CN1150389A - 抑制白介素-6产生的粉防已提取物 - Google Patents

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Abstract

各种能够抑制白介素-6的产生的粉防已根提取物，及其制备方法和用于治疗因白介素-6的过量产生而引起的免疫疾病的含有所述提取物的药物组合物。

Description

抑制白介素-6产生的粉防己提取物
发明领域
本发明涉及能够抑制白介素-6(下文简称为“IL-6”)产生的粉防己根提取物，制备该提取物的方法以及含有该提取物的药物组合物，该组合物用于治疗因IL-6的过量产生而引起的免疫疾病。
发明背景
在韩国的南部和Cheju岛发现的防己和青风藤已经作为止痛药和抗炎剂使用了很长时间。另一方面，在韩国没有发现的粉防己在中国惯常用来治疗神经痛和关节炎。特别是，粉防己碱已经用作例如抗炎剂和抗高血压剂。据报导粉防己具有抗吞噬细胞和抗氧化作用(Seow，W.K.等，Int.Archs.Allergy Appl.Immun.，85，404(1988))，并且在临床和矽肺试验模型中有效(Li，Q.等，Chinese J.Tuberc.Resp.Dis.，4，321(1981))；Xu，X.等，Ecotoxicol.Environ.Safety，7，306(1983)；和Liu，B.等，Ecotoxicol.Environ.Safety，7，323(1983))，而且还已知它具有抑制由人单核细胞分泌的白介素-1和肿瘤坏死因子-α产生效果(Seow，W.K.等，Clin.Exp.Immunol.，75，47(1989)；和Ferrante，A.等，Clin.Exp.Immunol.，80，232(1990))。据报导粉防己碱及其衍生物能够促进大脑的功能(Tsumura & CO，WPIAcc.No.：92-231935(1992))并且已经开发为抗疟药，此外还是头发生长促进剂(Sunstar KK，WPI Acc.No.：89-117236(1989))。
众所周知，IL-6是参与细胞生长、分化和激活的一种调节因子。它是由各种器官细胞产生和分泌的并且在人体防御机理中起重要作用(Hirano，T.等，Immunol.Today，11，443(1990))。
据报导首先发现于单核细胞培养物中的IL-6能够通过B细胞诱发抗体的产生(Muraguchi，A.等，J.Immunol.，127，412(1981))。据报导，由于Hirano，T.等人成功地克隆了IL-6的cDNA(Nature，324，73，(1986))，已经把IL-6作为B细胞杂交瘤和浆细胞瘤的生长因子(Snick，V.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，83，9679(1986))，以及作为参与造血的一种因子(Koike，K.等，J.Exp.Med.，168，879(1988))再者，有人报导IL-6具有以下功能：刺激T细胞的活化和生长(Lotz，M.等，J.EXP.Med.，167，1253(1988))；诱导肝细胞急性期的反应(Geiger，T.等，Eur.J.Immunol.，18，717(1988))；调节神经系统的细胞分化(Satoh，T.，Mol.Cell.Biol.，8，3546(1988))；促进角质化细胞的生长；调节骨代谢；促进肾小球膜细胞的生长；抑制黑素瘤和乳癌细胞的生长，等。
按照已有的报道，各种疾病可能是由于IL-6产生失调而引起的。报道的疾病例子是类风湿性关节炎(Hirano，T.等，Eur.J.Immunol.，18，1797(1988))，肝硬变(Devere，J.等，Clin.EXP.Immunol.，77，221(1989))，牛皮癣(Grossman，R.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86，6367(1989))，多发性骨髓瘤(Bataille，R.等，J.Clin.Invest.，84，2008(1989))，心脏粘液瘤，AIDS(Niles，S.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87，4068(1990))以及其他自身免疫疾病。这些发现证实了调节IL-6的产生对维持人体免疫系统体内平衡以及治疗和预防疾病的重要性。
所以，人们已经提议调节白介素产生的许多途径。例如，使用抗IL-6或IL-6受体的抗体已经抑制了患有因IL-6分泌过剩引起骨髓瘤的患者的单核细胞的增生(Suzuki，H.，Eur.J.Immunol.，22，1989(1992))。尽管如此，还没有报道特异性抑制IL-6产生的物质或方法，因此，仍存在发现抗IL-6产生的特异性抑制剂的需要。
发明概述
所以，本发明的一个目的是提供一种从粉防己根中获得的能够特异性抑制IL-6产生的提取物。
本发明的另一个目的是提供一种含有有效量的该提取物的一种药物组合物，它能够治疗因IL-6的过量产生而引起的免疫疾病。
附图的简要说明
结合附图从下面本发明的说明书将会清楚本发明上述和其他目的及特征，其中：
图1显示了粉防己提取物A和B对人单核细胞和巨噬细胞的细胞毒性；
图2描述了粉防己提取物A和B对人单核细胞和巨噬细胞中IL-6的产生的抑制作用；
图3表示了粉防己提取物A对大鼠肺泡巨噬细胞中IL-6的产生的抑制作用；
图4公开了粉防己提取物C对大鼠IL-6的产生的抑制作用；
图5表示了粉防己提取物C对大鼠肺成纤维细胞中IL-6的产生的抑制作用；
图6说明了粉防己提取物B对关节炎患者的滑膜细胞中IL-6的基因表达的抑制作用；
图7显示了粉防己提取物A对关节炎患者的滑膜细胞增生的抑制作用；
图8表示了粉防己提取物A对大鼠肺成纤维细胞中胶原的产生的抑制作用；
图9反映了粉防己提取物C对大鼠肺组织中胶原的产生的抑制作用；
图10证实了粉防己提取物A对人单核细胞和巨噬细胞中的活性氧的产生的抑制作用；
图11显示了粉防己提取物A，B，C和D对患有诱发性肝硬变的大鼠血清中的GOT和GPT含量的作用；以及
图12记录了粉防已提取物A，B，C和D对大鼠肝硬变的作用。发明的详细说明
本文所引用的全部参考文件这里都把它们的全文作为参考。
按照本发明，已经发现了从粉防己根中获得的提取物具有特异性抑制IL-6产生的能力；所以，该提取物可用于治疗各种因IL-6的过量产生而引起的免疫疾病。
所述的粉防己提取物可以使用各种溶剂如甲醇，乙醇，己烷，二氯甲烷或其混合物，生理盐水，蒸馏水等制备。具体来说，下面进一步描述的粉防己提取物A，B，C和D可以按照下面优选实施例制备。
向1千克的粉防己干燥根中加入1-3升，优选2升的甲醇；在50-70℃把该混合物加热6-12小时，或者在室温下加热至少24小时，然后过滤。重复上述步骤，优选重复三次，在减压下如7mmHg浓缩合并的滤液获得提取物A。
用200-400毫升、优选250毫升甲醇和200-400毫升、优选250毫升己烷萃取100克所述的提取物A。从中分离出甲醇部分并减压浓缩。用氢氧化铵或氢氧化钠把残余物的pH值调到9-11的范围。用400-800毫升、优选500毫升的蒸馏水和二氯甲烷的混合物(1∶1(v/v))萃取所获得的产物。从中分离出二氯甲烷部分，即生物碱部分，然后减压浓缩获得提取物B。
另一方面，把1千克的粉防己干燥根切碎，过筛，然后以50-200mg/ml、优选100mg/ml的浓度悬浮于蒸馏水或生理盐水中。把所获得的悬浮液在80-100℃、优选95℃加热4-12小时，优选6小时。过滤加热过的悬浮液并减压浓缩获得提取物C。
还有一种方法是，把1千克的粉防己干燥根与1-3升、优选2升蒸馏水混合并在80-100℃、优选95℃加热4-15小时，优选12小时。把加热过的混合物过滤并减压浓缩。把残余物在-70至-90℃、优选-80℃贮存2-10小时、优选8小时，然后冷冻干燥4-8小时、优选6小时获得粉末状提取物C。
另外，向1千克的粉防己干燥根中加入1-3升，优选2升乙醇并在60-90℃加热该混合物6-12小时，或者在室温加热至少24小时，然后过滤并减压浓缩合并的滤液，重复上述步骤，优选重复三次，获得提取物D。
所述的提取物A，B，C和D都具有抗炎、抑制胶原合成和活性氧产生并且降低血清中的GOT和GPT的含量等作用。所以，它们能够单独或者相互于一种药物组合物中组合使用以治疗因IL-6的过量产生而引起的免疫疾病如风湿性关节炎，肝硬变，牛皮癣，多发性骨髓瘤，心脏粘液瘤，矽肺和爱滋病。尽管如此，优选是用提取物A治疗炎性疾病，关节炎和纤维发生疾病；提取物B治疗关节炎和自身免疫肝硬变；提取物C治疗矽肺和肝脏的纤维发生疾病；以及提取物D治疗肝硬变。
本发明用于治疗因IL-6的过量产生而引起的免疫疾病的药物组合物可以含有药物可接受的赋形剂，载体或稀释剂和作为活性成分的粉防己提取物。可以采用常规方法将其制成药物制剂。
制备组合物时，优选把该活性成分与一种载体混合或稀释，或者用一种载体包埋，这种载体可以是胶囊，香囊或其他装载形式。当载体是稀释剂时，它可以是固体，半固体或液体物质，其作为活性成分的载体，赋形剂或介质。所以，该组合物可以是片，丸，粉末，香囊，醑剂，悬浮液，乳浊液，溶液，糖浆，气雾剂，软和硬明胶胶囊，无菌注射液，无菌包装的粉末等等形式。
适当的载体，赋形剂或稀释剂的例子有乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯胶，藻酸盐，明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，甲基羟基苯甲酸盐，丙基羟基苯甲酸盐，滑石，硬脂酸镁和矿物油。该制剂中还可以加入润滑剂，湿润剂，矫味剂，悬浮剂，防腐剂等等。本发明组合物可以采用本领域所熟知的任何方法如此制备，以使得患者施用后，活性成分能够快速、持续成缓慢释放。
该药物组合物能够通过各种途径如口服，经皮，皮下，静脉和肌肉引入进行给药。一般活性成分的每日用量可以为1-500μg/kg体重，优选为30-300μg/kg体重，并且能够一次或多次服用。但是，应当明白该活性成分的实际给药量必须取决于各种相关因素如待治疗的疾病，所选择的给药途径，不同患者的年龄和体重以及患者症状的严重程度；所以，上述剂量不是用于限定本发明的范围。
下面的制备例和实施例用来更详细地说明本发明但不限定其范围；除非有其他说明，本文实施例中所用的试验方法是按照下文中所给出的参考文件实施例进行实施的。
而且，除非作其他特别说明，下面所给出的固体和固体混合物，液体和液体以及固体和液体混合物的百分比分别以wt/wt，vol/vol和wt/vol为准。制备例：粉防己提取物的制备
把4.0千克左右的粉防己完全干燥的根切细并用5升左右的甲醇提取两天。把该提取步骤重复三次并减压浓缩合并的提取液获得224克左右的甲醇提取物(提取物A)，产率为5.6％。
用500毫升的90％甲醇和500毫升的正己烷萃取200克的提取物A。分离出90％的甲醇相层并减压浓缩除去甲醇。用0.1M的氢氧化铵把残余物的pH值调到10并用600毫升的蒸馏水和二氯甲烷的混合物(1∶1(v/v))萃取。然后，分离出二氯甲烷相层，即生物碱组分并减压浓缩获得25克左右的提取物B，产率为0.6％。
另一方面，按如下制备用于在一次检测中治疗矽肺的提取物C。把1千克的粉防己干燥根粉碎，过筛(60目)，然后以100mg/ml的浓度悬浮于蒸馏水中。把所获得的悬浮液在100℃加热6小时并过滤。减压浓缩滤液获得80克粉防己的水提取物(提取物C)，产率为8％。然后，在-20℃贮存。
为了制备用于在一次检测中治疗肝硬变试验的提取物C，把1113.5克的粉防已干燥根放入加有2升蒸馏水的、安装有冷却装置的3升园底烧瓶中，在95℃把该混合物加热12小时，然后过滤。把滤液用一台旋转真空蒸发器(Buchi 451)中减压浓缩，用一台深度冷冻器(SANYO，日本)在-84℃冷冻3小时，然后用冷冻干燥器(EYELA，日本)冷冻干燥4小时获得56.55克粉末状提取物C，产率为5.1％。
进一步地，在室温下用1.5升甲醇将500克粉防己干燥根提取3天。把该提取步骤重复三次并减压浓缩合并的提取物获得13克粉防己的乙醇提取物，产率为2.6％。参考实施例1：用于检测的细胞的分离(1)人单核细胞，巨噬细胞和嗜中性细胞的分离
把正常人的外周血进行肝素处理并用等量的Hank氏平衡盐溶液(HBSS：无Ca2+和Mg2+)稀释。把稀释的血液放入一离心管中，该离心管中含有堆积在密度为1.119的Ficoll-Hypaque(Sigma，St.Louis，MO，U.S.A.)层上的密度为1.077的Ficoll-Hypaque(Sigma，St.Louis，MO，U.S.A.)层，然后在700xg离心30分钟从密度为1.077的Ficoll-Hypaque层和血清层之间获得单核细胞，并且从密度为1.077的Ficoll-Hypaque部分和密度为1.119的Ficoll-Hypaque层之间获得嗜中性细胞。使用4℃HBSS(无Ca2+和Mg2+)将分离出的细胞并将洗涤两次其悬浮于含有10％牛胎血清(FBS，Hyclone，Logan，UT，U.S.A.)的RPMI 1640培养基(Gibco，GrandIsland，NY，U.S.A.)中。把该悬浮液加入24孔培养平板(Costar，Cambridge，MA，U.S.A.)的孔中并在37℃温育2小时获得单核细胞，巨噬细胞和嗜中性细胞。(2)成纤维细胞的分离
使用如下对Phan，S.H.等在J.Clin.Invest.，76，241(1985)中所述的方法的改良方法从大鼠中分离成纤维细胞。
把大鼠用乙醚麻醉并在无菌工作台上分离肺。把肺切成2-4mm大小的小片并悬浮于含有胶原酶和0.5％胰蛋白酶的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，在37℃把该组织消化2小时。用无菌纱布过滤该悬浮液除去，如没消化的组织。使用PBS把分离出的细胞洗涤两次或三次并悬浮于含有10％牛胎血清(FBS，Hyclone，Logan，UT，U.S.A.)的RPMI1640培养基(Gibco，Grand Island，NY，U.S.A.)中。把该悬浮液加入培养板的孔中并在5％二氧化碳培养器(Lunaire Environ，Inc.，Pennsylvania，U.S.A.)中37℃温育1-2小时。使用RPMI 1640培养基洗涤该平板以除去不能附着在平板上的细胞。向平板中加入新鲜的培养基并继续温育直到形成融合层。在下面试验中使用不超过5次传代培养的细胞。
在如上所述的相同条件下在含有10％FBS的RPMI 1640培养基中培养NIH3T3成纤维细胞(ATCC CRL 1658)。(3)从风湿性关节炎患者中分离滑膜细胞
使用凉的PBS把患有风湿性关节炎患者的滑膜洗涤三次并用无菌剪刀将其剪成2mm大小的小片，然后将其悬浮于含有胶原酶A(5mg/ml，BM，Indianpolis，IN，U.S.A.)和I型脱氧核糖核酸酶(0.15mg/ml，Sigma)的DMEM(Sigma，U.S.A.)中并在5％二氧化碳培养器中37℃温育2小时。然后，向其中加入0.5％胰蛋白酶-0.2％EDTA，继续温育30分钟。把消化的组织使用PBS洗涤两次，使用DMEM洗涤一次，把分离出的细胞悬浮于含有10％FBS(DMEM-10％FBS)的DMEM中并温育一周。
此后，使用胰蛋白酶-EDTA分离粘着的滑膜细胞，使用EDTA洗涤，然后以105个细胞/毫升悬浮于DMEM-5％FBS。把该悬浮液以1毫升/每孔的量加入24孔培养板的孔中并在37℃温育24小时。把所获得的培养基在-20℃贮存以用于下列试验，把一部分进行传代并以冷冻状态贮存在液氮箱中。(4)使用粉防己提取物处理这些细胞
以各种不同的浓度把粉防己提取物加入5×105/ml上述步骤获得的细胞中，在5％二氧化碳培养器中把细胞在37℃下预温育1小时。然后，向其中加入硅(100μg/ml)和含有2％FBS的RPMI 1640培养基各1毫升并且在如上述相同条件下把细胞培养48小时。收集培养的上清液并以1,500rpm离心分离10分钟除去这些细胞和硅。把所获得的上清液进行透析除去PBS并用0.2um的过滤注射器过滤，然后，把滤液在-20℃贮存。参考实施例2：粉防已提取物细胞毒性的测定
采用下列步骤测定粉防己提取物的细胞毒性。
按照参考实施例1(4)的步骤，分别使用在制备例中获得的并在相同条件下温育的0.1，1和10μg/ml的提取物A和B处理在参考实施例1(1)中所获得的各5×105个细胞/毫升的单核细胞和巨噬细胞。根据Alley，M.C.，等在Cancer Res.，48，598(1988)中所描述的方法，把该培养物以1毫升/孔的量加入培养平板的孔中并向各孔加入0.5mg的3-4，5-二甲基噻唑-2，5-二苯基-四唑溴(MTT，Sigma)。在37℃温育4小时后，把培养基离心分离除去上清液。把各100μl酸化异丙醇(在异丙醇中有0.04NHCl)加入各孔的细胞中以洗脱由活细胞产生的甲，并且使用一台ELISA读数器(Titertek  mμltiskan  Mcc/340)在540nm测定光密度(O.D.)(图1)。
图1显示了当以没有使用提取物A或B处理的对照组的光密度看作100％时，样品光密度与提取物A或B的浓度的相对值。当由于粉防己提取物的细胞毒性而使单核细胞和巨噬细胞的存活率下降时，能够引起光密度下降的甲的产生也在减少。直到提取物A的浓度达到10μg/ml，使用提取物A处理过的样品与对照组也没有显著性差异，并且，使用提取物B处理过的样品也显示了相似的结果。所以，可以确认以低于10μg/ml的浓度使用的提取物A和B没有细胞毒性，本文以后全部试验都是在这个浓度范围内进行的。以100μg/ml的浓度使用时提取物A和B都显示出细胞毒性。
另一方面，使用大鼠也确定了提取物C和D的细胞毒性。把提取物C和D各40mg对大鼠一周两次口服给药17周，结果，对大鼠没有显示出毒性(死亡，体重减轻等)。实施例1：粉防己提取物对人单核细胞和巨噬细胞中IL-6产生的抑制
使用0.1-10μg/ml的提取物A或B温育参考实施例1(1)中获得的单核细胞/巨噬细胞1小时并使用100μg/ml的硅处理48小时。把培养物离心分离获得上清液，然后，将上清液在PBS中透析。使用IL-6依赖的B9杂交瘤细胞系测定其中IL-6的活性。
把B9细胞系(Df.Kishimoto，T.，Osaka Unversity，日本)在含有10％FBS并又加入2U/ml的重组人IL-6的RPMI 1640培养基上培养，并且用无血清的培养基把细胞洗涤三次。再将细胞以5×104个细胞/毫升的浓度悬浮于含有10％的FBS的RPMI 1640培养基中，把该悬浮液以100μl/孔的量加入一个96孔培养平板皿的孔中。然后，在37℃5％二氧化碳下把平板温育68小时。把0.5μCi的3H-胸苷以50μl/孔的量加入孔中并继续温育4小时。温育完成后，使用多细胞收集器(Inotech)把细胞收集在玻璃纤维滤器中并使用液体闪烁计数器(Beckman，Somerset，NJ，U.S.A.)测定掺入的3H-胸苷的量。
图2显示了当以没有使用提取物A或B处理的对照组中掺入的3H-胸苷的量看作是100％时，掺入的3H-胸苷的量与提取物A或B的浓度的相对值。从图2可以看到，粉防己提取物A或B是以依赖浓度的方式抑制单核细胞/巨噬细胞中IL-6的产生的，并且使用10μg/ml的粉防己提取物A或B能够抑制50％。实施例2：粉防已提取物对大鼠肺泡巨噬细胞中IL-6产生的抑制
把大鼠用氯胺酮麻醉并向大鼠的气管鳃中插入一只无菌的薄管再用一只30ml的注射器重复注射三次并吸取10mlRPMI 1640培养基获得大鼠的肺泡巨噬细胞。把所获得的细胞以400xg离心分离5分钟，悬浮于50ml含有10％的FBS的RPMI 1640培养基中，然后在37℃温育2小时使这些细胞粘着在培养平板上。用PBS把该平板洗涤两次除去肺泡淋巴细胞(漂浮的细胞)并获得肺泡巨噬细胞。
把肺泡巨噬细胞以2×105个细胞/孔的量加入24孔培养平板的孔中并用100μg/ml的硅和10μg/ml的提取物A处理3天。离心分离培养基获得上清液，然后在PBS中透析。按照实施例1中所述的步骤使用IL-6依赖的B9杂交瘤细胞系测定其中的IL-6的活性。
结果发现，提取物A也抑制大鼠肺泡巨噬细胞中IL-6的产生(图3)。在图3中，培养液，Si和Si+EXT.A分别表示没有处理的对照组，硅刺激的样品和硅刺激又提取物A处理的样品。实施例3：提取物C对IL-6产生的抑制
为了制备试验用的矽肺模型，把每治疗组五只体为150g左右的Sprague-Dawley大鼠的肺泡打开并注射溶于0.5mlPBS中的500mg硅。
注射硅一周后，给大鼠每周两次口服40mg的提取物C或者静脉内或腹膜内注射250μg鼠IL-6抗体(MIL-6Ab，Immunex，Seatle，U.S.A.)17周。按照实施例1中所述的相同步骤测定血清(图4)中和参考实施例1(2)中所获得的肺成纤维细胞培养物(图5)中的IL-6的活性。
从图4和图5中可以看到，在这两种情况下提取物C都能抑制IL-6的活性，这表明粉防己提取物对矽肺动物模型具有抑制作用。在图4和图5中，正常组，Si和Si+EXT.C和Si+MIL-6 Ab分别表示用PBS处理的对照组，硅刺激的样品和硅刺激又提取物C处理的样品，以及硅刺激又MIL-6 Ab刺激的样品。实施例4：粉防己提取物对IL-6基因表达的抑制
为了确认粉防已提取物抑制IL-6的基因表达，如下测定该提取物对从由于IL-6的过量产生而引起的类风湿性关节炎患者中获得的滑膜细胞(Hirano，T.等，Eur.J.Immunol.，18，1797(1988))的作用。
把在参考实施例1(3)中分离出的滑膜细胞以1.5×106个细胞/孔的量加入培养平板的孔中并在37℃5％二氧化碳下把平板温育24小时使其粘着在孔中。把1μg/ml或10μg/ml的提取物A加入该孔并在37℃5％二氧化碳下把平板温育3天。温育完成后，离心分离培养液除去上清液并将沉淀的细胞用PBS洗涤，加入500μl变性溶液(4M硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，pH7.0，0.1M2-巯基乙醇，0.5％肌氨酸)并且轻轻吸取进行细胞破裂。把所获得的溶液转入一只试管中并向其中加入50μl的2M柠檬酸钠(pH4.0)和500μl水饱和的苯酚，完全混合。然后，向该混合物中加入两倍体积的氯仿，把所获得的混合物在冰中贮存10分钟，以12,000rpm离心分离以获得上清液，向上清中加入1ml的异丙醇并将得的混合物在-20℃贮存2小时，然后以12,000rpm离心20分钟获得沉积的片状沉淀物。把该片状沉淀物用70％的甲醇洗涤，干燥，然后溶于20μl的0.1％焦碳酸二乙酯-水到最终浓度为10μg/ml。
为了从上述获得的RNA合成单股cDNA，如下使用M-MLV逆转录酶(Promega，U.S.A.)进行逆转录反应。向反应试管中加入5μl的5x反应缓冲液(250mM的Tris-HCl，pH8.3，375mM的KCl，15mM的MgCl2，50mM的DTT)，2μl的5μM dNTP混合物(dATP，dCTP，dGTP和dTT各5μM)，1μl(0.2μg)的引物NotI-dT(5-dCGCCGGCG(T)1s-3’)，1μl的蒸馏水，10μl的该细胞RNA和1μl(200U)的M-MLV逆转录酶(Promega，U.S.A.)，把所获得的溶液充分混合，然后，在42℃反应30分钟。在90℃把溶液加热5分钟来终止该反应。
使用上述所获得的溶液，进行聚合酶链反应(PCR)来扩增cDNA。
把20μl逆转录反应所获得的溶液，8μl的10x聚合酶链反应的缓冲液(100mM的Tris-HCl，pH8.3，400mM的KCl，10mM的DTT，15mM的MgCl2，5μg/ml的BSA)，1μl(20pmol)的5’-末端引物(5’ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3’)，1μl(20pmol)的3’-末端引物(5’-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3’)，69μl的蒸馏水和1μl(2.5U)的Taq DNA聚合酶(Promega，U.S.A.)完全混合并将该混合物在9℃下贮存5分钟来抑制其他不需要的酶。聚合酶链反应的进行是把由95℃1.5分钟；55℃1分钟；72℃1.5分钟组成的热循环重复30次，最后，把该反应混合物在95℃反应1.5分钟；在55℃反应1分钟和在72℃反应5分钟。
在1.0％琼脂糖凝胶上100伏特电压下把10μl聚合酶链反应产物电泳30分钟。把该凝胶用EtBr溶液染色10分钟，用蒸馏水洗涤并且摄影(图6)。从图6可以看到，提取物B没有影响用作对照组的一直表达的腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)RNA的表达，同时浓度为10μg/ml的提取物B显著性地抑制了IL-6 RNA的表达。结果表明粉防己提取物能够抑制IL-6基因的表达。在图6中，泳道M是标准DNA大小标记，而10，1和0表示单位为μg/ml的提取物B的浓度。实施例5：粉防己提取物对滑膜细胞增生的抑制
按照参考实施例1(4)所述的步骤，使用0.1-100μg/ml浓度范围的提取物A处理人单核细胞/巨噬细胞并对这些细胞进行培养。在PBS中透析培养物，向透析液中加入1×104个滑膜细胞，然后把细胞培养五天。在PBS中向培养基中加入3H-胸苷后，再把细胞培养4小时，使用液体闪烁计数器测定细胞中掺入的3H-胸苷的量(图7)。从图6可以看到，在10μg/ml浓度时提取物A能够显著性地抑制滑膜细胞的增生。实施例6：粉防己提取物对胶原合成的抑制
我们已知IL-6是一种能够引起大鼠成纤维细胞的纤维发生和诱发成纤维细胞的胶原合成细胞因子(Kang，H.S.等，Korean.J.Immunol.，14，193(1992))。为了证实粉防己提取物对IL-6这类功能的能力，测定它对大鼠肺成纤维细胞和肺泡组织中胶原合成的抑制作用。采用抑制间接ELISA方法测定大鼠肺成纤维细胞的培养物中所产生的胶原量，通过测定羟脯氨酸的浓度并使用内部对照组的标准曲线计算其中胶原的量来决定肺泡培养物中所产生的胶原量。
为了测定大鼠肺成纤维细胞培养物中所合成的胶原量，把作为内部对照组的胶原(Sigma，I型)完全溶于含有1mg/ml胃蛋白酶的1M乙酸中，并使用包被缓冲液(0.05M碳酸盐，pH9.6)把该溶液在1μg-16pg浓度范围内连续稀释5倍。把稀释的溶液以100μl/孔的量加入平底微滴平板(Dynatech，Cantilly，VA，U.S.A.，Immμl  lon 2)的孔中。
另一方面，使用快速真空干燥器(Savant，Hicksville，NY，U.S.A.)把1ml参考实施例1(2)中所获得的大鼠肺非成纤维细胞的培养物上清液浓缩10-20倍并溶于100μ1包被缓冲液(0.1M NaHCO3，0.02％NaN3；。用Na2CO3把pH调节到9.6)，以100μl/孔的量把该溶液加入孔中，然后在4℃贮存过夜。
用洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween 20，pH7.4)把平板洗涤三次，并且把1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)以100μl/孔的量加入孔中。在室温下把平板温育2小时来封闭未包被部分。用上述相同的缓冲液把平板洗涤三次，然后以100μl/孔的量向孔中加入用稀释缓冲液(0.05M Tfis-HCl，1mM MgCl26·H2O，0.15M NaCl，0.02％NaN3，1％BSA，0.05％Tween20，pH8.1)稀释了1,000倍的碱性磷酸酶-结合的鼠抗山羊IgG(Cappel，Dunham，NC，U.S.A.)。
在37℃下把平板温育2小时，然后用上述相同的缓冲液把平板洗涤三次。以100μ1/孔的量向孔中加入用底物缓冲液(0.05MNaHCO3，10mM MgCl2·6H2O，pH9.8)稀释到1mg/ml浓度的对硝基苯基磷酸盐，并且用一台ELISA读数器在405nm测定培养液的O.D.。由O.D.值与内部对照组的OD值计算出所产生的胶原量。结果发现，在37℃用10μl/ml的提取物A预处理1小时并用100μl/ml的硅处理48小时后的大鼠肺成纤维细胞培养物中合成的胶原量显著下降(图8)。在图8中，Si+PBS和Si+EXT.A分别表示用硅刺激的样品和提取物A处理又硅刺激的样品。
而且，为了按照实施例3的步骤测定大鼠肺泡组织中所合成的胶原量，把大鼠的支气管打开并注射500mg的硅，给大鼠一周两次口服溶于1％DMSO的40mg提取物C或只口服1％DMSO 17周，然后，如下测定羟脯氨酸的量。
在一只Pyrex试管(Corning，Rochestor，NY，U.S.A.)中把0.1-0.2g的大鼠肺泡组织与1ml的PBS混合，然后将其粉碎。用一台超声发生器(Heat system，W-380)破碎所获得的组织提取物，向其中加入1ml盐酸并把该混合物在120℃的干燥烘箱中干燥过夜。用冰箱冷冻所获得的物质，在冷冻干燥器(labconco)中冻干并向其中加入1ml蒸馏水完全溶解。把50μl所获得溶液加入一只微量离心试管中并向其中加入50μl蒸馏水稀释该溶液。作为内部对照组，把顺式-γ-羟基-L-脯氨酸(Sigma)稀释到20μg-150pg的浓度范围内，并且把100μl的各种稀释溶液加入微量离心试管中。
向试管中加入0.9ml的由1.41g的氯胺-T(N-氯-P-甲苯磺胺钠)溶于10ml的正丙醇制得的溶液和10ml蒸馏水，将其在室温下贮存20分钟。然后，向所获得的混合物中加入1ml醛/高氯酸溶液，该溶液是由15g对二甲基氨基苯甲醛溶于62ml正丙醇，然后向其中加入26ml60％的高氯酸使总体积为100ml而制成，把所获得的溶液完全混合。将该微量离心试管放入65℃的水浴15分钟使之显色，在650nm测定样品的O.D.，使用内部对照组的标准曲线计算样品中羟脯氨酸的量。
从图9的结果可以看到，当把正常大鼠肺泡组织(正常)所产生的胶原量当作100％时，只用硅处理(Si)或用硅和磺酸二甲酯处理(Si+DMSO)的大鼠肺泡组织中所合成的胶原量显著升高，同时，用硅，DMSO和提取物C处理(Si+EXT.C)的大鼠肺泡组织中所合成的胶原量下降50％。上述结果表明粉防己提取物具有抗纤维产生的能力。实施例7：粉防己提取物对活性氧产生的抑制
我们知道炎性反应是包括从被各种刺激物刺激的免疫细胞中分泌各种细胞因子如IL-6；由该细胞因子刺激的其他免疫细胞产生磷脂酶A2，溶媒体酶，反应氧类等等；和由上述产物诱发的组织坏死这些串联反应(Pruzanski，W.和Vadas，P.，Immunol.Today，12，143(1991))。通过测定粉防己提取物对活性氧如H2O2和O2 -产生的抑制活性来证实粉防已提取物阻断炎性反应的能力。
如下使用一台具有96孔微平板的微型测量器来测定H2O2的量。向含有RPMI 1640培养基的各孔中加入5×105个嗜中性细胞，并且再向各孔中加入25μl的辣根过氧化物酶(500μg/ml；II型，Sigma)和75μl的酚红(1mg/ml)。此后，把细胞使用10，20和50μg/ml的提取物A处理1小时，用10M十四酰佛波乙酸酯(PMA)刺激细胞，然后在37℃60分钟。温育完成后，把3M的NaOH以25μl/孔的量加入这些孔中来终止反应并使用ELISA读数器(DynatechLab.Inc)测定620nM处的O.D.来判定与酚红氧化相关的颜色变化。使用由稀释的H2O2(Sigma)制得的标准曲线来测定H2O2的量。
为了测定所产生的O2 -的量，把悬浮于RPMI 1640培养基中浓度为1×106个细胞/800μl的嗜中性细胞加入24孔平板的一部分孔中并向空余的孔中加入10μg/ml过氧化物歧化酶(SOD，Sigma)。把该平板在37℃贮藏2分钟，并且把细胞色素C(3mg/ml，Sigma)以100μl/孔的浓度加入这些孔中。用10，20和50μg/ml的提取物A把细胞处理1小时并加入10-7M的PMA促进剂在37℃下反应20分钟。向这些孔中加入1mm的N-乙基顺丁烯二酰亚胺(Sigma)来终止反应并在1,600xg把培养基离心分离10分钟获得一种上清液。使用一台紫外可见分光光度计(Kontron Instrument，Nilano，Italy)测定550nm处的由细胞色素C的还原引起的上清液的颜色变化。所产生的O2 -的量可以使用SOD的浓度来表示，SOD能够抑制在1×106个细胞中细胞色素C的还原20分钟，或者使用细胞色素C的消光系数(E＝1.83×104mM-1cm-1)来表示。从表I可以看到，50μg/ml提取物A能够抑制50％的H2O2的产生，和25％O2 -的产生。这种结果表明提取物A对炎性反应具有强抑制活性。
表I：粉防己提取物A对人嗜中性细胞中反应氧类产生的抑制作用
    样品     所产生的反应氧类的量(％，与对照组相比)
H2O2(nM/60分钟) O2 -(nM/20分钟)
仅有培养基PMAPMA+提取物A10μg/ml20μg/ml50μg/ml 11.5(11.1)103.6(100)90.6(87.4)58.6(56.6)50.6(48.8) 2.0(12.9)15.5(100)12.7(81.9)12.4(80.0)11.5(74.2)
另一方面，重复上述相同的步骤测定由5×105个细胞的人单核细胞/巨噬细胞所产生的H2O2和O2 -的量，其中的人单核细胞/巨噬细胞使用10μg/ml的提取物A在37℃下处理了1小时，然后用100μg/ml的硅进行刺激。从图10可以看到，在硅刺激的和提取物A处理的单核细胞/巨噬细胞(Si+EXT.A)与仅用硅处理的对照组(Si+MED)相比H2O2和O2 -的量显著降低。实施例8：粉防己提取物对肝硬变的抑制
肝硬变(肝硬化)特征是整个肝脏产生纤维，纤维间隔把肝脏的实质细胞全部破碎以及再生瘤形成。它们多数源于慢性肝炎或慢性酒精中毒，但是，准确的原因还不清楚。在肝硬变患者细胞因子如参与在发炎和纤维产生中的IL-6的量处于增长状态；所以，通过抑制IL-6的活性可以测定粉防己提取物对肝硬变的抑制。
为了在四周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠诱发试验性肝硬变(Nakataukasa，H.，等，J.Clin.Invest.，85，1833-1843(1990))，给大鼠一周两次腹膜内注射1.0ml/100g体重的四氯化碳溶液(50％四氯化碳+50％玉米油)，并且在注射四氯化碳的同时给大鼠一周两次口服提取物A，B，C和D各0.2ml。开始试验13周后，把每只大鼠用乙醚麻醉并从心脏中获得血液样品来测定血清谷氨酸草酰乙酸转氨酶(sGOT)值和血清谷氨酸丙酮酸转氨酶(sGPT值)(图11)。
从图11可以看到，当与从使用CCl4，DMSO和作为对照组的PBS处理的大鼠中获得的血液样品进行比较时，从使用提取物A或C处理的大鼠中获得的血液样品的sGOT值没有降低，但是，从使用提取物D或B处理的大鼠中获得的血液样品的sGOT值分别下降了20％和40％。而且，从使用提取物B处理的大鼠中获得的血液样品的sGPT值下降了60％以上。
为了从上述大鼠分离出的肝脏的病理组织学检查，把肝脏在10％的中性福尔马林水溶液固定，切成4mm厚，然后包埋在石蜡中。把包埋的组织切成5mm厚的片，用苏木精曙红和Nasson氏三色染色，然后在显微镜下观察(图12)。
从图12可以看到，在只使用四氯化碳的大鼠的肝脏中(B)，有变厚纤维带的肝小叶的瘤的形成比正常肝脏(A)更明显。在使用四氯化碳和提取物B(F)；四氯化碳和提取物C(E)和四氯化碳和提取物D(D)的大鼠的肝脏中，尽管表现出了肝硬变的症状，但是，肝小叶瘤周围的纤维带比从只使用四氯化碳处理的大鼠中获得的肝脏的肝小叶瘤周围的纤维带更薄，与从只使用四氯化碳处理的大鼠中获得的肝脏的瘤相比，许多不完整形成，并且与从只使用四氯化碳处理的大鼠中获得的肝脏的肝细胞的再生变化相比，肝细胞的再生变化下降。在使用四氯化碳和提取物A(C)的大鼠的肝脏中，对肝硬变的抑制作用低于D，E和F组。
下列制剂例仅用于详细说明而不是对本发明范围的限定。制剂例
使用下列组分制备硬明胶胶囊：
                         用   量
                        (mg/胶囊)活性成分                       20干淀粉                         160硬脂酸镁                       20总量                           200mg
把上述组分混合并以每个单位胶囊200mg的量填充到硬明胶胶囊中。
在上述具体实施例描述本发明的同时，我们应该清楚可以作出的各种改良和变化并且它们也属于下列权利要求所限定的本发明保护范围内。

Claims (8)

1.一种粉防己根的提取物，它可以用于治疗因白介素-6的过量产生而引起的免疫疾病。
2.权利要求1的提取物，其是用甲醇，乙醇，二氯甲烷，水或其混合物提取的。
3.权利要求2的提取物，其是用这样一种方法制得的，该方法包括下列步骤：把甲醇加入粉防己根中；在50-70℃的温度范围内把该混合物加热6-12小时；过滤加热过的混合物获得滤液；浓缩滤液获得提取物A。
4.权利要求2的提取物，其是用这样一种方法制得的，该方法包括下列步骤：用甲醇和己烷把权利要求3中获得的提取物A进行萃取获得甲醇部分；浓缩该甲醇部分；把浓缩液的pH调到9-11的范围内；用蒸馏水和二氯甲烷萃取pH调好的浓缩液获得二氯甲烷部分；浓缩该二氯甲烷部分获得提取物B。
5.权利要求2的提取物，其是用这样一种方法制得的，该方法包括下列步骤：以50-200mg/ml的浓度把粉防己根的粉末悬浮于一种水溶液中；在80-100℃的温度范围内把该悬浮液加热4-12小时；过滤加热过的悬浮液；浓缩滤液获得提取物C。
6.权利要求2的提取物，其是用这样一种方法制得的，该方法包括下列步骤：把水加入粉防己根中；在80-100℃的温度范围内把该混合物加热4-12小时；过滤加热过的混合物；浓缩滤液；把该滤液在-70到-90℃下贮存2-10小时；并且将其冷冻干燥4-8小时获得提取物C。
7.权利要求2的提取物，其是用这样一种方法制得的，该方法包括下列步骤：把乙醇加入粉防己根中；在60-90℃的温度范围内把该混合物加热至少4小时；过滤加热过的混合物；并浓缩滤液获得提取物D。
8.一种药物组合物，它含有治疗有效量的权利要求1的提取物和药物可接受的载体。
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