KR0161145B1

KR0161145B1 - 분방기 추출물을 함유하는 인터루킨-6 생산 억제용 조성물

Info

Publication number: KR0161145B1
Application number: KR1019950011641A
Authority: KR
Inventors: 변광호; 최인표; 강형식; 이정준; 김영호
Original assignee: 김은영; 한국과학기술연구원
Priority date: 1994-06-09
Filing date: 1995-05-12
Publication date: 1998-12-01
Also published as: KR960000242A; WO1995033473A1; EP0759766A1; JPH09506635A; CN1150389A

Abstract

본 발명은 분방기(Stephania tetrandra S. Moore)의 뿌리에서 분리한 여러 가지 추출물(extract), 이들의 제조 방법 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 이들을 이용하여 인체의 면역체계를 조절하는 중요한 인자인 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6)의 생산을 조절함으로써 인터루킨-6 생산량과 관련 있는 콜라겐 생산, 반응성 산소 생산 및 관절염 환자의 활막세포(synoviocyte)의 세포성장을 효과적으로 조절하여 이로 인한 질병을 치료할 수 있다.

Description

분방기 추출물을 함유하는 인터루킨-6 생산 억제용 조성물

제1도는 분방기 추출물 A 및 B의 세포독성 검정결과를 나타내고,

제2도는 분방기 추출물 A 및 B에 의한 사람 단핵구/대식세포의 인터루킨-6 생산억제 효과를 측정한 결과를 나타내고,

제3도는 분방기 추출물 A에 대한 흰쥐 폐 대식세포의 인터루킨-6 생산 억제 효과를 측정한 결과를 나타내고,

제4도는 분방기 추출물 C에 의한 흰쥐의 인터루킨-6 생산 억제 효과를 측정한 결과를 나타내고,

제5도는 분방기 추출물 C에 의한 흰쥐 폐 섬유아세포의 인터루킨-6 생산 억제 효과를 측정한 결과를 나타내고,

제6도는 관절염 환자의 활막세포에서 분방기 추출물 B에 의한 인터루킨-6 유전자 발현억제 효과를 측정한 결과를 나타내고,

제7도는 분방기 추출물 A에 의한 관절염 환자의 활막세포의 세포증식 억제 효과를 측정한 결과를 나타내고,

제8도는 흰쥐 폐 섬유아세포에서 분방기 추출물 A에 의한 콜라겐 생산억제 효과를 측정한 결과를 나타내고,

제9도는 흰쥐 폐 조직에서 분방기 추출물 C에 의한 콜라겐 생산억제 효과를 측정한 결과를 나타내고,

제10도는 분방기 추출물 A에 의한 사람 단핵구/대식세포의 반응성 산소 생산의 억제 효과를 측정한 결과를 나타내고,

제11도는 분방기 추출물 A, B, C 및 D에 의한 흰쥐 간경변 모델의 혈청 GOT 및 GPT 억제 효과를 측정한 결과를 나타내고,

제12도는 분방기 추출물 A, B, C 및 D에 의한 흰쥐의 간경변 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸다.

본 발명은 분방기(Stephania tetrandra S. Moore) 추출물(extract), 이들의 제조 방법 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 분방기의 뿌리에서 분리한 여러 가지 추출물(extract), 분방기의 뿌리를 여러 가지 용매로 추출하는 과정을 포함하는 상기 추출물의 제조 방법, 및 상기 추출물을 유효량 포함하는, 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6)의 과잉생산으로 인한 면역질환을 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.

방기과에 속하는 천금동(Stephania japonica Miers), 한방기(Sinomenium acutum Rehd, et Wils)등은 우리나라의 남부지방과 제주도 등지에서 서식하며 과거로부터 진통제, 항염증제로 사용되어 왔으나 분방기는 우리나라에 서식하지 않고 주로 중국 등지에서 신경통, 관절염 등의 치료에 사용되어 왔고 특히 알칼로이드(alkaloid)인 테트란드린(tetrandrine)은 항염증제, 항고혈압제 등으로 사용되어 왔다. 또한, 식작용 저지성(anti-phagocytic) 효과 및 산화 방지제(anti-oxidant) 효과를 갖고 있으며(Seow, W.K, et al., Int. Archs Allergy Appl. Immun., 85, 404(1988)), 임상 및 실험 규폐증 모델에서도 치료효과를 보였고(Li, Q. et al., Chinese J. Tuberc. Resp. Dis., 4, 321(1981); Xu, X. et al., Ecotoxicol. Environ. Safety, 7, 306(1983); Liu B. et al., Ecotoxicol. Environ. Safety, 7, 323(19830), 사람의 단핵세포로 부터 분비되는 인터루킨-1(interleukin-1)과 종양 괴사 인자-알파(tumor necrosis factor-α)의 생산도 억제시키는 것으로 알려져 왔다(Seow, W.K., et al., Clin. Exp. Immunol., 75, 47(1989); Ferrante, A., et al., Clin. Exp. Immunol., 80, 232(1990)). 한편 테트란드린 혹은 이의 유도체를 포함한 물질들도 뇌기능을 증진시키고 말라리아 치료제, 머리카락 성장제등으로 개발되어 보고되었다.

인터루킨-6은 인체 면역체계를 이루는 여러 세포간의 성장, 분화, 활성화에 관여하는 조절인자로서 여러 가지 다양한 세포에서 생산되어 인체의 방어기작에 중요한 역할을 한다(Hirano, T., et al., Immunol. Today, 11, 443(1990)). 인터루킨-6은 원래 단핵세포의 배양액에서 발견된 인자로서 B 세포의 항체 생산을 유도하는 기능이 있음이 보고되었고(Muraguchi, A., et al., J. Immunol., 127, 412(1981)), 1986년 인체 인터루킨-6의 cDNA가 클로닝되었다(Hirano, T., et al., Nature, 324, 73(1986)). 그 후 밝혀진 인터루킨-6의 기능으로는, (1) B 세포 하이브리도마(hybridoma)와 형질세포종(plasmocytoma)의 성장인자(Snick, V.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, 9679(1986)), (2) T 세포의 활성화 및 성장 효과(Lotz, M., et al., J. Exp. Med., 167, 1253(1988)), (3) 간세포의 급성 단계 반응(acute phase response)을 유도하는 기능(Geiger, T., et al., Eur. J. Immunol., 18, 717(1988)), (4) 조혈작용(hematopoiesis)에 관여하는 인자(Koike, K., et al., J. Exp. Med., 168, 879(1988)). (5) 신경계통의 세포들의 분화 효과(Satoh, T., Mol. Cell. Biol., 8, 3546(1988)), (6) 각질형성세포(keratinocyte)의 성장 효과, (7) 뼈의 신진대사(metabolism)의 조절 작용, (8) 콩팥 사구체간질(mesangial) 세포들의 성장 효과, (9) 악성흑색종(melanoma)과 유방암 세포의 성장을 저해하는 효과 등이 있다.

이렇게 인체의 여러 기능을 조절하는 인터루킨-6는 다양한 기관의 여러 세포들로부터 분비되고 있는데 특히 이들의 생산이 잘못 조절되면 여러 가지 질병을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이러한 질병으로는 류마티스 관절염(Hirano, T., et al., Eur. J. Immunol., 18, 1797(1988)), 간경변(Deviere, J., et al., Clin. Exp. Immunol., 77, 221(1989)), 건선 피부병(Grossman, R.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86, 6367(1989)), 다발성 골수종(Bataille, R., et al., J. Clin. Invest., 84, 2008(1989)), 카디악 믹소마(cardiac myxoma), 에이즈(Miles, S.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 4068(1990)) 및 기타 여러 자가면역 질환들이 알려져 있다.

이와 같이 인체 여러 기관에서 중요한 역할을 담당하고 있는 인터루킨-6의 기능 및 생산조절은 인체내의 면역체계의 항상성 유지와 질병치료 및 예방에도 매우 중요하다. 이와 유사한 인자인 인터루킨이나 성장 호르몬을 효과적으로 조절하기 위해 여러가지 접근 방법이 시도되어 왔다. 예를 들면, 인터루킨-6에 대한 항체나 인터루킨-6 수용체에 대한 항체를 이용하여 인터루킨-6의 과다분비로 인한 골수종 환자의 골수세포 증식을 억제하였다(Suzuki, H., Eur. J. Immuno., 22, 1989(1992)). 그러나, 인터루킨-6의 생산 자체를 특이하게 억제할 수 있는 물질이나 방법은 아직까지 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 기존에 인체의 질병치료에 사용되어 온 식물체로부터 인터루킨-6의 생산을 억제하는 물질을 탐색하기 위해 연구를 계속한 결과, 분방기 추출물이 탁월한 인터루킨-6 생산 억제 효과를 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 인터루킨-6의 생산을 특이적으로 억제하는 저해물질 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인터루킨-6의 과잉생산으로 인한 면역 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 인터루킨-6의 생산을 억제함으로써 인터루킨-6 과잉 생산으로 인한 면역질환의 치료에 유용한 분방기(Stephania tetrandra S. Moore) 추출물, 및 분방기의 뿌리를 메탄올 또는 에탄올로 추출하여 메탄올 또는 에탄올 추출물을 제조하거나; 상기 메탄올 추출물을 메탄올과 헥산으로 추출하여 얻은 메탄올층으로부터 메탄올을 제거한 후 pH를 9 내지 11로 조절하고, 증류수와 CH₂Cl₂로 분획한 후 CH₂Cl₂층을 분리하여 알칼로이드 분획 추출물을 제조하거나; 상기 분방기의 뿌리를 증류수 또는 생리식염수로 추출하여 증류수 추출물을 제조하는 것을 특징으로 하는, 분방기 추출물의 제조방법이 제공된다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 분방기 뿌리 추출물을 유효량 포함하는, 인터루킨-6 과잉생산으로 인한 면역질환의 치료에 유용한 약학적 조성물이 제공된다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 인터루킨-6의 생산을 억제하여 항염증 효과, 항섬유화 효과 등을 나타냄으로써 인터루킨-6 생산의 이상으로 인해 발생하는 여러 면역질환의 치료제로 사용될 수 있는 분방기 추출물 및 이의 제조방법을 제공한다.

상기 분방기 추출물은 분방기의 뿌리로부터 여러가지 용매, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 헥산, CH₂Cl₂또는 이들의 혼합물, 생리식염수, 증류수 등의 수용액을 사용하여 추출할 수 있다.

예를 들면, 여러가지 용매를 사용하여 각각 그 효과를 갖는 분방기 추출물 A, B, C 및 D를 다음과 같은 방법으로 제조할 수 있다.

즉, 건조된 분방기 뿌리 1㎏ 중량당 1 내지 3ℓ, 바람직하게는 2ℓ의 메탄올을 첨가하여 50 내지 70℃의 수욕내에서, 또는 실온에서 4시간 이상 추출하는 과정을 1회 이상, 바람직하게는 3회 반복한 후 감압농축 단계를 거쳐 추출물 A를 얻는다.

상기 추출물 A 100g을 200 내지 400㎖, 바람직하게는 250㎖의 메탄올과 200 내지 400㎖, 바람직하게는 250㎖의 헥산으로 분획하여 메탄올층을 얻은 후 감압농축하여 메탄올을 제거하고 수산화암모늄 또는 수산화나트륨으로 pH를 9 내지 11로 조절한다. 이를 400 내지 800㎖, 바람직하게는 500㎖의 증류수:CH₂Cl₂혼합액(1:1(v/v))으로 분획하여 CH₂Cl₂층, 즉 알칼로이드 분획을 분리한 후 감압농축하여 추출물 B를 얻는다.

한편, 건조된 분방기 뿌리 1㎏을 파쇄하여 여과한 후 멸균된 증류수 또는 생리식염수 등의 수용액으로 50 내지 20㎎/㎖, 바람직하게는 100㎎/㎖의 농도가 되도록 현탁한다. 생성된 현탁액을 80 내지 100℃, 바람직하게는 95℃에서 4 내지 12시간, 바람직하게는 6시간 동안 중탕한 후 여과하고 감압농축하여 추출물 C를 얻는다. 다른 방법으로는, 건조된 분방기 뿌리 1㎏을 1 내지 3ℓ, 바람직하게는 2ℓ의 증류수와 혼합하여 80 내지 100℃, 바람직하게는 95℃로 4 내지 12시간, 바람직하게는 12시간 동안 가열한 후 여과하고 감압농축시킨 다음, -70 내지 -90℃, 바람직하게는 -80℃에서 2 내지 10시간, 바람직하게는 8시간 동안 방치하고 4 내지 8시간, 바람직하게는 6시간 동안 동결건조시킴으로써 분말상의 분방기 추출물 C를 얻는다.

추출물 D는 건조된 분방기 뿌리 1㎏ 중량당 1 내지 3ℓ, 바람직하게는 2ℓ의 에탄올을 첨가한 후 60 내지 90℃의 수욕내에서, 또는 실온에서 4시간 이상 추출하는 과정을 1회 이상, 바람직하게는 3회 반복한 후 감압농축 단계를 거쳐 얻는다.

상기 추출물 A, B, C 및 D는 콜라겐 합성 억제 효과, 항염증 효과, 항섬유화 효과, 반응성 산소 생산 억제 효과, 및 혈청 GOT 및 GPT 억제 효과를 나타내므로, 각각 또는 혼합하여 인터루킨-6의 과잉생산으로 인한 면역질환, 예를 들면, 류마티스 관절염, 간경변, 건선 피부병, 다발성 골수종, 카디악 믹소마, 규폐증, 또는 에이즈(AIDS)를 치료하기 위한 약학적 조성물에 사용될 수 있다. 상기 추출물 A는 특히 염증질환, 관절염, 섬유화 질환의 치료에, 추출물 B는 특히 관절염, 자가면역 간경변 질환의 치료에, 추출물 C는 특히 규폐증, 간섬유화 질환의 치료에, 추출물 D는 간경변 질환의 치료에 더욱 효과적이다.

이러한 약학적 조성물은 활성 성분으로서의 분방기 추출물과 함께 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제 등을 포함할 수 있으며, 상기 조성물의 제제는 쉽게 입수할 수 있는 성분들을 이용하여 공지의 방법에 따라 제조할 수 있다. 제제의 제조시에는, 활성 성분을 담체와 혼합하거나, 담체로 희석하거나, 캡슐, 사셰, 종이 또는 다른 용기의 형태인 담체 내에 담을 수 있다. 담체가 희석제의 역할을 할 경우에는, 활성 성분을 위한 비히클, 부형제 또는 매질로 작용하는 고체, 반고체 또는 액체 물질일 수 있다. 따라서, 제제는 정제, 환제, 분말제, 사셰, 엘릭서, 현탁액, 유화액, 용액, 시럽, 에어로졸(고체로서 또는 액체 매질중의 것), 연질 및 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사 용액, 멸균 포장된 분말제 등의 형태일 수 있다.

적당한 담체, 부형제 및 희석제의 예는 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 물, 시럽, 메틸 셀룰로즈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 및 미네랄 오일 등이다. 조성물은 상기 성분들 외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 환자에게 투여된 후 활성 성분을 급속하게, 지속적으로 또는 지연시켜 방출하도록 당분야의 공지 기술들을 이용하여 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있고, 1 내지 500㎍/㎏ 체중/일, 바람직하게는 30 내지 300㎍/㎏ 체중/일의 활성 성분이 되도록 1일 1회 이상 투여할 수 있으나, 상기 투여량은 치료될 질환, 투여 경로, 환자의 나이, 성별, 체중 및 증상의 중증도를 포함하는 관련된 조건에 따라 적절히 조절될 수 있으며, 따라서, 상기 투여량 범위는 어느 면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 하기 제조예 및 실시예에 의해 구체적으로 설명하고자 하나 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.

[제조예: 분방기 추출물의 제조]

잘 건조된 분방기의 뿌리(약 4.0㎏)를 가늘게 썰고 실온에서 메탄올 약 5ℓ로 이틀씩 3회 반복 추출한 후 감압농축하여 메탄올 추출물(추출물 A) 약 224g을 얻었다(수율 5.6%).

추출물 A 200g을 90% 메탄올(500㎖)과 n-헥산(500㎖)으로 분획하여 90% 메탄올층을 얻었고, 이것을 감압농축기에서 감압농축하여 메탄올을 제거하고 0.1M NH₄OH로 pH를 10으로 조절한 후 증류수(300㎖)와 CH₂Cl₂(300㎖)의 혼합용액으로 분획하여 CH₂Cl₂층, 즉, 알칼로이드 분획을 분리한 후 감압농축하여 분방기 추출물 B 25g을 얻었다(수율 0.6%).

한편, 규폐증 치료효과 실험에 사용할 분방기 추출물은 다음과 같이 제조하였다. 건조된 분방기의 뿌리 1㎏을 파쇄하여 분말로 만든 다음 가는 메쉬(60 메쉬)를 이용하여 여과하고 멸균된 생리 식염수로 100㎎/㎖ 농도로 현탁시켰다. 생성된 현탁액을 100℃에서 6시간 동안 중탕한 후 여과하고 감압농축하여 분방기 증류수 추출물(추출물 C) 80g(수율: 8%)을 얻고 이를 -20℃에서 보관하면서 사용하였다. 간경변 치료효과 실험에 사용할 경우에는 분방기 1113.5g을 3ℓ용량의 둥근 플라스크에 넣고 2ℓ의 증류수를 가한 다음 냉각기를 부착시키고 95℃에서 12시간 동안 가열한 후 추출물을 여과하였다. 이를 회전식 진공 증발기(rotary vacuum evaporator, Buchi 451)에서 감압농축시키고, 농축 플라스크를 -84℃의 딥 프리저(deep freezer, SANYO, Japan)에 3시간 동안 얼린 후 동결건조기(EYELA, Japan)로 4시간 동안 동결건조하여 56.55g의 분말을 얻었다.

잘 건조된 분방기의 뿌리(약 500g)를 실온에서 에탄올 약 1.5ℓ로 이틀씩 3회 반복 추출한 후 감압농축하여 에탄올 추출물(추출물 D) 약 13g을 얻었다(수율 2.6%).

[참조예 1: 검정용 세포의 분리]

(1) 사람의 단핵구, 대식세포 및 호중구의 분리

사람의 단핵구, 대식세포 및 호중구를 얻기 위해, 헤파린 처리한 정상인의 말초혈액을 행크 염수용액(Hank's balanced salt solution(HBSS): Mg⁺⁺및 Ca⁺⁺free)으로 2배 희석하여 밀도 1.077의 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)를 밀도 1.119의 피콜-하이파크 위에 중층한 원심분리관에 넣은 후 실온에서 700g로 30분 동안 원심분리하여 단핵구(mononuclear cell, MNC, 밀도 1.077과 혈장사이의 층)와 호중구(밀도 1.077과 1.119 사이의 층)를 얻었다. 분리된 세포를 4℃ HBSS(Ca⁺⁺, Mg⁺⁺free)로 2회 세척하고 10% 소태아혈청(FBS, Hyclone, Logan, Utah)을 함유한 RPMI 1640(Gibco, Grand Island, NY) 배지에 부유시켜 24-웰 배양 플레이트(Costar, Cambridge, MA)의 각 웰에 넣고 37℃로 2시간 동안 배양함으로써 단핵구 및 대식세포를 얻었다.

(2) 섬유아세포의 분리

흰쥐로부터 섬유아세토를 분리하기 위하여 문헌의 방법(Phan, S. H., et al., J. Clin. Invest., 76, 241(1985))을 약간 변형시켜 사용하였다. 흰쥐를 에테르로 마취시킨 후 복부를 절개하고 폐장을 적출하여 무균 작업대에서 불필요한 조직을 제거하였다. 폐장을 2~4㎜ 크기로 잘게 자른 후 콜라게나제와 0.5% 트립신이 함유된 인산염 완충액(PBS)에 부유시켜 37℃에서 약 2시간 동안 조직을 소화시킨 후 멸균된 거즈에 여과하여 소화되지 않은 조직 등을 제거하였다. 이렇게 분리된 세포들을 PBS로 2~3회 세척하고 10% FBS가 함유된 RPMI 1640 배지에 부유시켜 배양 플레이트에 넣고 37℃, 5% CO₂배양기(Lunaire Environ, Inc., Pennsylvania, USA)에서 1~2일 동안 배양하였다. 플레이트에 부착되지 않은 세포를 제거하고 새로운 배지를 가하여 세포가 빈틈없이 찰(confluent)때까지 배양하였다. 이들 세포는 계대배양 5회 이내의 세포를 실험에 사용하였다. 또한 NIH3T3 섬유아세포도 10% FBS가 함유된 RPMI 1640 배지에서 같은 조건으로 배양하였다.

(3) 류마티스 관절염 환자의 활막세포의 분리

류마티스 관절염 환자의 활막세포를 얻기 위해 먼저 환자의 활막조직을 차가운 PBS로 3회 세척한 후 멸균가위로 2㎜ 크기로 잘게 자르고 콜라게나제 A(5㎎/㎖, BM)와 DN아제(DNase) 타입 I(0.15㎎/㎖, Sigma)이 포함된 DMEM(Sigma, U.S.A.)에 부유시켜 37℃, 5% CO₂배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후 0.5% 트립신-0.2% EDTA를 가하여 30분간 더 배양하였다. 이렇게 용해시킨 조직을 PBS로 2회 세척하고 DMEM으로 1회 더 세척하여 분리된 세포를 10% FBS가 함유된 DMEM(DMEM-10% FBS)에 부유시켜 1주일 동안 배양하였다. 그 후 활액 부착 세포(synovial adherent cell)를 트립신-EDTA로 분리하여 세척하고 DMEM-5% FBS에 ㎖당 10⁵세포로 부유시켜 24웰 배양 플레이트의 각 웰에 각각 1㎖씩 가하였다. 이를 37℃에서 24시간 동안 배양한 배양액을 -20℃에 보관하면서 다음 실험에 사용하였고, 일부는 계대하여 얼려서 액체질소 탱크에 보관하면서 실험에 사용하였다.

(4) 분방기 추출물을 사용한 세포처리 방법

이상의 세포들로부터 분방기 추출물을 처리한 세포 배양액을 얻기 위하여 5×10⁵/㎖의 세포에 여러 농도의 분방기 추출물을 가하고 1시간 동안 37℃, 5% CO₂배양기에서 전배양한 후, 실리카(silica) 100㎍/㎖ 및, FBS의 최종농도를 2%로 한 RPMI 1640 배지를 각각 1㎖씩 가하여 동일한 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 상층액을 회수한 후 1,500rpm으로 10분간 원심분리하여 세포 및 실리카 등을 제거하고 투석(dialysis)한 다음 0.2㎛ 여과 주사기로 여과하여 여과액을 -20℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.

[참조예 2: 분방기 추출물의 세포독성 검정]

세포 배양액에 대한 분방기 추출액의 독성실험은 다음과 같이 실시하였다. 즉, 참조예 1의 (4)의 방법에 따라, 참조예 1의 (1)에서와 같은 방법으로 얻은 단핵구 및 대식세포(5×10⁵/㎖)를 각가 0.1, 1 및 100㎍/㎖의 제조예에서 얻은 추출물 A 및 B로 처리한 후 배양하였다. 배양 플레이트의 각 웰에 배양액 1㎖를 넣고, 앨리(Alley)등의 방법(Alley, M.C., et al., Cancer Res., 48, 589(1988))에 따라 3-4,5-디메틸티아졸-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드(MTT, Sigma)를 0.5㎎/웰씩 가하여 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 상층액을 버리고 100㎕씩의 산성화된 이소프로판올(이소프로판올 중의 0.04N HCl)을 각 웰에 가하여 생존한 세포로부터 형성된 포르마잔(formazan)을 용출시킨 뒤 ELISA 리더(Titertek multiskan Mcc/340)로 540㎚에서 광학 밀도(O.D.) 값을 측정하였다(제1도). 제1도는 추출물 A 또는 B를 처리하지 않은 대조군의 광학밀도를 100%로 했을 때, 처리된 추출물의 농도에 따른 광학밀도를 백분률로 환산하여 나타낸 것이다. 분방기 추출물의 독성으로 인해 단핵구 및 대식세포의 생존률이 저하될 경우 MTT에 의해 형성되는 포르마잔의 양이 감소되어 광학밀도 역시 감소하게 되는데, 추출물 A의 경우 10㎍/㎖ 농도까지 배지만으로 처리한 대조군과 아무런 차이가 없어 적어도 이 농도까지는 세포독성이 없는 것을 확인할 수 있었고, 추출물 B의 경우도 유사한 결과를 얻을 수 있어 모든 실험을 이 농도 범위안에서 수행하였다. 100㎍/㎖의 농도에서는 A, B 모두 세포 독성을 나타내었다.

한편, 추출물 C 및 D의 세포독성은 흰쥐를 이용한 동물실험에 의해 조사하였는데, 40㎎의 추출물 C 또는 D를 17주 동안 매주 2회씩 경구투여했을 때 동물에 대한 독성(사망, 체중감소 등)은 나타나지 않았다.

[실시예 1]

[분방기 추출물에 의한 사람 단핵구/대식세포의 인터루킨-6 생산 억제]

참조예 1의 (1)에서 얻은 단핵구/대식세포를 0.1~10㎍/㎖의 분방기 추출물 A 또는 B와 함께 1시간 동안 배양하고 100㎍/㎖의 실리카로 48시간 동안 처리한 후 원심분리하여 배양 상층액을 얻었다. 배양 상층액을 다시 PBS로 투석한 후 인터루킨-6 의존성인 B9 하이브리도마 세포주를 이용하여 인터루킨-6 활성도를 측정하였다. 즉, 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지와 2U/㎖의 재조합 인체 인터루킨-6로 배양한 B9 세포주(Dr. Kishimoto, T., Osaka 대학, 일본)를 무혈청 배지로 3회 세척하고 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지로 5 × 10⁴세포/㎖로 현탁하여 96 웰 배양 플레이트에 웰당 100㎕씩 넣고, 상기 투석액 100㎕를 가한 후 37℃, 5% CO₂하에서 68시간 동안 배양하였다. 그 다음 0.5μCi의³H-티미딘을 50㎕씩 각 웰에 가하고 4시간 더 배양한 후 다중 세포 수확기(multiple cell harvester; Inotech)로 유리 섬유 여과지에 회수하여 액체 신틸레이션 계수기(liquid scintillation counter; Beckman)로³H-티미딘의 혼입량을 측정하였다. 이때, 재조합 인터루킨-6를 모든 분석에 내부 대조구로 사용하였으며 최대치의 50% 증식을 일으키는 농도를 1 단위로 정의하였다. 단핵구/대식세포로부터 분비되는 인터루킨-6는 농도의존적으로 분방기 추출물 A와 B에 의해 저해되고 10㎍/㎖에서 약 50% 이상 생산이 억제됨을 알 수 있었다(제2도).

[실시예 2]

[분방기 추출물에 의한 흰쥐 폐 대식세포의 인터루킨-6 생산 억제]

인터루킨-6 생산 억제 효과를 동물 대식세포에서 측정하기 위하여, 흰쥐를 케타민으로 마취시킨 후 기관지에 멸균된 가는 튜브를 꽂아 넣고 30㎖ 주사기를 이용하여 RPMI 1640 배지를 10㎖씩 3회 반복하여 주입 및 흡입시켜 폐 대식세포를 얻었다. 이 세포들을 400xg에서 5분 동안 원심분리한 후 침전물을 10% FBS가 들어있는 RPMI 1640 배지 50㎖에 현탁시키고 37℃에서 2시간 동안 배양하여 부착시킨 다음 PBS로 2회 세척하여 폐 림프구세포(부유세포)를 제거하고 폐 대식세포를 분리하였다. 24웰 배양 플레이트의 각 웰에 2 x 10⁵의 폐 대식세포를 넣고 100㎍/㎖ 실리카와 100㎍/㎖의 분방기 추출물 A로 3일간 처리한 후 원심분리하여 배양상층액을 얻었다. 배양상층액을 PBS로 투석한후, 실시예 1에서와 같은 방법으로 인터루킨-6 의존성인 B9 하이브리도마 세포주를 이용하여 인터루킨-6 의 활성도를 측정한 결과, 흰쥐 폐 대식세포에서 분비되는 인터루킨-6 도 분방기 추출물 A에 의해 억제됨을 관측할 수 있었다(제3도). 제3도에서, med, Si, Si+EXT. A는 각각 아무런 처리를 하지 않은 시료, 실리카 자극만 한 시료, 및 실리카 자극과 분방기 추출물 A 처리를 모두 거친 시료를 나타낸다.

[실시예 3]

[분방기 추출물에 의한 인터루킨-6 생산억제]

분방기 추출물에 의한 인터루킨-6 생산 억제효과를 동물 모델에서 확인하기 위해 처리군당 각각 흰쥐(Sprague-Dawley, 체중 약 150g) 5마리의 기관지를 노출시킨 후 0.5㎖의 멸균된 생리식염수(PBS)에 녹인 실리카 500㎎을 기관지내로 주입시켜 실험규폐증 모델을 만들었다. 상기 쥐들에게 실리카를 주입한지 1주일후부터 분방기 추출물 C를 각각 40㎎씩 매주 2회 17주 동안 경구 투여하거나, 생쥐 인터루킨-6 항체(MIL-6 Ab, Immunex 사, Seatle, U.S.A.) 250㎍씩을 매주 2회씩 17주 동안 정맥 또는 복강주사한 후 실시예 1에서와 같은 방법으로 혈청에서의 인터루킨-6 활성도를 살펴보고(제4도), 참조예 1의 (2)에서 분리한 폐 섬유아세포 배양액에서의 인터루킨-6 활성도를 살펴 보았는데(제5도), 각 경우 모두 추출물 C에 의해 인터루킨-6의 활성이 저해되어 동물모델에서도 그 효과를 확인할 수 있었다. 제4도 및 제5도에서, normal은 PBS만을 투여한 시료, si는 실리카 자극만을 한 시료, si+EXT.C는 실리카 자극 후 추출물 C를 처리한 시료, si+MIL-6 Ab는 실리카 자극 후 MIL-6 Ab를 처리한 시료를 각각 나타낸다.

[실시예 4]

[분방기 추출물에 의한 인터루킨-6 유전자 발현 억제]

분방기 추출물이 인터루킨-6 유전자의 발현을 억제하는가를 조사하기 위해 인터루킨-6의 과다분비로 인해 발생하는 류머티스 관절염(Hirano, T., et al., Eur. J. Immunol., 18, 1797(1988))의 중요 세포인 활막세포에 대한 추출물의 처리효과를 측정하였다.

우선, 6개의 웰에 활막세포를 각 웰당 1.5 x 10⁶세포씩 넣고, 37℃, 5% CO₂조건하에서 24시간 동안 배양하여 활막세포를 각 웰에 부착시켰다. 분방기 추출물 B를 각각 1㎍/㎖ 및 10㎍/㎖ 농도로 각 웰에 처리한 후, 37℃, 5% CO₂조건으로 3일간 배양하였다. 3일 후 배양액을 원심분리하여 상층액을 제거하고 침전된 세포를 PBS로 1회 세척한 후, 변성 용액(4M 구아니디늄 티오시아네이트, 25mM 소듐 시트레이트 pH 7.0, 0.1M 2-머캅토에탄올, 0.5% 사르코실) 500㎕를 각 웰에 넣고 부드럽게 피펫팅하여 세포를 깨고 용액을 튜브로 옮겼다. 각 튜브에 50㎕의 2M 소듐 시트레이트(pH 4.0)를 넣고 섞은 후 500㎕의 수-포화된 페놀(water-saturated phenol)을 가하여 잘 섞었다. 그 후 2배 부피의 클로로포름을 넣고 잘 섞은 후 얼음에 10분간 방치하고 12,000rpm으로 원심분리하여 상층액을 취했다. 상층액에 1㎖의 이소프로필 알콜을 넣고 -20℃에서 2시간 동안 방치한 후 12,000rpm에서 20분간 원심분리하여 침전된 펠렛을 얻었다. 펠렛을 70% 메탄올로 세척하고 건조시킨 후에 20㎕의 0.1% 디에틸 피로카보네이트(diethyl pyrocarbonate)-물을 넣고 작 녹였다(최종농도 10㎍/㎖).

이와 같이 얻은 RNA로부터 외가닥 cDNA를 합성하기 위해 M-MLV 역전사효소(Promega, U.S.A)를 사용하여 다음과 같이 역전사 반응을 수행하였다. 반응 튜브에 5㎕의 5배 농도 반응 완충용액(250mM Tris-HCl, pH 8.3, 375mM KCl, 15mM MgCl₂, 50mM DTT), 2㎕의 5μM dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 각각 5μM), 1㎕(0.2㎍)의 프라이머 Not I-dT(5'-dCGCCGGCG(T)₁₈-3'), 1㎕의 증류수, 10㎕의 상기 세포 RNA 및 1㎕(200U)의 M-MLV 역전사효소(Promega, U.S.A)를 넣고 잘 혼합한 후, 42℃에서 30분간 반응시켰다. 90℃에서 5분간 가열하여 반응을 정지시켰다.

상기 역전사효소 반응결과물을 이용하여 다음과 같이 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 즉, 20㎕의 상기 역전사효소 반응 결과물, 8㎕의 10배 농도 PCR 완충용액(10mM Tris-HCl, pH 8.3, 400mM KCl, 10mM DTT, 15mM MgCl₂, 5㎕/㎖ BSA), 1㎕(20pmol)의 5'-말단 프라이머(5'-ATGAACTCCTT-CTCCACAAGCGC-3'), 1㎕(20pmol)의 3'-말단 프라이머(5'-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3'), 69㎕의 증류수 및 1㎕(2.5U)의 Taq DNA 중합효소(Promega, U.S.A.)를 잘 혼합하고, 95℃에서 5분간 방치하여 다른 효소활성을 저해시킨 후, 95℃에서 1분 30초, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초를 반복하는 PCR 사이클을 30회 수행하고 마지막으로 95℃에서 1분 30초, 55℃에서 1분, 72℃에서 5분간 반응시켰다. 이렇게 얻은 반응물 10㎕를 1.0% 아가로스 겔에서 30분간 100V로 전기영동하였다. 전기영동된 겔을 EtBr 용액에서 10분간 염색하고 증류수로 세척한 후 사진을 찍은 결과(제6도), 대조군으로 사용된, 일정하게 발현되는 아데닌 포스포리보실 전이효소(adenine phosphoribosyl transferase, APRT) RNA의 경우에는 분방기 추출물에 의해 변화가 없었으나 인터루킨-6의 경우 10㎍/㎖에서 현저히 RNA 발현이 억제되므로 분방기 추출물이 인터루킨-6 유전자의 발현을 저해함을 알 수 있었다. 제6도에서, M열은 표준 DNA 크기 표지이고, 10, 1, 0은 각각 분방기 추출물 B의 농도(㎍/㎖)를 나타낸다.

[실시예 5]

[분방기 추출물에 의한 관절염 활막세포 증식 억제]

분방기 추출물에 의한 관절염 활막세포의 증식억제 효과를 다음과 같이 측정하였다. 분방기 추출물 A를 0.1 내지 100㎍/㎖의 농도로 사람의 단핵구/대식세포에 처리한 후 그 배양액을 PBS로 투석하여 1 x 10⁴의 활막세포에 넣고 5일 동안 배양시켰다. 배양액에³H-티미딘을 첨가하여 4시간 동안 배양한 후 액체 신틸레이션 계수기로 세포에 함입된 양을 측정하였다(제7도). 분방기 추출물은 10㎍/㎖의 농도에서 활막세포의 증식을 현저히 억제하였다.

[실시예 6]

[분방기 추출물에 의한 콜라겐 합성 억제]

인터루킨-6는 섬유화를 일으키는 사이토카인으로 알려져 있으며 흰쥐 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 유도한다(Kang, H. S., et al., Korean. J. Immunol., 14, 193(1992)). 따라서, 분방기 추출물이 이러한 인터루킨-6의 작용을 억제할 수 있는가를 알아보기 위해, 흰쥐 폐 섬유 아세포 및 폐 조직의 콜라겐 합성 저해효과를 측정하였다. 콜라겐의 생성량은 폐 섬유아세포 배양액의 경우에는 간접 효소면역측정법(indirect ELISA)으로 측정하고, 폐 조직의 경우에는 하이드록시 프롤린의 농도를 측정하여 내부 대조군의 표준곡선으로부터 정량하였다.

먼저, 흰쥐 폐 섬유아세포의 배양액내에서의 콜라겐 생성량을 확인하기 위해 내부 대조군으로서 콜라겐(Sigma, type I)을 1㎎/㎖의 펩신이 포함된 1M 아세트산에 완전히 용해시킨 다음 피복 완충액(0.05M 탄산염 완충액, pH 9.6)으로 1㎍-16pg 까지 5배 연속 희석하여 바닥이 평평한 미세역가판(Dynatech, Immulon 2)의 각 웰에 100㎕씩 가하고 미량원심분리관에 들어 있는 참조예 1의 (2)에서 얻은 흰쥐 폐 섬유아세포 배양액을 스피드백 건조기(speed vac dryer; Savant)로 약 10~20배 농축시킨 다음, 피복 완충액(0.1M NaHCO₃, 0.02% NaN₃; Na₂CO₃로 pH를 0.6으로 조정) 100㎕를 가하여 완전히 녹이고 4℃에서 밤새 피복시켰다. 그 후 세척 완충액(PBS, 0.05% 트윈 20, pH 7.4)으로 3회 세척한다음 1% 소혈청 알부민(BSA, Sigma) 100㎕씩을 각 웰에 가하여 상온에서 2시간 동안 피복되지 않은 부분을 차단하였다. 이를 다시 동일 완충액으로 4회 세척한 후 희석 완충액(0.05M Tris-HCl, 1mM MgCl₂ㆍ6H₂O, 0.15M NaCl, 0.02% NaN₃, 1% BSA, 0.05% 트윈 20, pH 8.1)으로 1,000배 희석된 알칼라인 포스파타제가 결합된 토끼 항-염소 IgG(Cappel)를 100㎕씩 각 웰에 가한 후 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이를 다시 동일 완충액으로 3회 세척한 후 기질 완충액(0.05M NaHCO₃, 10mM MgCl₂ㆍ6H₂O, pH 9.8)에 1㎎/㎖로 녹인 p-니트로페닐포스페이트를 100㎕씩 가하고 ELISA 리더를 사용하여 405㎚에서 O.D. 를 측정하였으며, 이 배양액내의 콜라겐 합성량을 내부 대조군과 비교하여 정량하였다. 그 결과, 10㎍/㎖의 분방기 추출물 A로 37℃에서 1시간 동안 전처리한 후 100㎍/㎖의 실리카로 48시간 동안 처리한 흰쥐 폐 섬유아세포 배양액에서 콜라겐 분비가 현저히 감소됨을 관측할 수 있었다(제8도). 제8도에서, si+PBS는 실리카 자극만을 한 시료를 나타내고, si+EXT.A는 분방기 추출물 A로 처리한 후 실리카로 자극한 시료를 나타낸다.

또한, 실시예 3에서와 같이 흰쥐의 기관지를 노출시킨 후 500㎎의 실리카를 기관지내로 주입시키고 40㎎의 분방기 추출물 C를 1% DMSO에 용해시킨 용액 또는 1% DMSO 단독을 매주 2회씩 17주 동안 경구투여한 흰쥐의 폐 조직에서 콜라겐 합성량을 측정하기 위해서 하이드록시 프롤린의 양을 측정하였는데, 흰쥐에서 떼어낸 폐조직 0.1~0.2g을 파이렉스관(Corning)에서 PBS 1㎖와 섞어 파쇄한 다음, 조직 추출물을 초음파 파쇄기(Heat system, W-380)로 파쇄한 후 하이드로크론산(hydrochronic acid) 원액 1㎖를 가하고 120℃ 건조 오븐에서 하룻밤동안 건조시켰다. 그 후 이를 냉동기에서 충분히 얼리고 동결건조기(Labconco)로 동결건조시킨 다음 증류수 1㎖를 가하여 완전용해시키고 그 중 50㎕를 미량 원심분리관에 가하고 다시 50㎕의 증류수로 혼합 희석하였다. 이때 내부 대조군으로서 트랜스-γ-하이드록시-L-프롤린(Sigma)을 20㎍~150pg까지 증류수로 2배 연속 희석하여 100㎕씩 미량 원심분리관에 가하였다. 다음으로 클로라민-T(sodium N-chloro-P-toluene sulfonamide) 1.41g을 10㎖의 n-프로판올과 10㎖의 증류수로 녹여 만든 용액 0.9㎖를 가하고 실온에서 20분동안 방치하였다. 그 후, 62㎖의 n-프로판올에 15g의 p-디메틸 아미노벤즈알데히드(p-dimethyl aminobenzaldehyde)를 녹이고 60% 과염소산(perchloric acid) 26㎖를 천천히 가하여 총 부피를 100㎖로 만든 알데히드/과염소산(aldehyde/perchloric acid) 용액 1㎖를 상기 혼합물에 가하고 잘 섞었다. 미량 원심분리관을 65℃ 항온수조에 15분 동안 넣어 발색시키고 650㎚에서 O.D.를 측정하여 내부 대조군으로부터 구한 표준곡선을 이용하여 하이드록시 프롤린을 정량하였다. 그 결과는 제9도에 나타내었으며, 아무것도 처리하지 않은 정상적인 흰쥐의 폐조직(normal)에서 생성된 콜라겐의 양을 100%로 정했을 때, 실리카만을 처리하거나(si) 실리카 또는 분방기 추출물 C의 용매가 되는 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)와 실리카를 함께 처리한 흰쥐의 폐 조직(si+DMSO)에서는 콜라겐 생성량이 현저하게 높았으나, DMSO, 실리카 및 분방기 추출물 C를 투여한 흰쥐의 폐조직(si+EXT. C)에서는 콜라겐 생성량이 약 50% 감소되었고, 위의 결과로부터 분방기 추출물이 항섬유화 효과를 가진다는 것을 알 수 있었다.

[실시예 7]

[분방기 추출물을 이용한 반응성 산소의 생산 억제]

염증 반응은 여러 가지 자극원들에 의해 면역 세포들이 인터루킨-6 등 여러가지 사이토카인을 분비하고 이들이 다시 다른 염증 세포들을 자극하여 포스포리파제 A₂, 라이소좀 효소, 반응성 산소 등을 분비하게 함으로써 조직손상을 일으키는 것으로 알려져 있다(Pruzanski, W. and Vadas, P., Immunol. Today, 12, 143(1991)). 분방기 추출물이 이러한 경로를 차단할 수 있는가를 단핵구, 대식세포 및 호중구에서 반응성 산소인 H₂O₂및 O₂ ^-생산 억제 효과를 측정함으로써 조사하였다.

H₂O₂의 양은 96-웰 플레이트를 이용한 미량 측정법(micro-assay)으로 다음과 같이 측정하였다. 즉, RPMI 1640 배지가 들어 있는 각각의 웰에 호중구를 5 x 10⁵세포로 가하고 25㎕의 양고추냉이 과산화효소(500㎍/㎖; horseradish peroxydase type II, Sigma)와 75㎕의 페놀 레드(1㎎/㎖)를 가하였다. 그 후 분방기 추출물 A를 10, 20, 50㎍/㎖의 농도로 1시간 동안 처리하고 포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate; PMA, 10^-7M)를 자극원으로 하여 37℃에서 60분동안 반응시켰다. 배양후 25㎕의 3M NaOH 용액을 각 웰에 가하여 반응을 정지시키고 620㎚에서 ELISA 리더(Dynatech Lab. Inc.)로 O.D. 값을 구하여 페놀의 산화정도에 의한 색의 변화를 측정하였으며, H₂O₂의 양은 신선한 H₂O₂(Sigma)를 희석하여 얻은 표준곡선을 이용하여 정량하였다.

O₂ ^-의 생성량을 측정하기 위해, RPMI 1640 배지로 호중구를 1 x 10⁶세포/800㎕로 현탁시켜 24-웰 플레이트의 일부의 웰에 가하고, 빈 웰에는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD, Sigma)를 10㎍/㎖ 되게 첨가하여 37℃에서 2분간 방치시킨 후, 각 웰에 사이토크롬 C(3㎎/㎖, Sigma) 100㎕와 분방기 추출물 A를 10, 20, 50㎍/㎖의 농도로 가하여 1시간 동안 처리하고, 10^-7M PMA를 자극원으로 하여 37℃에서 20분간 반응시켰다. 1mM N-에틸말레이미드(Sigma)를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 1,600xg에서 10분간 원심분리하여 상층액을 얻고 UV-Vis 분광 광도계(Kontron Instrument, Milano, Italy)를 이용하여 550㎚에서 사이토크롬 C의 환원에 의한 색의 변화를 측정하였다. 생성된 O₂ ^-의 양은 사이토크롬 C의 흡광 계수(E_550㎚=1.83 x 10⁴mM^-1㎝^-1)를 사용하여 20분동안 1 x 10⁶세포의 사이토크롬 C 환원을 억제할 수 있는 SOD의 농도(nM)로 표시하였다. 그 결과, 50㎍/㎖의 추출물 A가 H₂O₂생산을 약 50%, O₂ ^-생산을 약 25% 정도 억제시켰으므로 분방기 추출물 A가 염증 반응에도 억제 효과가 뚜렷함을 알 수 있었다(표 1).

한편, 10㎍/㎖의 분방기 추출물 A로 5 x 10개의 사람 단핵구/대식세포를 37℃에서 1시간 동안 처리하고 다시 100㎍/㎖의 실리카를 가하여 세포를 자극시킨 후 생성되는 HO와 O의 양을 상기와 동일한 방법으로 측정하였는데 실리카만을 처리한 대조군(si+MED)에 비해 분방기 추출물 A에 의해 처리된 단핵구/대식세포(si+EXT.A)에서 각각의 생성량이 현저히 감소되었다(제10도).

[실시예 8]

[분방기 추출물을 이용한 실험 간경변의 억제]

간경변(간경화)은 간 전체의 섬유화와 섬유성 중격에 의한 간 실질의 완전한 파괴, 그리고 재생성 결절들을 특징으로 하는 질환이다. 만성 간염이나 알콜로 인해 간경변이 시작되는 경우가 많은데 아직 이에 대한 정확한 원인은 밝혀져 있지 않다. 간경변 환자는 현상적으로 인터루킨-6 등 염증 및 섬유화에 관여하는 사이토카인이 많이 증가되어 있으므로 분방기 추출물을 이용하여 간경변 억제 효과를 측정하였다.

우선, 실험 간경변을 유발하기 위하여 생후 4주 된 웅성 스프라그 돌리 흰쥐에 1.0㎖/100g 체중의 CCl용액(50% CCl+ 50% 옥배유)을 1주일에 2회씩 복강내 주사하고(Nakataukasa, H., et al., J. Clin. Invest., 85, 1833-1843(1990)), 실험에 따라 각 0.2㎖의 분방기 추출물 A, B, C 또는 D를 1주일에 2회씩 CCl용액과 동시에 경구투여하였다. 실험을 시작한지 13주후 각 실험동물을 에테르 마취시키고 심장으로부터 혈액을 채취하여 혈청 글루탐산-옥살로초산 트랜스아미네이즈(serum glutamic-oxaloacetic transaminase, sGOT)와 혈청 글루탐산-피루브산 트랜스아미네이즈(serum glutamic-pyruvic transaminase, sGPT)를 측정하였다(제11도). 그 결과, CCl+ DMSO + PBS를 대조군으로 하였을 때 sGOT는 분방기 추출물 A나 C에 의해 억제되지 않았으나 추출물 D에 의해 약 20% 정도가 감소되었으며, 특히 추출물 B에 의해 40% 이상 감소되었고, sGPT의 경우는 추출물 B에 의해 약 60% 이상 감소됨을 알 수 있었다.

한편, 간의 병리조직학적 검사를 위해 간을 적출하여 10% 중성 포르말린 수용액(pH 7.4)에 고정하여 4㎜ 두께로 전개한 후 파라핀 포배를 하였다. 포배된 조직들은 5㎜ 두께로 박절하여 헤마토크실린 에오신(hematoxylin eosin) 염색과 마손 삼색염색(Masson's trichrome staining)을 수행한 후 광학 현미경으로 관찰하였다(제12도). CCl를 단독으로 투여한 간(B)에서는 비교적 비후된 섬유성 밴드에 의한 간소엽의 결절화가 정상간(A)에 비해 뚜렷하였으며, CCl와 추출물 B를 투여한 간(F), CCl와 추출물 C를 투여한 간(E) 및 CCl와 추출물 D를 투여한 간(D)에서는 간경변의 소견을 보였으나 간소엽의 결절을 둘러싸고 있는 섬유성 밴드가 CCl단독 투여군에 비해 얇고 불완전한 결절형성이 많았고 간세포의 재생성 변화도 CCl단독 투여군에 비해 감소하는 경향을 보였다. CCl와 추출물 A를 투여한 간(C)에서는 상기 D, E, F에 비해 간경변 억제 효과가 적었다.

[분방기 추출물을 포함하는 약학적 조성물의 제형화]

하기 성분들을 이용하여 결질 젤라틴 캅셀을 제조하였다.

상기 성분들을 완전히 혼합하여 총 200㎎의 양으로 경질 젤라틴 캅셀에 채웠다.

Claims

분방기 뿌리 추출물을 유효량 포함하는, 인터루킨-6의 과잉생산을 억제함으로써 인터루킨-6 과잉생산으로 인한 면역질환의 치료에 유용한 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 면역질환이 콜라겐 합성, 반응성 산소 생산, 관절염 활막세포의 증식 또는 혈청 GOT 및 GPT의 증가와 관련된 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 면역질환이 류마티스 관절염, 간경변, 건선 피부병, 다발성 골수종, 카디악 믹소마, 규폐증 또는 에이즈(AIDS)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.