CN112263624B - 宁夏枸杞子提取物和枸杞子多糖在制备防治心脏纤维化药物中的应用 - Google Patents

宁夏枸杞子提取物和枸杞子多糖在制备防治心脏纤维化药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及宁夏枸杞子提取物和枸杞子多糖在制备防治心脏纤维化药物中的应用。在本发明实施例中，宁夏枸杞子提取物和枸杞子多糖在小鼠心脏纤维化细胞模型中均显著抑制TGF‑β1诱导的心肌成纤维细胞增殖以及α‑SMA蛋白表达，显著下调Snail、Slug、Twist和ColI的mRNA表达，宁夏枸杞子多糖的作用更好。可见，宁夏枸杞子提取物和枸杞子多糖均可有效抑制TGF‑β1诱导的心肌成纤维细胞活化，具有开发成抗心脏纤维化药物的前景，有重要的社会效益和经济效益。

Description

宁夏枸杞子提取物和枸杞子多糖在制备防治心脏纤维化药物 中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，涉及宁夏枸杞子的一种新用途，具体涉及宁夏枸杞子提取物和枸杞子多糖在制备防治心脏纤维化的药物中的应用。
背景技术
纤维化是在修复或反应过程中在器官或组织中形成过量纤维结缔组织的过程。纤维化可以是反应性的、良性的或病态的，并在生理学上发挥沉积结缔组织的作用，这可消除器官或组织的系统结构和功能。纤维化可用于描述纤维组织过度沉积的病理学状态，以及在愈合中结缔组织沉积的过程。尽管纤维组织的形成是正常的，并且纤维组织是体内器官或组织的正常组分，但是由纤维化条件造成的瘢痕形成使器官或组织的系统结构消失。
心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)是各种心血管疾病发展至后期的共同病理特征，其主要特征是心肌成纤维细胞(cardiac fibroblast，CF)的激活和细胞外基质(extracellular matrixc，ECM)聚积。有效抑制心肌纤维化可延缓心血管疾病后续的发生发展，有利于心血管患者的预后改善，为治疗心血管疾病提供新方法。
目前，可以用于治疗纤维化的药物非常有限，没有市售的专门用于防治心脏纤维化的药物。临床上，常用糖皮质激素、免疫抑制剂/细胞毒性药物和抗纤维化剂治疗，但有明显的副作用，且疗效非常不理想。在全球范围内，仅有两个专门用于治疗纤维化的药物上市，但这两种药物的目标适应证均为特发性肺纤维化(IPF)。吡啡尼酮(pirfenidone)于2008年首先在日本用于IPF治疗，2014年吡啡尼酮和尼达尼布(nintedanib)被美国FDA批准用于特异性地治疗IPF，目前我国只有吡啡尼酮被批准用于治疗IPF。但是，实质上，这两种药物也不能逆转或阻止纤维化的病情发展。
近年来大量研究表明，天然药物具有多途径、多靶点的特点，对心肌纤维化的预防治疗有独特优势。例如，丹参酮ⅡA可通过TGF-β1/Smad信号通路逆转心肌纤维化(参见TangTM,Qian G.TanshinoneⅡA Inhibits Myocardial Fibrosis in Rats with IschemicHeart Failure[J].Journal of medical research(医学研究杂志),2018,47(9):111-114)，黄连素能抑制TGF-β1所诱导的心脏成纤维细胞增殖以及胶原蛋白的合成(参见CaiSA,Hu M,Tang XY et al.Anti-cardiac fibrosis effect of berberine and itsmechanism[J].Guangdong Medical Journal(广东医学),2017,38(3):337-339)，四逆汤是一种中药复方，可干预肾素-血管紧张素系统，从而抑制心肌纤维化(参见ZangFY.Mechanism and application of Danggui Sini Decocti on in the treatment ofcardiovascular diseases[J].Tianjin Traditional Chinese Medicine(天津中医药),2018,(6))。
宁夏枸杞是我国传统的药食兼用的名贵中药材，其干燥成熟果实“宁夏枸杞子”中含有多种活性成分，包括枸杞子多糖、黄酮、酚酸、甜菜碱、维生素等。研究发现，枸杞子多糖是枸杞子提取物中主要的功能成分，具有降血糖、降血压、抗氧化、提高免疫力等生物学功能。然而，枸杞子提取物和枸杞子多糖防治心肌纤维化的作用未见报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，实现采用现代药物研究方法对天然产物进行开发利用，结合大量药效学实验筛选，提供宁夏枸杞子提取物和枸杞子多糖在制备防治心脏纤维化药物中的应用。
为达到本发明的目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了宁夏枸杞子提取物在制备防治心脏纤维化药物中的用途。
进一步地，所述心脏纤维化选自下述：心内膜心肌纤维化、心肌梗死后纤维化或心房纤维化。
更进一步地，所述药物用于(i)减慢患者心肌纤维化的进展，和/或(ii)改善患者的运动能力，和/或(iii)减少患者中的右心室纤维化，和/或(iv)减少患者中的心肌细胞肥大，和/或(v)在患者中提供增加的E/A比率。
在一个实施方式中，所述宁夏枸杞子提取物采用下述方法制备：干燥粉碎的宁夏枸杞子，投入多功能提取罐中，加入6倍水，加热至40-50℃，浸润30min，然后加热至微沸，煎煮2h，冷却过滤，收集滤液，将滤渣浸泡半小时后，再煎煮2h，冷却过滤，合并两次滤液浓缩，浓缩液喷雾干燥，得枸杞子提取物。
在一个优选的实施方式中，所述宁夏枸杞子提取物是宁夏枸杞子多糖。
具体地，所述药物抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖以及α-SMA蛋白表达，下调Snail、Slug、Twist和Col I的mRNA表达。
在另一个实施方式中，所述药物包含宁夏枸杞子提取物或宁夏枸杞子多糖以及药学上可接受的载体。
在又一个实施方式中，所述药物还包含其他抗纤维化药物。例如，吡非尼酮、尼达尼布或皮质类固醇。
进一步地，所述药物的剂型为口服剂型。
更进一步地，所述口服剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂或口服液。优选为片剂或胶囊剂。
所述药学上可接受的载体是指药物制剂领域常规的药物载体，选自填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、润湿剂、色素、矫味剂、溶剂、表面活性剂中的一种或几种。
本发明所述填充剂包括但不限于淀粉、微晶纤维素、蔗糖、糊精、乳糖、糖粉、葡萄糖等；所述润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、氯化钠、油酸钠、月桂醇硫酸钠、泊洛沙姆等；所述粘合剂包括但不限于水、乙醇、淀粉浆、糖浆、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮等；所述崩解剂包括但不限于淀粉泡腾混合物即碳酸氢钠和枸橼酸、酒石酸、低取代羟丙基纤维素等；所述助悬剂包括但不限于多糖如金合欢胶、琼脂、藻酸、纤维素醚和羧甲基甲壳酯等；所述溶剂包括但不限于水、平衡的盐溶液等。
可以将所述药物组合物制成各种固体口服制剂、液体口服制剂等。药剂学可接受的口服剂固体制剂有：普通片剂、分散片、肠溶片、颗粒剂、胶囊剂、滴丸、散剂等，口服液体制剂有口服液、乳剂等。上述各种剂型可以根据药物制剂领域的常规工艺制备而成。
宁夏枸杞子提取物和枸杞子多糖可以采用生物提纯方法(参见例如，Pan TA,MaoZY,Zhang YC et al.R&D and Proeessing of Lycium Chinense Polysaeeharide[J].China FoodAdditives(中国食品添加剂),2002,(4):21-24)从宁夏枸杞子中提取分离得到，也可购自市售产品。
在上文所述的医药用途中，对于宁夏枸杞子提取物和枸杞子多糖的给药时间、给药次数和给药频率等等，需要根据病情的具体诊断结果而定，这在本领域技术人员掌握的技术范围之内。
为了更好地理解本发明的实质，在下文具体实施方式部分用药效学实验及其结果来进一步说明宁夏枸杞子提取物和枸杞子多糖在制药领域中的新用途。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明结合我国在天然产物研究方面的优势，筛选出天然产物宁夏枸杞子提取物和枸杞子多糖在防治心脏纤维化方面的新用途。宁夏枸杞子提取物和枸杞子多糖在小鼠心脏纤维化细胞模型中均显著抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖以及α-SMA蛋白表达，显著下调Snail、Slug、Twist和Col I的mRNA表达，宁夏枸杞子多糖的作用更好。可见，宁夏枸杞子提取物和枸杞子多糖均可有效抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞活化，具有开发成抗心脏纤维化药物的前景，有重要的社会效益和经济效益。
附图说明
图1：小鼠心肌成纤维细胞波形蛋白染色阳性(a:100x，b:400x)。
图2：枸杞子提取物(C1)和枸杞子多糖(C2)对CF细胞形态和增殖的影响(100x)。
图3：枸杞子提取物(C1)和枸杞子多糖(C2)对CF细胞中α-SMA蛋白表达的影响(400×)。a)α-SMA的荧光表达；b)荧光表达的定量分析(**P<0.01，***P<0.001)。
图4：枸杞子提取物(C1)和枸杞子多糖(C2)对CF细胞中Snail、Slug、Twist和ColI的mRNA表达的影响。a)Snail的mRNA表达水平；b)Slug的mRNA表达水平；c)Twist的mRNA表达水平；d)Col I的mRNA表达水平(***P<0.001)。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
实施例1：宁夏枸杞子提取物和枸杞子多糖的制备方法
将干燥粉碎的宁夏枸杞子(产自宁夏中宁县)50kg，投入多功能提取罐中，加入6倍水，加热至40-50℃，浸润30min，然后加热至微沸，煎煮2h，冷却过滤，收集滤液，将滤渣浸泡半小时后，再煎煮2h，冷却过滤，合并两次滤液浓缩，浓缩液喷雾干燥，得到约8kg枸杞子提取物。
枸杞子多糖的制备方法参照文献潘泰安等人的“枸杞子多糖生产工艺及产品的开发研究”(参见Pan TA,Mao ZY,Zhang YC et al.R&D and Proeessing of LyciumChinense Polysaeeharide[J].China FoodAdditives(中国食品添加剂),2002,(4):21-24)。
实施例2：宁夏枸杞子提取物和枸杞子多糖抗心脏纤维化的药效学研究1.材料和 方法
1.1主要材料和试剂
清洁级C57BL/6新生小鼠，1-3日龄，若干，购于第三军医大学动物实验中心。DMEM-F12培养基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶购自Gibco公司；TGF-β1购自R&D公司、青/链霉素溶液(100X)购于Beyotime公司、PBS溶液购自Hyclone公司；α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体(鼠来源)、一抗波形蛋白(兔来源)购自Abcam公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗、DAB、苏木素、中性树胶购自北京中杉金桥生物技术有限公司；二甲苯购自国药集团；TritonX-100购自上海生工；
Figure BDA0002793936510000061
Total RNAKit I(OMEGA公司)，/>
Figure BDA0002793936510000063
II QRT SuperMix for qPCR、ChamQTM/>
Figure BDA0002793936510000062
qPCRMaster Mix购自Vazyme公司；引物由上海生工合成；枸杞子提取物、枸杞子多糖(多糖含量>60％)由宁夏沃福百瑞枸杞子产业股份有限公司提供。
1.2实验方法
1.2.1C57BL/6小鼠心肌成纤维细胞原代分离培养
利用酶消化法结合差速贴壁分离培养心肌成纤维细胞。将新生小鼠在75％酒精中浸泡1-5min，固定在泡沫板上，用碘酒和酒精消毒胸腹部。取出心脏组织快速置于预冷的含双抗PBS溶液润洗3遍。剔除周围结缔组织，将心脏置于无菌平皿中，尽量剪碎，加入适量0.125％胰酶，37℃培养箱中分次消化，取上清液，加入等量的含血清的DMEM/F12培养基，中和胰酶的消化。细胞过滤筛过滤细胞混合液，所得滤液1000r/min离心5min。弃上清，用PBS重悬，离心，重复3次。用细胞培养基将细胞沉淀重悬，于细胞培养瓶中培养，培养90min左右，将未贴壁的细胞悬液吸出。此时已经贴壁的是心肌成纤维细胞，加入DMEM/F12培养基，放入培养瓶继续培养。24h换液，并每日观察心肌成纤维细胞的生长。
1.2.2免疫组化检测波形蛋白鉴定心肌成纤维细胞
无菌12孔板中铺上细胞爬片，取细胞悬液分别滴到圆片上，让细胞贴片30min左右。30min后，在培养皿中补加完全培养液，放于37℃，5％CO2培养箱中培养(让其贴壁更牢)。取出培养皿，用PBS漂洗，3×2min；4％多聚甲醛固定(室温)20min；PBS漂洗，3×2min；0.5％Triton X-100处理(室温)20min，PBS漂洗，3×2min。3％H2O2处理(室温)15min，PBS漂洗，3×2min。山羊血清室温封闭60min，取出甩干封闭液(不漂洗)；一抗孵育(波形蛋白稀释比1:100)4℃过夜。PBS清洗标本3次各5min，二抗(HRP标记，稀释比1:50)工作液37℃孵育30min，PBS清洗标本3次各5min，DAB显色(避光，镜下观察至棕色)1-10min。蒸馏水洗2次各5min，苏木素复染5min，自来水洗返蓝。梯度酒精脱水75％、85％、95％、100％各3min，二甲苯透明2次各3min，中性树胶封片。
1.2.3细胞分组处理
取3-4代细胞，以每孔5×104个细胞均匀接种到6孔板，待细胞贴壁后进行分组处理。实验分为4组，如下：对照组(完全培养基)、模型组(含10ng/mL TGF-β1)、宁夏枸杞子提取物组(10ng/mLTGF-β1+100μg/mL宁夏枸杞子提取物C1)和枸杞子多糖组(10ng/mL TGF-β1+100μg/mL枸杞子多糖C2)，每组设置3个重复。处理之后置于培养箱中继续培养，两天换一次含对应物质的新鲜培养基，连续培养4天。所有实验结果均进行3次以上重复。
1.2.4电子显微镜观察细胞形态及细胞增殖
CF细胞连续处理培养4天后，置于电子显微镜下观察其形态和数目，并进行拍照记录。
1.2.5免疫荧光法检测α-平滑肌肌动蛋白的表达
无菌玻片放入6孔板中，将CF细胞以每孔5×104的数量接种于6孔板，处理培养结束后，弃去各孔的培养基，PBS洗3次，4％多聚甲醛固定细胞10-15min，PBS洗3次，加入100μL0.3％Triton X-100破膜20min左右，PBS再洗3次，5％BSA封闭20min，弃上清，加入α-SMA一抗(1:500)，4℃过夜，PBS清洗，加入荧光二抗，室温孵育，PBS清洗，取出玻片，加入DAPI，倒置荧光显微镜下观察拍照分析荧光光密度值。
1.2.6实时定量PCR检测纤维化调节转录因子Snail、Slug、Twist和胶原蛋白I的mRNA表达
收集各组细胞，按照试剂盒说明书提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，分别将cDNA模板、Snail、Slug、Twist和Col I及GAPDH基因引物加入至qPCRMix扩增反应体系中进行实时荧光RT-PCR检测，反应体系为20μL。GAPDH基因退火温度60℃，引物序列F：5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'，R：5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'；Snail基因退火温度60℃，引物序列F：5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，R：5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'；Slug基因退火温度60℃，引物序列F：5'-CGCTCCTTCCTGGTCAAGA-3'，R：5'-AGGTATAGGGTAACTTTCATAGAGATA-3'，Twist基因退火温度60℃，引物序列F：5'-TGATAGAAGTCTGAACACTCGTTTG-3'，R：5'-GGCTGATTGGCAAGACCTCT-3'，Col I基因退火温度60℃，引物序列F：5'-CCTCAGGGTATTGCTGGACAAC-3'，R：5'-CAGAAGGACCTTGTTTGCCAGG-3'。
1.2.7数据统计
数据统计分析采用GraphPadPrism 5软件中的单因素ANOVA进行，数据用Tukey检验配对比较柱状图表示，*为差异具有统计学意义(0.01＜P＜0.05)，**为差异性显著(P＜0.01)***为差异性极显著(P＜0.001)。
2.实验结果
2.1小鼠心肌成纤维细胞鉴定结果
细胞鉴定结果如图1，免疫组化结果为阳性，符合心肌成纤维细胞特征。
2.2细胞增殖及细胞形态结果
光学显微镜观察细胞数目及细胞形态结果见图2。如图2所示，与对照组比较，模型组细胞数目明显增多且细胞由梭形转变成狭长形；与模型组比较，宁夏枸杞子提取物组(C1)和枸杞子多糖组(C2)细胞数目均有减少，细胞形态有所恢复；枸杞子多糖组与宁夏枸杞子提取物组比较，细胞数目减少更明显。
2.3α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)荧光表达结果
免疫荧光法检测α-SMA荧光表达结果见图3。如图3所示，与对照组比较，模型组中α-SMA绿色荧光明显增强(P＜0.001)；与模型组比较，宁夏枸杞子提取物组(C1)和枸杞子多糖组(C2)中的绿色荧光表达均有明显下降，其中枸杞子多糖组下降更显著(P＜0.001)。
2.4纤维化调节转录因子Snail、Slug、Twist和胶原蛋白I(Col I)的mRNA表达结果
实时定量PCR检测Snail、Slug、Twist和Col I的mRNA表达结果见图4。如图4所示，与对照组比较，模型组中Snail、Slug、Twist和Col I的mRNA表达显著增高(P＜0.001)；与模型组比较，宁夏枸杞子提取物组(C1)和枸杞子多糖组(C2)中的Snail、Slug、Twist和Col I的mRNA均呈现显著下降趋势(P＜0.001)，其中枸杞子多糖组下降的更显著。
3.实验结论
上述实验结果表明，宁夏枸杞子提取物和枸杞子多糖在小鼠心脏纤维化细胞模型中均显著抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖以及α-SMA蛋白表达，显著下调Snail、Slug、Twist和Col I的mRNA表达，宁夏枸杞子多糖的作用更好。
可见，宁夏枸杞子提取物和枸杞子多糖均可有效抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞活化，具有开发成抗心脏纤维化药物的前景，有重要的社会效益和经济效益。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (4)

1.宁夏枸杞子多糖作为唯一活性成分在制备治疗心脏纤维化药物中的用途，其特征在于：所述药物抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖以及α-SMA蛋白表达，下调Snail、Slug、Twist和Col I的mRNA表达，所述心脏纤维化选自心肌梗死后纤维化。
2.宁夏枸杞子多糖作为唯一活性成分在制备在小鼠心脏纤维化细胞模型中抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖以及α-SMA蛋白表达的药物中的用途。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物由宁夏枸杞子多糖以及药学上可接受的载体组成。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物的剂型为口服剂型，所述口服剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂或口服液。
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