JPH04500820A - 植物アカンソスペルマム・ヒスピダムの抽出物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 植物アカンシスベルマム？ヒスピダムの抽出物本発明は、分子量＞２，０００の 水溶性成分を含有する植物アカンソスベルマム・ヒスピダム（Ａｃａｎｔｈｏｓ ｐｅｒｍｕｍ　ｈｉｓｐｉｄｕｍ）の抽出物に関する。

本発明はまた、アカンソスベルマム・ヒスビダム抽出物の医薬としての使用に関 する。さらに、本発明は哺乳動物の免疫調整（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｅ、 免疫状態に影響を与える）、放射線宿酔の治療、および哺乳動物におけるウィル スおよびレトロウィルス疾患の予防と治療および膿瘍の治療への該アカンソスペ ルマム・ヒスビダス植物抽出物の使用に関する。

さらには、本発明はアカンソスペルマムーヒスピダムＭ’ｆｌＪの一部の抽出物 を調製し、それを分子量に基づいて成分分離するための方法に関する。

アカンソスペルマム・ヒスビダス（キク科植物（ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ））は、 世界中の熱帯地方に広まっている、南アメリカ原産の植物である。

西アフリカの原住民は黄痘の処置に有用なお茶（抽出物）を調製するために伝統 的な薬としてアカンソスペルマム・ヒスピタム（Ａ、ｈ、）を使用している。さ らに、Ａ、ｈ、は、その葉の汁（ジュース）を患部領域に塗布し、口唇ヘルペス （口唇庖疹）の処置に使用される。

口唇ヘルペスの処置におけるこの抽出物（およびその葉汁）の治療効果は以下の ようである：適用後１から３時間以内で痛みが消散し、治癒工程が２−３日に減 少し、再発間隔を延長させる。この天然療法は、症状の発現後数時間以内に適用 すれば、通常は損傷の形成が完全に抑えられる。この抽出物は陰部ヘルペスに対 しても有効である。

Ａ、ｈ、の成分リストはＶ　、　Ｈ、Ｈｅｙｗｏｏｄ、　Ｊ　、　Ｂ　、　Ｈａ ｒｂｏｒｎｅおよびＢ。

Ｌ　、　Ｔ　ｕｒｎｅｒ（編）のモノグラフ「キク科の生物学および化学」、ア カデミツク・プレス、ロンドン、二ニーヨーク、サンフランシスコ、１９７７か ら入手することができる。ベルリンのＦ　、　Ｂ　ｏｈ１ｍａｎｎグループによ ってＡ、ｈ、からメランボリデス（ｍｅｌａｍｐｏｌ　１ｄｅｓ）、ガラクトシ ド類、アセチレン類が単離され、それらの化学構造が明らかにされた［Ｐｈｙｔ ｏｃｈｅ＋＊１ｓｔｒｙ、　１９７９．１８巻、　６２５−６３０頁、Ｐｌａｎ ｔａ　Ｍｅｄｉｃａ、　１９８６゜１５４−１５５頁、ＰｈｙｔｏｃｈｅＩＩｌ ｉｓｔｒｙ、　１９７６、１５巻、　１７７６−１７７８頁］。この植物の必須 油が研究され、それらの微生物および抗真菌作用が見いだされた［Ｓ、Ｒ，Ｊａ ｉｎらのＰｌａｎｔａ　Ｍｅｄｉｃａ、　１９７２．２２巻、１３６頁、および Ｓ、Ｒ。

ＪａｉｎおよびＡ、ＫａｒのＰｌａｎｔａ　Ｍｅｄｉｃａ、　１９７１．２０巻 、１１８頁コ。Ｂ、ＡＩｉおよび１．Ａｄａｍによって、Ａ、ｈ、を食用植物と して使用するためにヤギおよびマウスにおいて毒物学的研究が行われた［Ｊ、　 Ｃｏｍｐ、　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、　１９７８．８８巻、　４４３−４４８頁お よび５３３−５４４頁コ。

しかし、アカンソスペルマム・ヒスピダムまたはその植物の抽出物はそのある種 の成分に毒性があるために経口投与することができず、それほど広範には使用さ れていない。

したがって、本発明の目的は、非毒性かつ治療学的に活性なアカンソスベルマム ・ヒスピダム調製物を提供することにある。この目的は、アカンソスペルマム・ ヒスピダム抽出物から低分子量成分を除去すると、抽出物の毒性作用が消失され るという驚くべき知見に基づき達成された。

このように、本発明は、分子量２．　ＯＯ０以上の可溶性成分を含有するアカン ソスペルマム・ヒスビダム植物の抽出物を提供するものである。

本発明はさらに、放射線宿酔の治療、哺乳動物のウィルス疾患またはレトロウィ ルス疾患の予防および治療および腫瘍の治療における医薬、特に免疫調整物質と して使用できる上記アカンソスベルマム・ヒスピダム植物の抽出物を提供する。

本発明の抽出物は水性のアカンソスペルマム・ヒスピダム抽出物であることが好 ましい。しかし、エタノール、クロロホルム、インプロパツール、ガソリンなど の他の抽出用剤も使用される。本明細書では、水性抽出物を取り上げて解説、例 示する。「水性抽出物」なる用語は、実質的に水性の抽出物、すなわち少量の非 −水性溶媒、例えば容量１０％、好ましくは５％を越えることのない非−水性溶 媒、または水溶性化合物、例えば塩、グルコースなどの糖もしくはアスコルビン 酸などの酸が実質的に抽出物の水性に影響を与えない限りはそれらを含有してい てもよい水性抽出物を意味する。

抽出物を得るには、新鮮なまたは乾燥したアカンソスペルマム・ヒスピダムの葉 を水（これは要すれば上記の添加物を含有していてもよい）に懸濁し、温度４° Ｃから１００℃の間、好ましくは室温でホモジナイズ（均質に）する。始めに、 遠心および濾過などの方法によって不溶性成分を分離する。それぞれ上清および 濾液を凍結乾燥し、揮発性物質をその抽出物から除去する。

次いで、得られた産物を蒸留水に溶解し、遠心して不溶性成分を除去し、低分子 量成分を除去する処置に付す。１００．０ＯＯＧの遠心１時間、およびリン酸緩 衝化食塩水（Ｐ’Ｂ　Ｓ　）に対する透析が好ましい。別の態様では、低分子量 成分を硫酸アンモニウム沈澱によって分離する。これらの工程により、分子量２ ．　ＯＯＯ以下の成分が抽出物から除去される。以下で説明する生物学的活性が 巨大分子の画分中に含有されている。

得られた抽出物をトリプシン、キモトリプシン、プロナーゼ、アミログルコシダ ーゼまたはＤＮＡアーゼで酵素処置してもその活性は変化しない。その活性は熱 （１００℃、５分）によって破壊されないが、酸性加水分解または過ヨウ素酸酸 化によって破壊される。アミノ酸部分は非常に僅かであり、約０．２％である。

以下の糖が抽出物中に含有されている：ラムノース、フコース、リボース、□ア ラビノース、キシロース、マンノース、グルコース、オヨヒカラクトース。

本発明の水性抽出物（以下、ｒ　Ａ　、　ｈ、抽出物」という）は以下に記載の 多くの生物学的活性を示す： １、直接的抗ウィルスおよび抗レトロウイルス活性；これはＶＳＶ（水痘性口内 炎ウィルス）、ＭＨＶ３（マウス３型肝炎ウイルス）、およびＨＩＶ（ヒト免疫 不全ウィルス）で証明された。

ＶＳＶおよびＨＩＶをＡ、ｈ、抽出物と共にインキユベートした後、それぞれマ ウス線維芽細胞培養物（ＶＳＶ）およびＭＴ４細胞（ＨＴＶ）で力価測定し、Ａ 、ｈ、抽出物のウィルス中和効果を測定した。

これらの検定結果により、高度に希釈したＡ、ｈ、抽出物を使用したときでさえ 、ウィルス中和が持続することが判明した。

Ａ、ｈ、抽出物を感染症の患者の処置に使用できるか否かを、マウスをＭＨＶ３ で感染させ、種々の投与量のＡ、ｈ、抽出物を皮下または経口的に投与すること で試験した。同様に感染しているがＡ、ｈ、抽出物を与丸なかった対照マウスと の比較により、５日間にわたるＡ、ｈ、抽出物の投与後に相当の生存率の増加が 認められた。

２　哺乳動物の免疫状態に対するポジティブな作用。

これはＡ、ｈ、抽出物を投与することによりヒトおよびマウス細胞培養物で示さ れた。

ウィルスの中和作用に加えて、免疫状態に対するポジティブな作用も観察された 。これも種々の系で検定を行った。

Ｂ−リンパ球の増殖を誘導することができるか否かを調べるため、マウス肺臓細 胞（ＣＢＦ）を種々の量のＡｈ、と共にインキュヘートシた。肺臓細胞の増殖性 は’Ｈ−チミジンまたはアルカリホスファターゼを使用して測定した。

５日後にその膵臓細胞培養物の上清におけるｒｇＭｆｉ度を測定することにより 、マウス膵臓細胞培養物でＩｇＭの合成を刺激することが証明された。もう１つ の検定として、マウス骨髄マクロファージ（ＫＭＭ）を使用し、酸素ラジカル産 生の刺激性および成熟骨髄マクロファージの増殖誘導性を測定した。同様の検定 を行い、ヒト顆粒球における酸素ラジカル産生の刺激、および末梢ヒトリンパ球 の増殖誘導を行った。これらすべての場合に、細胞培養物に対するＡｈ、抽出物 の明瞭な刺激および誘導作用が認められた。

マウス骨髄マクロファージにおいてインターフェロン生成の誘導を同定すること ができた。この目的で、骨髄マクロファージを種々の希釈度のＡ、ｈ、抽出物と 共に１時間インキュベートし、洗浄後、Ａ、ｈ、抽出物なしでさらに２４時間培 養した。ウィルスの中和に基づいて、これら培養物の上清中にインターフェロン が検出された。この系はマウス口内炎ウィルスであった。

３、放射線宿酔の治療； これは、ソフトなＸ線供給源によって照射したマウス骨髄マクロファージにおい て行った。色の減少度により、Ａ、ｈ、抽出物で処理した細胞は非処理の細胞よ りも明瞭に生存率が増加していると決定された。

４、腫瘍−治療活性； コレは、マウスＭｅｔｈＡ−線維肉腫に対する効果として示された。

Ａ、ｈ抽出物の作用の検定により、マウスの特異的および非特異的な両保護メカ ニズムが刺激されることが認められたので、Ａ、ｈ、抽出物が腫瘍−治療モデル としてのインビボ試験で成功を収めたことから、驚くことにＡ、ｈ、抽出物が非 常に強い抗腫瘍効果を有していることか判明した。この試験モデルはメチルコラ ンスレン誘導化された移植できるマウス線維肉腫である（Ｌ、　Ｏｌｄ［米国、 ニューヨークの５ｌｏａｎ　Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ］によって誘発されたＭｅｔｈＡ−線維肉腫） である。

この目的のため、規定された少量の腫瘍細胞を、遺伝学的にこの線維肉循と適合 する同系交配マウスの中央腹部に皮肉注射した。この腫瘍はすべてのマウスにお いて不均一な比較的急速な発育を示し、治療しなければ５週間以内で死に至らし める。

腫瘍の大きさを測定することは、その腫瘍が皮膚の真下に増殖するので外側から 容易に測定でき、したがって簡単にできる。

この検定では、ＣＢＦ　１マウスの刈り取った腹部中央にＭｅｔｈＡ−線維肉腫 細胞を皮肉注射した。腫瘍の移植後３．５および７日目に、Ａ、ｈ、抽出物をそ けいリンパ節の近傍に皮下注射した。腫瘍の挿入後７．１４．２１および２８８ 日目その直径を測定し、腫瘍の大きさくｔｕｍｏｒ　ｍａｓｓ）を計算した。こ の検定の終了時点では、治癒した動物の数を決定した。

Ａ、ｈ、抽出物での治療は第１に腫瘍の発育を遅らせ、次に腫瘍塊を萎縮させ、 結果として大部分の動物では腫瘍が死滅（ｓｈｅａｄｉｎｇ）される。Ａ、ｈ、 抽出物によって１００％までの回復率が達成され、すなわちすべての処置動物が 治癒された。この治癒された動物では、数カ月に及ぶ観察でも再発が認められな かった。

特に興味深いことは、腫瘍の死滅が、治療が既に終了した時点で起こることであ る。これは、Ａ、ｈ、抽出物が長期持続型の治療効果を有していることを示すも のである。

添付図面の説明 第１図：　Ｌ９２９線維芽細胞（フィブロブラスト）によってマウスＶＳｖに対 するＡ、ｈ、抽出物の抗ウィルス活性を示しているグラフである。各ドｙ）はＡ 、ｈ、抽出物を含有する、または含有しない個々の培養物についての力価を示し ている。

第２図：ＭＴ４細胞において測定した、ＨＩＶに対するＡ、ｈ、抽出物の抗レト ロウイルス活性を示している。Ｈ！ウィルスは１：４００の希釈度までのＡ、ｈ 、抽出物によって中和されている。

第３図：マウスＣＢＦ胛臓細胞のＢ−１）ンバ球の増殖誘導を示している。ｓＨ −チミジンまたはアルカリホスファターゼによって増殖性を測定した。

第４図：マウス骨髄マクロファージの刺激性を示している。測定は、短命な酸素 ラジカルを光りパルスに変換することによって行う。

酸素ラジカルはルシゲニンまたはルミノールによって受容される。

第５図：３Ｈ−チミジン挿入により測定した、成熟マウス骨髄マクロファージの 増殖誘導を示している。

第６図：マウス骨髄マクロファージにおける放射線宿酔の治療を示している。Ｍ ＴＴ［臭化３−（４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル）−３，５−ジフェ ニルテトラゾリウム］の還元に基づく光度測定（５７０ｎｍ）によって生存性試 験を行う。ソフトなＸ線供給源（６０ｋＶ。

２５＋ｎＡ）を使用し、骨髄マクロファージを種々の線量で照射する。

照射１時間後、Ａ、ｈ、抽出物を加える。Ａ、ｈ、抽出物を含有する培養物およ びＡ、ｈ、を含有しない対照を種々の培養時間で培養した後、細胞をＭＴＴ溶液 （５ｇｇ／Ｍ１２）　１０ｇｇと混合し、消光データを測定する。

第７図：マウスＭｅｔｈＡ−線維肉腫に対するＡ、ｈ、抽出物の腫瘍−治療活性 を示している。腫瘍を挿入し、Ａ、ｈ、抽出物を挿入した後７．１４．２１およ び２８日日月、誘導された腫瘍の大きさを測定する。右側の欄には、治癒された 動物の数と検定した全動物の数とを示している。

第８図：ヒト顆粒球における酸素ラジカル産生の刺激性を示している。測定法は 第４図の方法と同様である。

第９図：Ａ、ｈ、抽出物の投与後におけるヒト末梢リンパ球の増殖誘導を示して いる。３Ｈ−チミジンの挿入度を測定した。

以下に実施例を記載し、本発明を説明する。

実施例１ 新鮮な菓から調製するアカンソスペルマム・ヒスピダム抽出物（ａ）摘み取った ばかりのアカンソスペルマム・ヒスピダムの葉１眩を蒸留水５す７）ルで２回洗 浄する。水きりした葉を蒸留水１リツトルと混合し、ホモジナイザ−［例えば、 ワーリング・ブレンダー（Ｗａｒｒｉｎｇ　Ｂｌｅｍｄｏｒ）］に注加し、葉部 分がＩｘｘ’よりも小さくなるまでホモジナイズする。この工程での調製物の温 度は通常３０℃を越えないようにすべきである。

得られた葉の髄質（パルプ）を６，０ＯＯＧで２０分間遠心する。

上清をワットマン・フィルター１番で濾過し、凍結乾燥する。

収量は約３０ｇである。この粗製の抽出物は、以後使用するまで４℃で乾燥した 場所に保存することができる。

（ｂ）粗製の抽出物６ｇを蒸留水３００ｘ（ｌと混合し、濁った溶液とする。こ の混合物を４°Ｃにおいて１時間１００．０ＯＯＧで超遠心する。次いで、得ら れた上清を蒸留水４×１０リツトルに対して４℃で１２時間透析する。透析した 抽出物を一２０℃で急速冷凍、または凍結乾燥する。収量は約１．２ｇである。

（ｃ）硫酸アンモニウム沈澱するため、硫酸アンモニウム（終濃度ＩＭＮ３．２ ４ｇを定速撹拌下に０℃において、透析した抽出物１００ｘ（ｌにゆっくりと加 える。２５％アンモニア溶液を使用することにより、ｐＨを７．２に調節する。

０℃でさらに３０分間撹拌を続け、沈澱させる。次いで、得られた混合物を３， ０ＯＯＧで１ｏ分間（４’Ｃ）遠心する。上清（ＩＭ）を保存し、洗浄用の１Ｍ 硫酸アンモニウム溶液１０ｚＱに沈澱物を再懸濁する。得られた混合物を再び３ ，０００Ｇで１０分間（４°Ｃ）遠心し、洗浄液から上清を捨てる。沈澱物ＩＭ を蒸留水３０ｘ（ｌに溶解する。上清ＩＭに、定速撹拌下に０°Ｃで硫酸アンモ ニウム１３．２４ｇを加える（終濃度２Ｍ）。２５％アンモニア溶液を使用する ことによりｐＨを７．２に調節し、ｏ′ｃで３０分間沈澱を続行する。この混合 物を３，０ＯＯＧで１０分間（４°Ｃ）遠心する。上清２Ｍを保存する。沈澱物 ２Ｍを２Ｍ硫酸アンモニウム溶液５１（！に再懸濁し、再び３，０ＯＯＧＩＯ分 間の遠心（４℃）にかける。洗浄液から上清を捨てる。

沈澱物２Ｍを蒸留水２０ｙＱに溶解する。沈澱物ＩＭ、沈澱物２Ｍおよび上清２ Ｍをそれぞれ蒸留水１０リツトルに対して４回１２時間透析しく０’Ｃ）、得ら れた透析物を凍結乾燥する。収量：沈＃物ＩＭ約２００ｒｇ、沈澱物２Ｍ約５０ ｘｇ、上清２Ｍ約９５ＪＩｇ。

アカンソスペルマム・ヒスピダム抽出物の乾燥葉からの調製風乾した葉２００ｇ を切断用ミルによって粉砕する。膨潤させるため、粉砕した葉を蒸留水１リツト ルと混合し、４℃で１８時間撹拌する。その混合物をホモジナイザー［例えば、 Ｗａｒｒｉｒ＋ｇ　Ｂｌｅｎｄｏｒ］によって３×６０秒間ホモジナイズする。

得られた混合物を水浴中で１０分間１００°Ｃに加熱する。次いで、実施例１の ようにして遠心し、凍結乾燥する。さらに実施例Ｉの（ｂンおよび（ｃン項に記 載する工程も行う。粗製の抽出物の収量は約３．５ｇであり、透析した抽出物で は０．７５　ｇ、沈澱物ＩＭでは約５ｍｇ、沈澱物２Ｍでは約５５ｘｇ、上清２ Ｍでは約８５ｘｇである。

実施例３ Ａ、ｈ抽出物の存在下におけるマウス肺臓細胞の増殖肺臓細胞を同系交配マウス （例えば、ＣＢＦ　１、Ｃ３ＨＳＢａｌｂ／ｃ）から無菌条件下に取り出す。ル ーズ・ボッター・ホモジナイザー（Ｊｏｏｓｅ　ｐｏｔｔｅｒ　ｈｏｍｏｇｅｎ ｉｚｅｒ）を使用して細胞懸濁液を調製する。遠心（７００Ｇ、５分、４°Ｃ） 後、肺臓細胞を組織培養培地（ＤＭＥＭ）中に再＠濁する。この培地は以下の添 加物を含有している：ｌｏ％ウシ胎仔血清、５０ｇＭ２−メルカプトエタノール 、１”１２当たりストレプトマイシン５μｇ１および１ｘＱ当たりペニシリン１ ００１゜Ｅ、。

細胞濃度を５．○Ｏ０，０００／ｘ（ｌに調節する。マイクロタイタープレート （平底タイプ）の各ホールに細胞懸濁液０．２ｘ（ｌを注く。

次いで、種々のＡ、ｈ、抽出物溶液（濾過により滅菌）１０μＱをそれぞれ加え る。細胞培養物を含有するマイクロタイタープレートをガス充満インキュベート −［ｇａｓｓｅｄ　１ｎｃｕｂａｔｏｒ］（３７°Ｃ，１０％二酸化炭素、９８ ％ＲＨ）中で検定ｍ製法に応じた種々の時間間隔でインキュベートする。同様の 培養物を調製し、別の日のＢ−細胞増殖性を測定する。これは、３Ｈ−チミジン を加えた後の採取工程によって培養物が破壊されるので必須である。細胞の増殖 性を測定するため、マイクロタイタープレートを室温、７００Ｇで１０分間遠心 する。細胞沈澱物を新たな培養培地（上記の添加物を加えている）２００μｇお よび０．２μＣ１３Ｈ−チミジンとそれぞれ混合する。

ガス充満インキュベーター中でさらに６時間インキュベートした後、市販の捕集 器（例えば、Ｓ　ｋａｔｒｏｎ　ｃｅｌｌ　ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）を用いて細胞 を採取する。市販のβ−シンチレーションカウンターを用いて細胞ＤＮＡの放射 活性を測定する。

以下の第１表は実施例３の実験結果を示している。増殖性を測定する前の４日間 、細胞をインキュベートする。増殖性は対照に対する％として表す。括弧内の数 字は対照での１分当たりの３Ｈ−パルスを示す。Ａｈ、抽出物１０μｇを各培養 物に加えた。

第１表 抽出物：　対照　透析後　ＩＭ　２Ｍ ％　１００（５，７３０）　３７０　５２ｇ　２３７実施例４ ８？！臓細胞培養物におけるＡｈ、抽出物によるＩｇＭ合成の刺激性インビトロ で主として合成されるのはクラスＭ（ＩｇＭ）の免疫グロブリンであるので、こ のクラスの抗体を測定する。実施例３に記載のようにしてマイクロタイタープレ ート上で培養物を調製する。

インキユベート（３７℃、１０％二酸化炭素、９８％ＲＨ）の５日後、７００Ｇ ５分間の遠心を室温で行う。

得られた各上清１００μｇを取り出し、ＥＬＩＳＡマウスＩｇＭ検定のために前 処理しておいた新しいマイクロタイタープレート上に置く。この指示薬は、アル カリホスファターゼとカップリングさせておいた抗マウスＩｇＧ（ヤギ）抗血清 である。抗体量を以下の第２表にμｇ　／ｘＱ単位で示す。

第２表 Ａ、ｈ、（μｇ）　５　２．５　１．２５　０．６２５（透析後） ＩｇＭ（μｇ／村）　２，４　１７．０　１２．５　７．８　５．３Ｍｅｔｃａ ｌｆの方法にしたがってマウスマクロファージをインビトロで増殖させた。この 目的のため、マウス大腿骨から骨髄細胞を単離し、セルライン上９２９由来の３ ０％線維芽細胞培養土清および５％ウマ血清を含有する培養培地（ＤＭＥＭ）中 で培養する。これらの添加物により、親細胞が増殖でき、マクロファージが専門 的に分化スル。１０日間インキュベートした後では、これらの培養物には、それ 以上は増殖を示さない純粋なマクロファージしか含有されていない。Ａ、ｈ、抽 出物を添加することにより、驚くことに、脱分化が起こらずに新たに分裂し始め る。この増殖性は以下のようにして測定する： ２０、　ＯＯ０個のマクロファージを培養培地（実施例３）２００μｅと混合し 、マイクロタイタープレートの各ホールに注ぎ入れる。

そこに種々のＡ、ｈ、抽出物をそれぞれ１０μｅ加える。ガス充満インキニベー ター中で、その混合物を４日間インキュベーター、次いで室温で遠心する（７０ ０Ｇ１５分）。要すれば、インターフェロン測定用に上清を保存する。培養培地 ２００μＣおよび０．２μＣ１５Ｈ−チミジン２００μＣそれぞれを細胞にピペ ットで加える。次いで、ガス充満インキニベーター中でさらに２４時間インキュ ベートする。この培養物を含有するマイクロタイタープレートを一２０℃で凍結 し、培養フラスコに付着したマクロファージを取り出し、解凍し、細胞ＤＮＡの 放射活性を実施例３のようにして測定する。

実施例６ マウス骨Ｕマクロファージ培養物におけるＡ、ｈ、抽出物によるインターフェロ ン誘導の測定 １００．０００マクロフアージを培養培地（ＤＭＥＭ、；実施例３）２００μｅ と混合し、マイクロタイタープレートの各ホールに注ぎ入れる。

種々の希釈度のＡ、ｈ、を使用し、混合物を１時間インキュベートする。細胞を 培養培地で１回洗浄し、Ａ、ｈ、抽出物の不存在下にさらに２４時間培養する。

次いで、得られた上清をビペ・ノドにより取り出し、インターフェロン測定する 。

インターフェロン測定は、マウスの水痘性口内炎ウィルスの中和に基づいている 。そのウィルスはマウスの線維芽細胞（セルラインＬ９２９）に感染し、ウィル ス増殖および分泌によってそれらの細胞を破壊することができる。この細胞変性 効果は顕微鏡下に観察することができる。

この目的のため、Ｌ９２９細胞２０，０００個をマイクロタイタープレートの培 養培地１００．ｃｌ中に接種する。マクロファージ培養上清１００μ１１または 対照として、Ａ、ｈ、抽出物（培地１００μｇに希釈）を加える。

マイクロタイタープレートをガス充満インキニベーター中で２４時間インキュベ ートする（３７℃、１０％二酸化炭素、９８％ＲＨ）。

水痘性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）１０μｍ２（７，０００インタ一フエロン単位 に相当する）を各ホールに加える。次いで、そのガス充満インキュベーター中で さらに４８時間インキュベートする。

培養物中における細胞の破壊（細胞変性効果）またはインターフェロンによる阻 害可能性を顕微鏡下に観察する。

以下の第３表には、この実験結果を示している。負の記号は細胞破壊（細胞変性 効果）を、正の記号はインターフェロンの存在による阻害をそれぞれ示している 。

第３表 Ａ、ｈ抽出物＜ｕｇ／培養物’）　−２０１０５２１０，５マウス骨髄マクロフ アージにおける酸素ラジカル産生の刺激Ｍｅｔｃａｌｆ’法に従って、マウス骨 髄由来のマクロファージをテフロン・バッグ内て増殖させる（実施例５を参照の こと）。非常に短命な酸素ラジカルを光りパルスに変換して測定する。この目的 のため、　−酸素ラジカルの受容体として役立つルンゲニンまたはルミノールな との物質を使用する。酸化反応の結果、フォトンが形成されるので、それを市販 の装置［Ｂ　ｅｒｔｈｏｌｄによって製造されているＢ　ｉｏｌｕｍａｔ］によ って測定する。この検定調製物は以下のように製造される：２００、　ＯＯＯｆ 髄ママクロファージフェノールレノドおよび重炭酸す）　ＩＪウムの不存在下、 緩衝液として５０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓを含有するＤＭＥＭ　０．２ｘＱ中で１時 間インキュベートする（３７８Ｃ）。ＤＭＥＭｏ、２＊Ｑ、ルンゲニン溶液（１ １，６μｍｏｌ）　ｌ　ＯｕＱおよび相当するＡ、ｂ、希釈物（１ｘｇ　／ｘ６ ）を加えた後、測定する。

マウスｔＵマクロファージをソフトなＸ線供給源（６０ＫＶ、２５ｍＡ）で照射 する。ＭＴＴ［臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−３，５− ジフェニルテトラゾリウム］の還元によって、細胞の生存性を測定する。各ホー ル中、１００．ＯＯＯＫＭＭをインキュベートする。

Ａ、ｈ、抽出物を照射１時間後に加える。種々の培養時間の後、細胞をＭＴＴ溶 液（５＋１ｇ／ＲＱ）　１０　ｕ（ｌと混合し、３７９Ｃｔ’４時間インキュベ ートした後、得られたプレートを遠心し、培養培地を除去し、インプロパノ−ル ー０．０４Ｍ塩酸１００μａ中にテトラゾリウム・ブルー結晶を溶解する。

マイクロタイター分光器により５７０ｎｍの色を判読する。

ＣＢＦ　１マウスの毛を刈り取った中央腹部に５０．　ＯＯＯＭｅｔｈＡ−線維 肉腫細胞を皮肉注射する。腫瘍の移植後３．５および７日目に、Ａ、ｈ抽出物ｌ ａｇをそけいリンパ節の近傍に皮下注射する。

腫瘍の挿入後７．１４．２１および２８８日目、それら腫瘍の直径を測定する。

腫瘍は全体として丸形に発育しないので、スライドゲージを使用し、最も短い直 径および最も長い直径を測定する。その腫瘍の大きさは以下の等式によって計算 される：これは楕円体積の半分に相当する。

実施例１０ Ａ、ｈ、抽出物によるヒト末梢血リンパ球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）の増殖誘導ヘパリン処 理した全血（５１，Ｅ、ヘパリン／Ｍρ）２０酎を生理学的食塩水６０戻ρで希 釈する。

Ｆ　１ｃｏｌｌ　Ｉ　５ｏｐａｑｕｅｔ＠液（密度１．１７）：ｚｃを遠心管に 注加し、上記希釈血液５ｚＣで覆う。

１．７００Ｇで３０分間遠心する（２３°Ｃ）。上部相（Ｆ　１ｃｏｌｌ　Ｉ　 ｓ。

ｐａｑｕｅ）および上部相（希釈した血漿）間に見い出される細胞をビベ。

トで取り出す。次いで、細胞を１０倍容量の生理学的食塩水で希釈する。この混 合物を室温、７００Ｇで１０分間遠心し、上清を捨てる。

得られた細胞沈澱物を生理学的食塩水１０村に２回再懸濁し、上記のようにして 遠心する。得られた細胞懸濁物をＤＭＥＭ＋ウン胎仔血清＋添加物（実施例３を 参照）と混合し、濃度５００．　ＯＯＯ細胞／ＩＩρに調節する。

マイクロタイタープレート（平底タイプ）の各ホールにこの細胞懸濁液０．２３ ！＋２（各ホール当たり１００，０ＯＯＰＢＬ）を充満させる。

それらホールにＡ、ｈ、抽出物溶液１０．５．２．５、Ｏμｇを加える。細胞培 養物を含有するマイクロタイタープレートをガス充満インキュベーター（３７℃ 、１０％二酸化炭素、９８％ＲＨ）中で４日間インキュベートする。

その培養物を室温、７００Ｇで１０分間遠心し、上清を捨てる。

得られた沈澱物を培養培地＋添加物＋０．２μＣｉ’Ｈ−チミジン（２００μｍ ２）とそれぞれ混合する。

ガス充満インキュベーター中でさらに２４時間インキュベートした後、細胞を採 取し、その細胞ＤＮＡの放射活性を実施例３に記載のようにして測定する。

２Ｘ１０感染粒子／村の力価を有するＶＳＶｏ、５ｘ１２をＨｅｐｅｓ緩衝化Ｄ ＭＥＭ中でＡ、ｈ、抽出物２．５μｇと共に２３℃で１時間インキュベートする 。この調製物およびＡ、ｈ、抽出物を含有しないそれに相当する対照をＤＭＥＭ で対数関数的に希釈する（１：２．１：４、に８．１：１６など）。それぞれの 希釈物１０μｇを、マイクロタイタープレート上のＬ９２９線維芽細胞（５Ｘ１ ０’細胞／ホール）の培養物に加える。３７℃、１０％二酸化炭素、９８％湿度 のインキュベート条件下で４８時間インキュベートした後、細胞変性効果を判読 する。第１図にはネガティブな最も低い希釈度を示している。

実施例１２ ＭＨＶ３に対する直接抗ウィルス活性 ２．５Ｘ１０３感染粒子／ｆｆ１２の力価を有するＭＨＶ３ウィルス懸濁液０． ５ｘＱを、Ｈｅｐｅｓ緩衝化ＤＭＥＭ中、以下の第４表に示す種々の量のＡ、ｈ 、抽出物と共にインキュベートする（２３°Ｃ，１時間）。

それぞれの調製物１０μＣをマイクロタイタープレート上のＬ９２９培養物に加 え、２４時間インキュベートする（細胞数：　５Ｘ　１０’／ホール、インキュ ベーター件：３７℃、１０％二酸化炭素、９８％湿度）。得られたプラークを顕 微鏡下に８個の同様の培養物からＡ、ｈ、（μｇ／培養物）ＯＯ，０３５０，０ ７０，１５０，３０，６１，２５２，５プラーク／培養物　２５　１０．５　３ ．５　１．３　０．３　０．２　０　０マイクロタイタープレート上において、 Ａ、ｈ、抽出物希釈物（１０μρ／ホール）の存在下または不存在下にＴ細胞セ ルラインＭＴ４の細胞をＨＩ　Ｖ−１（タイター希釈度１：２００）で感染させ る。

ＨＩＶ−１が中和されるまでのＡ、ｈ、抽出物の希釈度を決定する。

ｙｒ４ｆＳ国Ｆ１乙で９３トナミ少゛ンＴ中入ｏｂ ナイン治り　本ｎＪ＠　（ＣＰド）　ビゝフ　ｊｃＰ闘）　ギ参Ｃ−一（ｋ、庁 １　％４’ｌ　粁洛人田翫〜事Ｔ〜１）１１１７８４２５３　０　５９．３ン ２　’　２０２９５１　５１７５　１．３　１４　４０３　３２０９５２　Ｂ６ １１１．３　１４．５　３６．５４　３５３４ｎ　９２Ｂ５　０，６　１４．６ 　３８５　３７８０９７　１０４２０　０．５　１２　３５．３６　２５５９Ｂ １　７２９５　０．６　１２　３５．３田ｑ　：　１１０９８７ ＵＳＥＲ：　四 σ Ｆ工ｇ、８ １２８　／ｆ）″ ｉｇ−９ 国際調査報告 一一一中１−＾−−■−−−　ＰＣ丁／ＥＰ　９０１０１２３１

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．分子量２，０００以上の可溶性成分を含有するアカンソスベルマム・ヒスピ ダム植物の抽出物。
2. ２．分子量２，０００以上の可溶性成分を含有する、医薬として使用されるアカ ンソスベルマム・ヒスピダム植物の抽出物。
3. ３．免疫調整物質として使用される請求項２に記載の抽出物。
4. ４．抗腫瘍物質として使用される請求項２に記載の抽出物。
5. ５．放射線宿酔の治療に使用される請求項２に記載の抽出物。
6. ６．哺乳動物のウイルス疾患の予防および治療に使用される請求項２に記載の抽 出物。
7. ７．哺乳動物のレトロウイルス疾患の予防および治療に使用される請求項２に記 載の抽出物。
8. ８．免疫調整物質としてのアカンソスベルマム・ヒスピダム植物抽出物の用途。
9. ９．抗腫瘍物質としてのアカンソスベルマム・ヒスピダム植物抽出物の用途。
10. １０．放射線宿酔の治療用としてのアカンソスペルマム・ヒスピダム植物抽出物 の用途。
11. １１．哺乳動物のウイルス疾患の予防および治療用としてのアカンソスベルマム ・ヒスピダム植物油出物の用途。
12. １２．哺乳動物のレトロウイルス疾患の予防および治療用としてのアカンソスベ ルマム・ヒスピダム植物抽出物の用途。
13. １３．アカンソスベルマム・ヒスピダム植物の一部を水で抽出し、次いで得られ た抽出物から分子量２，０００以下の成分を分離することを特徴とする、請求項 １に記載の抽出物の調製方法。
14. １４．抽出用に該植物の緑葉を使用する請求項１１に記載の方法。
15. １５．抽出用に該植物の乾燥した葉を使用する請求項１１に記載の方法。
16. １６．抽出を４℃から１００℃で行う請求項１１に記載の方法。
17. １７．透析によって分子量２，０００以下の成分を抽出物から分離する請求項１ １に記載の方法。
18. １８．硫酸アンモニウム沈殿によって分子量２，０００以下の成分を抽出物から 分離する請求項１１に記載の方法。
19. １９．請求項１に記載のアカンソスペルマム・ヒスビダム植物抽出物の免疫調整 量を処置を必要とする患者に投与することを特徴とする、免疫調整を刺激するた めの方法。
20. ２０．請求項１に記載のアカンソスベルマム・ヒスビダム植物抽出物の抗腫瘍量 を処置を必要とする患者に投与することを特徴とする、抗腫瘍応答を刺激するた めの方法。
21. ２１．請求項１に記載のアカンソスペルマム・ヒスビダム植物抽出物の放射線宿 酔治療量を処置を必要とする患者に投与することを特徴とする、放射線宿酔を治 療するための方法。
22. ２２．請求項１に記載のアカンソスベルマム・ヒスピダム植物油出物の抗ウイル ス量を処置を必要とする患者に投与することを特徴とする、哺乳動物におけるウ イルス疾患を予防および治療するための方法。
23. ２３．請求項１に記載のアカンソスペルマム・ヒスピダム植物抽出物の抗レトロ ウイルス量を処置を必要とする患者に投与することを特徴とする、哺乳動物にお けるレトロウイルス疾患を予防および治療するための方法。