getestet wurde. Als Testmodell wurde ein methylcholantren-indu­ ziertes, transplantierbares Fibrosarkom der Maus benutzt (Meth A-Fibrosarkom, induziert von L. Old im Sloan Kettering Institute for Cancer Research in New York, USA).

Dazu wird eine definierte kleine Menge Tumorzellen intra­ cutan in die Bauchmitte von Inzuchtmäusen injiziert, die genetisch kompatibel mit dem Fibrosarkom sind. Dieser Tu­ mor zeigt ein in allen Mäusen gleichmäßiges, relativ schnelles Wachstum und führt ohne Therapie innerhalb von 5 Wochen zum Tod der Tiere. Die Größe des Tumors ist ein­ fach zu bestimmen, da er direkt in der Haut wächst und somit äußerlich gut meßbar ist.

CBF1-Mäusen wurden im Versuch Meth A-Fibrosarkom-Zellen intracutan in die rasierte Bauchmitte gespritzt. Am 3., 5. und 7. Tag nach der Implantation des Tumors wurden subcutan A.h.-Extrakte in der Nähe der inginalen Lymph­ knoten injiziert. Am Tag 7, 14, 21 und 28 nach Setzen der Tumore wurden deren Durchmesser ermittelt und die Tumor­ masse berechnet. Am Ende des Versuchs wurde die Anzahl der geheilten Tiere ermittelt.

Die Therapie mit A.h.-Extrakt retardiert zunächst das Tu­ morwachstum, danach verkleinert sie die Tumormasse und anschließend führt sie bei der Mehrheit der Tiere zur Ab­ stoßung der Tumore. Mit den verwendeten Extrakten wurde eine Regressionsrate bis zu 100% erreicht, d.h., alle behandelten Tiere wurden geheilt. Bei Langzeitbeobachtun­ gen über mehrere Monate traten keine Rezidive in den ge­ heilten Mäusen auf.

Von besonderem Interesse ist die Tatsache, daß die Tumor­ abstoßung zu einem Zeitpunkt stattfindet, an dem die The­ rapie bereits abgeschlossen ist. Das deutet darauf hin, daß der A.h.-Extrakt eine lang anhaltende therapeutische Wirkung entfaltet.

In den beiliegenden Zeichnungen zeigt:

Fig. 1 die antivirale Aktivität von A.h.-Extrakt gegen VSV der Maus am Beispiel von L929-Fibroblasten. Jeder Punkt zeigt den Titer der einzelnen Kulturen mit bzw. ohne A.h.-Extrakt an.

Fig. 2 die antiretrovirale Aktivität von A.h.-Extrakt gegen HIV, gemessen an MT4-Zellen. HI-Viren werden durch A.h.-Extrakt bis zu einer Verdünnung von 1 : 400 neu­ tralisiert.

Fig. 3 die Induktion der Proliferation von B-Lymphozyten von CBF-Milzzellen der Maus. Die Proliferation wird mit ³H-Thymidin oder alkalischer Phosphatase bestimmt.

Fig. 4 die Stimulation der Knochenmarksmakrophagen der Maus. Die Messung erfolgt durch die Umwandlung kurzlebiger Sauerstoffradikale in Lichtimpulse. Empfänger der Sauerstoffradikale sind Lucigenin oder Luminol.

Fig. 5 die Induktion der Proliferation von ausgereiften Kno­ chenmarksmakrophagen der Maus, gemessen am Einbau von ³H-Thymidin.

Fig. 6 die Therapie von Strahlenschäden in Knochenmarksma­ krophagen der Maus. Der Viabilitätstest erfolgt durch photometrische Messung (570 nm) der Reduktion von MTT (3-(4,5-Dimethyl-thiazol-2-yl)-3,5-diphenyltetrazo­ liumbromid). Die Bestrahlung der Knochenmarksmakro­ phagen mit unterschiedlichen Dosen erfolgt mittels einer weichen Röntgenquelle (60 KV, 25 mA). Eine Stunde nach Bestrahlung wird A.h.-Extrakt zugegeben. Nach verschiedenen Kultivationszeiten der Kulturen mit A.h.-Extrakt bzw. Kontrollen ohne A.h.-Extrakt werden die Zellen mit 10 µl MTT-Lösung (5 mg/ml) ver­ setzt und die Extinktionswerte ermittelt.

Fig. 7 die tumortherapeutische Aktivität von A.h.-Extrakt gegenüber Meth A-Fibrosarkom der Maus. Die Masse der induzierten Tumore wird an den Tagen, 7, 14, 21 und 28 nach dem Setzen der Tumore und Injektion von A.h.- Extrakt ermittelt. In der rechten Spalte ist die An­ zahl der geheilten Tiere bzw. die Gesamtzahl der untersuchten Tiere angegeben.

Fig. 8 die Stimulation der Sauerstoffradikalproduktion in Humangranulozyten. Die Messung erfolgt analog zu dem in Fig. 4 angegebenen Verfahren.

Fig. 9 die Induktion der Proleferation von peripheren Human­ lymphozyten nach Gaben von A.h.-Extrakt. Gemessen wurde der Einbau von ³H-Thymidin.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung von Acanthospermum hispidum-Extrakt aus frischen Blättern

a) 1 kg frisch geerntete Blätter von Acanthospermum hispidum werden zweimal mit je 5 Liter destilliertem Wasser gewa­ schen. Die abgetropften Blätter werden mit 1 Liter de­ stilliertem Wasser versetzt, in einen Homogenisator (z.B. Warring Blendor) gefüllt und homogenisiert, bis die Blät­ terteile kleiner als 1 mm² sind. Die Temperatur im Ansatz soll bei dieser Prozedur 30°C nicht übersteigen. Der Blätterbrei wird 20 Minuten bei 6000 g zentrifugiert. Der Überstand wird über ein Whatmanfilter Nr. 1 filtriert und gefriergetrocknet.

Die Ausbeute beträgt ca. 30 g. Dieser Rohextrakt kann bei 4°C bis zur weiteren Verwendung trocken aufbewahrt wer­ den.

b) 6 g Rohextrakt werden in 300 ml destilliertem Wasser auf­ genommen und ergeben eine trübe Lösung. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 100 000 g und 4°C ultrazentrifugiert. An­ schließend wird der Überstand gegen 4×10 Liter destil­ liertes Wasser je 12 Stunden bei 4°C dialysiert. Der dia­ lysierte Extrakt wird entweder bei -20°C tiefgefroren oder gefriergetrocknet. Die Ausbeute beträgt etwa 1,2 g.

c) Zur Ammoniumsulfatfällung werden zu 100 ml dialysiertem Extrakt 13,24 g Ammoniumsulfat (Endkonzentration 1 M) langsam bei 0°C unter ständigem Rühren gegeben. Mit 25%­ iger Ammoniaklösung wird der pH auf 7,2 eingestellt. Bei 0°C wird 30 Minuten weiter gerührt und die Präzipitation fortgesetzt. Anschließend wird das Gemisch 10 Minuten bei 3000 g (4°C) zentrifugiert. Der Überstand (1 M) wird auf­ bewahrt und das Sediment in 10 ml 1 M Ammoniumsulfatlö­ sung zur Waschung resuspendiert. Dieses Gemisch wird nochmals 10 Minuten bei 3000 g (4°C) zentrifugiert und der Waschüberstand verworfen. Das Sediment 1 M wird in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Zu dem Überstand 1 M werden 13,24 g Ammoniumsulfat (Endkonzentration 2 M) lang­ sam bei 0°C unter ständigem Rühren zugegeben. Mit 25%­ iger Ammoniaklösung wird der pH auf 7,2 eingestellt und die Präzipitation bei 0°C 30 Minuten fortgesetzt. Das Ge­ misch wird 10 Minuten bei 3000 g (4°C) zentrifugiert. Der Überstand 2 M wird aufbewahrt. Das Sediment 2 M wird in 5 ml 2 molarer Ammoniumsulfatlösung resuspendiert und noch­ mals 10 Minuten bei 3000 g (4°C) zentrifugiert. Der Waschüberstand wird verworfen.

Das Sediment 2 M wird in 20 ml destilliertem Wasser ge­ löst.

Sediment 1 M, Sediment 2 M und Überstand 2 M werden je 4×12 Stunden gegen 10 Liter destilliertes Wasser bei 0°C dialysiert und die Dialysate gefriergetrocknet. Die Aus­ beute beträgt: Sediment 1 M ca. 200 mg; Sediment 2 M ca. 50 mg; Überstand 2 M ca. 95 mg.

Beispiel 2 Herstellung von Acanthospermum hispidum-Extrakt aus getrockneten Blättern

200 g luftgetrocknete Blätter werden mit Hilfe einer Schnei­ demühle zerkleinert. Zum Aufquellen werden die zerkleinerten Blätter mit 1 Liter destilliertem Wasser versetzt und 18 Stunden bei 4°C gerührt. In einem Homogenisator (z.B. Warring Blendor) wird das Gemisch 3×60 Sekunden lang homo­ genisiert. Das Gemisch wird auf 100°C 10 Minuten im Wasser­ bad erhitzt. Anschließend wird wie in Beispiel 1 zentrifu­ giert und gefriergetrocknet. Die Weiterverarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1, Buchstabe b) und c). Die Ausbeute im Roh­ extrakt beträgt ca. 3,5 g, im dialysierten Extrakt ca. 0,75 g, im Sediment 1 M ca. 5 mg und Sediment 2 M ca. 55 mg und im Überstand 2 M ca. 85 mg.

Beispiel 3 Proliferation von Mäusemilzzellen in Gegenwart von A.h.-Extrakten

Milzzellen werden aus Inzuchtmäusen (z.B. CBFI, C3H, Balb/c) unter sterilen Bedingungen entfernt. Mit Hilfe eines losen Potter-Homogenisators wird eine Zellsuspension hergestellt.

Nach Zentrifugation (5 Minuten, 700 g, 4°C) werden die Milz­ zellen in Gewebekulturmedium (DMEM) resuspendiert. Das Me­ dium enthält folgende Zusätze: 10% fötales Kälberserum, 50 µM 2-Mercaptoäthanol, 5 µg Streptomycin/ml und 100 I.E. Pe­ nicillin/ml.

Die Zellen werden auf eine Konzentration von 5 000 000/ml eingestellt.

0,2 ml Zellsuspension werden pro Loch in Mikrotiterplatten (Typ: Flachboden) gefüllt. Dazu werden je 10 µl der ver­ schiedenen A.h.-Extraktlösungen (sterilisiert durch Filtra­ tion) gegeben. Die Mikrotiterplatten mit den Zellkulturen werden in einem begasten Brutschrank (37°C, 10% CO₂, 98% rel. Luftfeuchtigkeit) verschiedene Zeiten gemäß Versuchsan­ satz inkubiert. Dazu werden Parallelkulturen angesetzt, um B-Zellproliferation nach verschiedenen Tagen messen zu kön­ nen. Das ist notwendig, weil nach Zugabe des ³H-Thymidins die Kulturen durch den Erntevorgang zerstört werden. Zur Messung der Zellproliferation werden die Mikrotiterplatten 10 Minuten mit 700 g bei Zimmertemperatur zentrifugiert. Die Zellsedimente werden mit je 200 µl neuem Kulturmedium (+ Zu­ sätze wie oben) und 0,2 µCi ³H-Thymidin versetzt. Nach 6 Stunden weiterer Inkubation im begasten Brutschrank werden die Zellen mit einem handelsüblichen Erntegerät (z.B. Skatron Cell-Harvester) geerntet. Die Bestimmung der Radio­ aktivität in der zellulären DNS erfolgt mit einem handelsüb­ lichen β-Szintillationszähler.

Die Tabelle I zeigt die Ergebnisse eines Experiments von Beispiel 3. Die Zellen wurden 4 Tage vor Messung der Proli­ feration inkubiert. Die Proliferation ist angegeben in % ge­ genüber der Kontrolle. Der Wert in der Klammer bedeutet: ³H-Impulse pro Minute in der Kontrolle. Zugegeben wurden 10 µg A.h.-Extrakt pro Kultur.

Tabelle I

Beispiel 4 Stimulation der IgM-Synthese in Milzzellkulturen durch A.h.- Extrakte

Gemessen werden die Immunglobuline der Klasse M (IgM), da in vitro vorwiegend diese Antikörperklasse synthetisiert wird.

Die Kulturen werden wie in Beispiel 3 in Mikrotiterplatten angesetzt. Nach 5 Tagen Inkubationszeit (37°C, 10% CO₂, 98% rel. Luftfeuchte) wird bei Zimmertemperatur und 700 g 5 Minuten lang zentrifugiert.

100 µl jedes Überstandes werden entnommen und in eine neue Mikrotiterplatte gegeben, die vorher für den ELISA-Maus-IgM- Test vorbehandelt worden ist. Als Indikatorreagenz dient ein Antimaus IgG (Ziege) Antiserum, das mit alkalischer Phospha­ tase gekoppelt ist. Die Antikörpermengen sind aus der Ta­ belle II zu ersehen und werden in µg/ml angegeben.

Tabelle II

Beispiel 5 Proliferation von Makrophagen der Maus durch A.h.-Extrakte

Die Makrophagen werden nach der Methode von Metcalf in vitro gezüchtet. Dazu isoliert man Knochenmarkszellen aus dem Fe­ mur der Maus und kultiviert sie in einem Kulturmedium (DMEM), das 30% Fibroblastenkulturüberstand aus der Zell­ linie L 929 und 5% Pferdeserum enthält. Durch diese Zusätze proliferieren und differenzieren die Stammzellen ausschließ­ lich in Makrophagen. Nach 10 Tagen Inkubation bestehen diese Kulturen nur aus reinen Makrophagen, die keine Proliferation mehr zeigen. Durch die Zugabe von A.h.-Extrakten fangen sie überraschenderweise erneut an, sich zu teilen, ohne daß eine Dedifferenzierung stattfindet. Diese Proliferation wird wie folgt gemessen:
Je 20 000 Makrophagen werden in 200 µl Kulturmedium (wie in Beispiel 3) pro Loch in Mikrotiterplatten gefüllt. Dazu wer­ den je 10 µl der verschiedenen A.h.-Extrakte zugegeben. Im begasten Brutschrank wird 4 Tage inkubiert und anschließend bei Zimmertemperatur (700 g/5 Minuten) zentrifugiert. Die Überstände werden gegebenenfalls zur Interferonbestimmung aufbewahrt. Je 200 µl Kulturmedium mit 0,2 µCi ³H-Thymidin werden auf die Zellen pipettiert. Danach wird für weitere 24 Stunden im begasten Brutschrank inkubiert. Die Mikrotiter­ platten mit den Kulturen werden bei -20°C eingefroren zur Ablösung der am Kulturgefäß haftenden Makrophagen, aufgetaut und die Radioaktivität der zellulären DNS wie in Beispiel 3 bestimmt.

Beispiel 6 Bestimmung der Interferoninduktion durch A.h.-Extrakte in der Knochenmarksmakrophagenkultur der Maus

Je 100 000 Makrophagen werden in 200 µl Kulturmedium (DMEM; wie in Beispiel 3) pro Loch in Mikrotiterplatten eingefüllt.

Mit verschiedenen A.h.-Verdünnungen wird für 1 Stunde inku­ biert. Die Zellen werden einmal gewaschen in Kulturmedium und weitere 24 Stunden in Abwesenheit des A.h.-Extraktes kultiviert. Anschließend werden die Überstände zur Interfe­ ronbestimmung abpipettiert.

Die Interferonbestimmung beruht auf der Neutralisation des Virus der vesiculären Stomatitis der Maus. Dieses Virus ver­ mag Mäusefibroblasten (Zellinie L929) zu infizieren und sie durch die Virusproliferation und -sekretion zu zerstören. Dieser zytopathologische Effekt kann mikroskopisch beobach­ tet werden.

Dazu werden 20 000 L929-Zellen in 100 µl Kulturmedium in Mikrotiterplatten eingesät.

Je 100 µl der Makrophagenkulturüberstände oder als Kontrolle die A.h.-Extrakte (verdünnt in 100 µl Medium) werden zugege­ ben.

Die Mikrotiterplatten werden 24 Stunden im begasten Brutschrank inkubiert (37°C, 10% CO₂, 98% relative Luft­ feuchtigkeit).

Je 10 µl (entspricht 7000 infektiöse Einheiten) des vesiku­ lären Stomatitisvirus (VSV) werden pro Loch zugegeben. Anschließend wird für weitere 48 Stunden im begasten Brutschrank inkubiert.

Die Zellzerstörung (zytopathischer Effekt) oder eventuelle Inhibition durch Interferon in der Kultur wird mikroskopisch abgelesen.

Die Tabelle III zeigt die Ergebnisse eines solchen Experi­ ments. Die negativen Zeichen geben die Zellzerstörung (zyto­ pathischer Effekt), die positiven Zeichen deren Hemmung durch die Anwesenheit von Interferon an.

Tabelle III

Beispiel 7 Stimulation der Sauerstoffradikalproduktion in Knochenmarksmakrophagen der Maus

Die Makrophagen werden nach der Methode von Metcalf in Tef­ lonbeuteln aus dem Knochenmark gezüchtet (siehe Beispiel 5). Die Messung erfolgt durch die Umwandlung der sehr kurzlebi­ gen Sauerstoffradikale in Lichtimpulse. Dazu benutzt man Substanzen wie Lucigenin oder Luminol, die als Empfänger der Sauerstoffradikale dienen. Durch die Oxidationsprozesse ent­ stehen Photonen, die mit handelsüblichen Geräten (Biolumat, Fa. Berthold) gemessen werden. Der Versuchsansatz sieht fol­ gendermaßen aus:
200 000 Knochenmarksmakrophagen werden in 0,2 ml DMEM ohne Phenolrot und NaHCO₃ mit 50 mM HEPES als Puffersubstanz 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Messung erfolgt nach Zugabe von 0,2 ml DMEM, 10 µl Lucigeninlösung (11,6 µMol) und 10 µl der entsprechenden A.h.-Verdünnung (1 mg/ml).

Beispiel 8 Therapie von Strahlenschäden in Knochenmarksmakrophagen der Maus

Knochenmarksmakrophagen der Maus werden mit einer weichen Röntgenstrahlenquelle (60 KV, 25 mA) bestrahlt. Die Viabili­ tät der Zellen wird mit Hilfe der Reduktion von MTT (3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenyltetrazoliumbromid) be­ stimmt. Pro Loch werden 100 000 KMM inkubiert.

Die Zugabe von A.h.-Extrakt erfolgt 1 Stunde nach Bestrah­ lung. Nach verschiedenen Kultivationszeiten werden die Zel­ len mit 10 µl MTT-Lösung (5 mg/ml) versetzt, die Platten nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C zentrifugiert, das Kul­ turmedium entfernt und die Tetrazoliumblau-Kristalle in 100 µl Isopropanol - 0,04 M HCl gelöst.

Die Farbe wird in einem Mikrotiterphotometer bei 570 nm ab­ gelesen.

Beispiel 9 Tumortherapeutische Aktivität gegenüber dem Meth A-Fibrosarkom der Maus

CBF1-Mäuse werden mit je 50 000 Meth A-Fibrosarkom-Zellen intrakutan in die rasierte Bauchmitte gespritzt. Am 3., 5. und 7. Tag nach Implantation des Tumors werden je 1 mg der A.h.-Extrakte subkutan nahe der inginalen Lymphknoten inji­ ziert.

Am Tag 7, 14, 21 und 28 nach Setzen der Tumore ermittelt man deren Durchmesser. Da die Tumore nicht ganz rund wachsen, werden der kleinste und der größte Durchmesser mit einer Schieblehre gemessen. Die Tumormasse wird anhand der Formel

berechnet, die dem Volumen eines halben Ellypsoiden ent­ spricht.

Beispiel 10 Induktion der Proliferation von peripheren Humanlymphozyten (PBL) aus dem Blut durch A.h.-Extrakte

20 ml heparinisiertes Vollblut (5 I.E. Heparin/ml) werden mit 60 ml physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. 5 ml Ficoll-Isopaquelösung (Dichte 1,17) werden in Zentrifu­ gengläser gefüllt und mit 5 ml des verdünnten Blutes über­ schichtet.

Zentrifugation erfolgt 30 Minuten mit 1700 g bei 23°C. Die Zellen, die sich zwischen der unteren (Ficoll-Isopaque) und der oberen (verdünntes Plasma) Phase befinden, werden abpipettiert. Die Zellen werden danach mit dem 10-fachen Vo­ lumen physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. Das Gemisch wird 10 Minuten mit 700 g bei Zimmertemperatur zentrifugiert und der Überstand verworfen.

Das Zellsediment wird zweimal in je 10 ml physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert und wie oben zentrifugiert. Das Zellsediment wird in DMEM + fötales Kälberserum + Zu­ sätze (siehe Beispiel 3) aufgenommen und auf eine Konzentra­ tion von 500 000 Zellen/ml eingestellt.

Pro Loch werden 0,2 ml Zellsuspension in Mikrotiterplatten (Typ Flachboden) eingefüllt (100 000 PBL pro Loch). 10, 5, 2,5, 0 µg pro Loch der A.h.-Extraktlösungen werden zugegeben. Die Mikrotiterplatten mit den Zellkulturen werden 4 Tage im begasten Brutschrank (37°C, 10% CO₂, 98% rel. Luftfeuchte) inkubiert.

Die Kulturen werden 10 Minuten mit 700 g bei Zimmertempera­ tur zentrifugiert und die Überstände verworfen.

Die Zellsedimente werden mit je 200 µl Kulturmedium + Zu­ sätze + 0,2 µCi ³H-Thymidin versetzt.

Nach 24 Stunden weiterer Inkubation im begasten Brutschrank werden die Zellen geerntet und die Radioaktivität in der zellulären DNS bestimmt, wie in Beispiel 3 angegeben.

Beispiel 11 Direkte antivirale Aktivität gegen Vesikular Stomatitis Vi­ rus (VSV)

0,5 ml VSV mit einem Titer von 2×10 infektiösen Parti­ keln/ml werden mit 2,5 µg A.h.-Extrakt in Hepes gepuffertem DMEM 1 Stunde bei 23°C inkubiert. Dieser Ansatz mit der ent­ sprechenden Kontrolle ohne A.h.-Extrakt wird in Log-Schrit­ ten mit DMEM verdünnt (1 : 2, 1 : 4, 1 : 8, 1 : 16 usw.). Je 10 µl dieser Verdünnungen werden zu Kulturen von L929-Fibroblasten in Mikrotiterplatten (5×10⁴-Zellen/Loch) zugegeben. Nach 48 Stunden Inkubation bei 37°C, 10% CO₂ und 98% Luftfeuch­ tigkeit wird der zytopatische Effekt abgelesen. In Fig. 1 sind die niedrigsten Verdünnungen angegeben, die negativ sind.

Beispiel 12 Direkte antivirale Aktivität gegen MHV3

0,5 ml MHV3-Virussuspension mit einem Titer von 2,5×10³ infektiösen Partikeln/ml werden mit verschiedenen Mengen A.h.-Extrakt laut Tabelle IV in mit Hepes gepuffertem DMEM 1 Stunde bei 23°C inkubiert. 10 µl des jeweiligen Ansatzes werden zu L929-Kulturen in Mikrotiterplatten gegeben und 24 Stunden inkubiert (Zellzahl: 5×10⁴/Loch, Inkubationsbedin­ gungen: 37°C, 10% CO₂, 98% Luftfeuchtigkeit). Die entstan­ denen Plaques werden aus 8 Parallelkulturen mikroskopisch ermittelt.

Tabelle IV

Beispiel 13 Direkte antiretrovirale Aktivität gegen HIV

Zellen der T-Zellinie MT4 werden mit HIV-1 (Titerverdünnung 1 : 200) mit oder ohne A.h.-Extraktverdünnung (10 µl/Loch) in einer Mikrotiterplatte infiziert.

Es wird die Verdünnung von A.h.-Extrakt, bis zu der HIV-1 neutralisiert wird, festgestellt.

Claims (23)

1. Extrakt der Pflanze Acanthospermum hispidum, enthaltend ihre löslichen Bestandteile mit einem Molekulargewicht < 2000.

2. Extrakt der Pflanze Acanthospermun hispidum, enthaltend ihre löslichen Bestandteile mit einem Molekulargewicht < 2000 zur Verwendung als Arzneimittel.

3. Extrakt nach Anspruch 2 zur Verwendung als Im­ munmodulator.

4. Extrakt nach Anspruch 2 zur Verwendung als antitumorales Agens.

5. Extrakt nach Anspruch 2 zur Verwendung bei der Behebung von Strahlenschäden.

6. Extrakt nach Anspruch 2 zur Verwendung bei der Prophy­ laxe und Therapie von Viruserkrankungen bei Säugern.

7. Extrakt nach Anspruch 2 zur Verwendung bei der Prophy­ laxe und Therapie von Retroviruserkrankungen bei Säu­ gern.

8. Verwendung von Extrakten der Pflanze Acanthospermum hispidum als Immunmodulator.

9. Verwendung von Extrakten der Pflanze Acanthospermum hispidum als antitumorales Agens.

10. Verwendung von Extrakten der Pflanze Acanthospermun hispidum zur Behebung von Strahlenschäden.

11. Verwendung von Extrakten der Pflanze Acanthospermum hispidum zur Prophylaxe und Therapie von Viruserkrankun­ gen bei Säugern.

12. Verwendung von Extrakten der Pflanze Acanthospermum hispidum zur Prophylaxe und Therapie von Retroviruser­ krankungen bei Säugern.

13. Verfahren zur Herstellung des Extrakts nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Teile der Pflanze Acan­ thospermum hispidum mit Wasser extrahiert und an­ schließend aus dem Extrakt die Inhaltsstoffe mit einem Molekulargewicht < 2000 abtrennt.

14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man grüne Blätter der Pflanze zur Extraktion einsetzt.

15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man getrocknete Blätter der Pflanze zur Extraktion ein­ setzt.

16. Verfahren nach Anspruch 11 bis 13, dadurch gekennzeich­ net, daß man die Extraktion bei einer Temperatur von 4°C bis 100°C durchführt.

17. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung der Bestandteile mit einem Molekular­ gewicht < 2000 aus dem Extrakt durch eine Dialyse be­ wirkt.

18. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung der Bestandteile mit einem Molekular­ gewicht < 2000 aus dem Extrakt durch eine Ammoniumsul­ fatfällung bewirkt.

19. Verfahren zur Stimulation einer Immunmodulation, dadurch gekennzeichnet, daß man einem eine derartige Behandlung benötigenden Patienten eine immunmodulatorisch wirkende Menge eines Extraktes der Pflanze Acanthospermum hispi­ dum gemäß Anspruch 1 verabreicht.

20. Verfahren zur Stimulation einer antitumoralen Antwort, dadurch gekennzeichnet, daß man einem eine derartige Be­ handlung benötigenden Patienten eine antitumoral wir­ kende Menge eines Extraktes der Pflanze Acanthospermum hispidum gemäß Anspruch 1 verabreicht.

21. Verfahren zur Behebung von Strahlenschäden, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man einem eine derartige Behandlung benötigenden Patienten eine Strahlenschäden behebende Menge eines Extrakts der Pflanze Acanthospermum hispidum gemäß Anspruch 1 verabreicht.

22. Verfahren zur Prophylaxe und Therapie von Viruserkran­ kungen bei Säugern, dadurch gekennzeichnet, daß man einem eine derartige Behandlung benötigenden Patienten eine antiviral aktive Menge eines Extrakts der Pflanze Acanthospermum hispidum gemäß Anspruch 1 verabreicht.

23. Verfahren zur Prophylaxe und Therapie von Retroviruser­ krankungen bei Säugern, dadurch gekennzeichnet, daß man einem eine derartige Behandlung benötigenden Patienten eine antiretroviral aktive Menge eines Extrakts der Pflanze Acanthospermum hispidum gemäß Anspruch 1 verab­ reicht.