CN112438973A - 一种药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种药物组合物及其应用，具体的，所述药物组合物包括：丹酚酸B作为第一活性成分；和人参皂苷Rg1作为第二活性成分，并且，所述第一活性成分和第二活性成分的重量比为5:(1‑4.5)。本发明的药物组合物具有比现有技术更佳的活性成分配比，在预防和/或治疗缺血性疾病、缺血再灌注组织脏器损伤方面具有更优异的疗效，并且本发明的药物组合物可用于治疗不同组织器官的缺血和/或缺血再灌注损伤。

Description

一种药物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种药物组合物及其在预防和/或治疗缺血性疾病和/或缺血再灌注损伤等疾病中的应用。
背景技术
血管负责对全身组织器官供血，一旦血管受阻，组织器官因供血不足而导致疾病，尤其是心脏、脑等对血液供氧需求很高的组织器官；而随着休克时微循环的疏通、冠状动脉痉挛的缓解、动脉搭桥术、溶栓疗法、经皮腔内冠脉血管成形术、心脏外科体外循环、心肺脑复苏、断肢再植和器官移植等方法的建立和推广应用，使许多组织器官缺血后可以重新恢复供血(即再灌注)。但这种缺血后再灌注，有时不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重组织、器官的功能障碍和结构损伤。这种在缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的现象称为缺血再灌注损伤。
申请号为CN2011102229806的中国申请公开了一种包含化合物丹酚酸B和人参皂苷Rg1的药物组合物，对心脏缺血再灌注损伤具有疗效。但二者配伍使用的研究尚不充分，有必要开展进一步的深入组方配伍研究，以提供对不同组织器官的缺血再灌注损伤具有疗效的药物组合物。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于预防和/或治疗组织、器官缺血，以及缺血再灌注损伤等疾病的药物组合物。
本发明第一方面，提供了一种药物组合物，包括：
(a)第一活性成分，所述第一活性成分选自下组：丹酚酸B、其立体异构体、其晶型、其药学上可接受的盐或酯、含丹酚酸B的提取物、或它们的组合；
(b)第二活性成分，所述第二活性成分选自下组：人参皂苷Rg1、其立体异构体、其晶型、其药学上可接受的盐或酯、含人参皂苷Rg1的提取物、或它们的组合；和
(c)药学上可接受的载体；
并且，所述第一活性成分和第二活性成分的重量比为5:(1-4.5)，其中所述重量比以丹酚酸B和人参皂苷Rg1计。
在另一优选例中，所述的第一活性成分包括丹酚酸B或其药学上可接受的盐的纯化产物。
在另一优选例中，所述的纯化产物中，按丹酚酸B计，纯度≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥98％或99％，按所述纯化产物的总重量计。
在另一优选例中，所述的第一活性成分包括丹酚酸B含量C1≥30wt％的丹酚酸提取物，其中所述含量C1按丹酚酸的重量计。
在另一优选例中，所述提取物中，丹酚酸B的含量C1≥70％，较佳地≥80％，更佳地≥90％或≥95％，按提取物的干重计。
在另一优选例中，所述的第二活性成分包括人参皂苷Rg1的含量C2≥30wt％的总皂苷提取物，其中所述含量C2按总皂苷的重量计。
在另一优选例中，所述提取物中，人参皂苷Rg1的含量C2≥70％，较佳地≥80％，更佳地≥90％或≥95％，按提取物的干重计。
在另一优选例中，所述第一活性成分和第二活性成分的重量比5:(1-4.0)，较佳地5:(1.2-3.8)，更佳地5:(1.5-3.5)。
在另一优选例中，所述第一活性成分和第二活性成分的重量比为5:(1.8-3.2)，较佳地，5:(1.9-3.1)，更佳地5:(2-3)，最佳地5:2。
在另一优选例中，第一活性成分为丹酚酸B，而第二活性成分为人参皂苷Rg1。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：液体制剂(如溶液、乳液、悬浮液)、固体制剂(如冻干制剂)、气体剂型、半固体剂型。。
在另一优选例中，所述剂型选自下组：注射剂(如注射液或粉针剂)、口服制剂(如胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆、口服液或酊剂)、舌下含服制剂、呼吸道给药制剂、皮肤给药制剂、粘膜给药制剂，更佳地，所述剂型为注射剂。
本发明第二方面，提供了一种活性成分的组合，所述的活性成分的组合包括：
(a)第一活性成分，所述第一活性成分选自下组：丹酚酸B、其立体异构体、其晶型、其药学上可接受的盐或酯、含丹酚酸B的提取物、或它们的组合；
(b)第二活性成分，所述第二活性成分选自下组：人参皂苷Rg1、其立体异构体、其晶型、其药学上可接受的盐或酯、含人参皂苷Rg1的提取物、或它们的组合；
并且，所述第一活性成分和第二活性成分的重量比为5:(1-4.5)，其中所述重量比以丹酚酸B和人参皂苷Rg1计。
在另一优选例中，所述的活性成分的组合由(a)第一活性成分和(b)第二活性成分构成。
本发明第三方面，提供了一种药盒，所述的药盒包括：
第一药物组合物，所述第一药物组合物包括：(a)第一活性成分，所述第一活性成分选自下组：丹酚酸B、其立体异构体、其晶型、其药学上可接受的盐或酯、含丹酚酸B的提取物、或它们的组合；和药学上可接受的载体；
第二药物组合物，所述第二药物组合物包括：(b)第二活性成分，所述第二活性成分选自下组：人参皂苷Rg1、其立体异构体、其晶型、其药学上可接受的盐或酯、含人参皂苷Rg1的提取物、或它们的组合；和药学上可接受的载体；
并且，所述第一药物组合物和第二药物组合物是联合施用的，其中所述第一活性成分和第二活性成分的重量比为5:(1-4.5)，其中所述重量比以丹酚酸B和人参皂苷Rg1计。
在另一优选例中，所述第一药物组合物和第二药物组合物是不同的(或独立的)药物化合物、或是同一药物组合物。
本发明第四方面，提供了如本发明第一方面所述的药物组合物、本发明第二方面活性成分的组合、或本发明第三方面所述的药盒的用途，用于制备一药物或药盒，所述药物或药盒用于(i)预防和/或治疗缺血性疾病；(ii)预防和/或治疗缺血再灌注损伤；(iii)抑制乳酸脱氢酶。
另一优选例中，所述药物或药盒用于(i)预防和/或治疗缺血性心脏病；(ii)预防和/或治疗缺血再灌注损伤；(iii)抑制乳酸脱氢酶和/或(iv)预防和/或治疗缺血性疾病。
在另一优选例中，所述缺血性疾病选自下组：急性缺血导致的组织器官损伤和/或慢性缺血导致组织器官损伤。
在另一优选例中，所述缺血性疾病选自下组：由于组织和血管原发性病变导致的组织器官缺血损伤，和/或继发性原因导致的缺血性病变，如外伤导致的血管离断、炎症引起的血管闭塞、肿瘤导致的血管压迫。
在另一优选例中，所述缺血性疾病选自下组：缺血性心脏病、缺血性脑卒中(如急性脑梗死)、缺血性肝损伤、肺栓塞、缺血性肾损伤、缺血性神经损伤，或其组合。
在另一优选例中，所述缺血性心脏病包括：冠心病、心肌梗死、心绞痛、心肌纤维化、心衰，或其组合。
在另一优选例中，所述的缺血再灌注损伤为再灌注所导致的组织器官损伤。
在另一优选例中，所述组织器官选自下组：心、脑、肝、脾、肺、肾、肌肉、神经，或其组合。在另一优选例中，所述的组织器官选自下组：肝、脾、肺、肾、脑、神经，或其组合。
在另一优选例中，所示组织器官选自下组：心、脑，或其组合。
在另一优选例中，所述的药物或药盒还用于改善肺栓塞诱导的心肌肥大。在另一优选例中，所述的药物或药盒还用于改善再灌注损伤的心脏的舒张功能，较佳地，所述的心脏的舒张功能包括心脏的舒张速率。
在另一优选例中，所述的药物或药盒还用于改善心脏的收缩功能(如心脏的收缩速率)。
在另一优选例中，所述药物或药盒用于改善肾脏的再灌注损伤，较佳地，包括改善肾脏结构。
在另一优选例中，所述组织器官损伤为手术后再灌注损伤，较佳地，所述手术选自下组：动脉搭桥术、取栓或溶栓疗法、经皮腔内冠脉血管成形术、体外循环下心脏手术、心脏骤停后心、肺和/或脑复苏、断肢再植或器官移植、或其他重大手术带来的再灌注损伤。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1示出了在心肌梗死的动物模型上，丹酚酸B/人参皂苷Rg1对减小心脏梗死面积的效果；(A)心脏切片TTC染色代表图；(B)梗死面积定量(梗死区占整个心脏的面积百分比)。
图2示出了在心肌梗死的动物模型上，丹酚酸B/人参皂苷Rg1对血液中乳酸脱氢酶含量的影响。
图3示出了在心肌梗死的动物模型上，丹酚酸B/人参皂苷Rg1对心脏组织结构的保护作用。
图4示出了在心肌缺血再灌注损伤的动物模型上，丹酚酸B/人参皂苷Rg1(5:2)组比丹酚酸B/人参皂苷Rg1(2:5)组明显减小心脏梗死面积并且改善心脏结构；(A)心脏切片TTC染色代表图；(B)梗死面积定量(梗死区占整个心脏的面积百分比)；(C)心脏组织HE染色代表图。
图5示出了在心肌缺血再灌注损伤的动物模型上，丹酚酸B/人参皂苷Rg1(2:5)组和丹酚酸B/人参皂苷Rg1(5:2)组大鼠血流动力学(最大舒张速率和最大舒张速率)检测结果。“*”表示与丹酚酸B/人参皂苷Rg1(2:5)组比较P﹤0.05。
图6示出了在心肌缺血再灌注损伤的动物模型上，丹酚酸B/人参皂苷Rg1(2:5)组和丹酚酸B/人参皂苷Rg1(5:2)组大鼠血流动力学(末端舒张压和平均动脉压)检测结果。
图7示出了在肾脏缺血再灌注损伤模型上，假手术组、肾脏缺血再灌模型组、丹酚酸B/人参皂苷Rg1(2:5)组以及丹酚酸B/人参皂苷Rg1(5:2)组大鼠肾脏HE染色结果。
图8示出了在肾脏缺血再灌注损伤模型上，假手术组、肾脏缺血再灌模型组、丹酚酸B/人参皂苷Rg1(2:5)组以及丹酚酸B/人参皂苷Rg1(5:2)组大鼠过碘酸雪夫染色(PAS)结果。
图9示出了在肺栓塞模型上，丹酚酸B/Rg1(5：2)对肺栓塞的治疗效果；(A)左肺指数；(B)右肺指数；(C)肺脏HE染色代表图，(D)肺间质面积定量结果(E)心脏HE染色代表图，(F)肺脏中性粒细胞平均光密度。
图10示出了在肺栓塞模型上，丹酚酸B/Rg1(5：2)降低肺栓塞诱导的心肌肥大的发生，(A)心脏HE染色的代表图，(B)心肌细胞横截面积的定量图。
图11示出了在急性脑梗死模型上，丹酚酸B/Rg1(5：2)显著降低梗死面积，(A)大脑TTC染色代表图，(B)梗死面积定量结果。
图12示出了在急性脑梗死模型上，丹酚酸B/Rg1(5：2)改善脑梗死后大鼠行为学评分结果。
图13示出了在急性脑梗死模型上，丹酚酸B/Rg1(5：2)对大脑皮层神经细胞的保护作用，(A)为大脑皮层的HE染色代表图；(B)为HE染色的神经细胞数定量结果；(C)为大脑皮层的尼式染色代表图；(D)为大脑皮层尼氏小体数的定量结果。
图14示出了在急性脑梗死模型上，海马体CA1、CA2、CA3的HE染色代表图。
图15示出了在急性脑梗死模型上，海马体CA1、CA2、CA3的尼式染色代表图及其定量结果。
图16示出了在脑缺血再灌注损伤模型上，丹酚酸B/Rg1(5：2)降低再灌注损伤的脑梗死面积，(A)脑组织TTC染色代表图，(B)梗死面积定量结果。
图17示出了在脑缺血再灌注损伤模型上，丹酚酸B/Rg1(5：2)改善脑缺血再灌注后大鼠行为学评分。
图18示出了在脑缺血再灌注损伤模型上，丹酚酸B/Rg1对大脑皮层神经细胞的保护作用，A为大脑皮层的HE染色；B为大脑皮层的尼式染色。
图19示出了大鼠脑缺血再灌注损伤模型上，海马体CA1、CA2、CA3的HE染色代表图。
图20示出了大鼠脑缺血再灌注损伤模型上，海马体CA1、CA2、CA3的尼式染色代表图。
图21示出了大鼠肝缺血再灌注损伤模型上，肝组织的HE染色代表图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了一种包含丹酚酸B与人参皂苷Rg1作为活性成分比的药物组合物，与现有技术相比，本发明的药物组合物对缺血性疾病、组织脏器的缺血再灌注损伤表现出更优异的改善治疗效果；且令人惊讶地，本发明的组合物不仅对心脏，脑、肝脏而且还对肾脏等器官的缺血再灌注损伤具有疗效，可用于多种组织器官的缺血再灌注损伤。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用，术语“立体异构体”意在包括所有的同分异构形式(如对映异构，非对映异构和几何异构体(或构象异构体))：例如含有不对称中心的R、S构型，双键的(Z)、(E)异构体等。因此，本发明活性成分的单个立体化学异构体或其对映异构体、非对映异构体或几何异构体(或构象异构体)的混合物都属于本发明的范围。
本发明活性成分可以是无定形的、晶型或其混合物。
如本文所用，“药学上可接受的盐”指本发明活性成分的化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明活性成分的化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。一类优选的盐是本发明活性成分的化合物与碱形成的盐。适合形成盐的碱包括但并不限于：氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸钠等无机碱，氨水、三乙胺、二乙胺等有机碱。另一类优选的盐是本发明活性成分与金属离子形成的盐，包括但不限于镁盐、钠盐、钙盐、钾盐等等。
如本文所用，“药学上可接受的酯”指本发明活性成分的化合物与酸或醇形成的适合用作药物的酯一类优选的酯为本发明的活性成分的一个或多个羟基与酸形成的酯，适合形成酯的酸包括但并不限于：磷酸、甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等；另一类优选的酯为本发明的活性成分的羧基与醇形成的酯，适合形成酯的醇包括但并不限于：C1-C6烷基-OH，如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇等。
如无特别说明，药物组合物中，所述重量比以丹酚酸B和人参皂苷Rg1的原化合物形式计算。
本发明所述的“预防”和“治疗”包括延缓和终止疾病的进展，或消除疾病，并不需要100％抑制、消灭和逆转。在一些实施方案中，与不存在本发明所述组合物或药物组合物时观察到的水平相比，本发明所述组合物或药物组合物将缺血再灌注损伤预防、减轻、抑制和/或逆转了例如至少约10％、至少约30％、至少约50％、或至少约80％。
如本发明所用，术语“SalB”与“丹酚酸B”可以互换使用；术语“Rg1”与“人参皂苷Rg1”可以互换使用。
第一活性成分
本发明中，第一活性成分选自下组：丹酚酸B、其立体异构体、其晶型、其药学上可接受的盐或酯、含丹酚酸B的提取物、或它们的组合。
Figure BDA0002656222880000061
在另一优选例中，所述的第一活性成分包括丹酚酸B或其药学上可接受的盐的纯化产物。
在另一优选例中，所述的纯化产物中，按丹酚酸B计，纯度≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥98％或99％，按所述纯化产物的总重量计。
在另一优选例中，所述的第一活性成分包括丹酚酸B含量C1≥30wt％的丹酚酸提取物，其中所述含量C1按丹酚酸的重量计。
在另一优选例中，所述提取物中，丹酚酸B的含量C1≥70％，较佳地≥80％，更佳地≥90％或≥95％，按提取物的干重计。
第二活性成分
本发明中，第二活性成分选自下组：人参皂苷Rg1、其立体异构体、其晶型、其药学上可接受的盐或酯、含人参皂苷Rg1的提取物、或它们的组合。
Figure BDA0002656222880000071
在另一优选例中，所述的第二活性成分包括人参皂苷Rg1的含量C2≥30wt％的总皂苷提取物，其中所述含量C2按总皂苷的重量计。
在另一优选例中，所述提取物中，人参皂苷Rg1的含量C2≥70％，较佳地≥80％，更佳地≥90％或≥95％，按提取物的干重计。
药物组合物、活性成分组合、药盒
本发明提供了一种药物组合物，包括：
(a)第一活性成分，所述第一活性成分选自下组：丹酚酸B、其立体异构体、其晶型、其药学上可接受的盐或酯、含丹酚酸B的提取物、或它们的组合；
(b)第二活性成分，所述第二活性成分选自下组：人参皂苷Rg1、其立体异构体、其晶型、其药学上可接受的盐或酯、含人参皂苷Rg1的提取物、或它们的组合；和
(c)药学上可接受的载体；
并且，所述第一活性成分和第二活性成分的重量比为5:(1-4.5)，其中所述重量比以丹酚酸B和人参皂苷Rg1计。
在另一优选例中，所述第一活性成分和第二活性成分的重量比5:(1-4.0)，较佳地5:(1.2-3.8)，更佳地5:(1.5-3.5)。
在另一优选例中，所述第一活性成分和第二活性成分的重量比为5:(1.8-3.2)，较佳地，5:(1.9-3.1)，更佳地5:(2-3)，最佳地5:2。
在另一优选例中，第一活性成分为丹酚酸B，而第二活性成分为人参皂苷Rg1。
所述药物组合物的剂型选自下组：液体制剂(如溶液、乳液、悬浮液)、固体制剂(如冻干制剂)。
在另一优选例中，所述剂型选自下组：注射剂(如注射液或粉针剂)、口服制剂(如胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆、口服液或酊剂)，更佳地，优选地，所述剂型为注射剂。
本发明的药物组合物中，第一活性成分和第二活性成分可以分别制成制剂或混合在一起制成制剂。
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内第一活性成分和/或第二活性成分。其中“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明活性成分/剂，更佳地，含有10-500mg本发明活性成分/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊、药片、针剂等。
本发明中，“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和第一活性成分和/或第二活性成分相互掺和，而不明显降低第一活性成分和/或第二活性成分的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如
Figure BDA0002656222880000081
)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明还提供了一种活性成分的组合，所述的活性成分的组合包括：
(a)第一活性成分，所述第一活性成分选自下组：丹酚酸B、其立体异构体、其晶型、其药学上可接受的盐或酯、含丹酚酸B的提取物、或它们的组合；
(b)第二活性成分，所述第二活性成分选自下组：人参皂苷Rg1、其立体异构体、其晶型、其药学上可接受的盐或酯、含人参皂苷Rg1的提取物、或它们的组合；
并且，所述第一活性成分和第二活性成分的重量比为5:(1-4.5)，其中所述重量比以丹酚酸B和人参皂苷Rg1计。
在另一优选例中，所述的活性成分的组合由(a)第一活性成分和(b)第二活性成分构成。
在所述的活性成分组合中，第一活性成分和第二活性成分可以是相互独立的，也可以使组合在一起，以活性成分组合物的形成存在。
本发明还提供了一种药盒，所述的药盒包括：
第一药物组合物，所述第一药物组合物包括：(a)第一活性成分，所述第一活性成分选自下组：丹酚酸B、其立体异构体、其晶型、其药学上可接受的盐或酯、含丹酚酸B的提取物、或它们的组合；和药学上可接受的载体；
第二药物组合物，所述第二药物组合物包括：(b)第二活性成分，所述第二活性成分选自下组：人参皂苷Rg1、其立体异构体、其晶型、其药学上可接受的盐或酯、含人参皂苷Rg1的提取物、或它们的组合；和药学上可接受的载体；
并且，所述第一药物组合物和第二药物组合物是联合施用的，其中所述第一活性成分和第二活性成分的重量比为5:(1-4.5)，其中所述重量比以丹酚酸B和人参皂苷Rg1计。
在另一优选例中，所述的药盒还包括说明书。
在另一优选例中，所述第一药物组合物和第二药物组合物是不同的(或独立的)药物化合物、或是同一药物组合物。
在另一优选例中，所述的第一药物组合物和第二药物组合物在施用时同时给药、分别给药或顺序给药。
本发明的药物组合物、活性成分组合、药盒均可采用常规方法和设备进行制备。
用途和施用方法
本发明提供了一种本文所述药物组合物、活性成分的组合或药盒的用途，用于制备一药物或药盒，所述药物或药盒用于(i)预防和/或治疗缺血性疾病；(ii)预防和/或治疗缺血再灌注损伤；和/或(iii)抑制乳酸脱氢酶。
在本发明中，所述缺血性疾病是指组织或器官由于缺血而造成的损伤或病变。所述“缺血”指组织或器官的供血较正常值降低，尤其是指组织或器官中所供应的血液不能满足所述组织或器官新陈代谢的需要。
本发明的活性成分对缺血性疾病具有明显的治疗效果。常见的缺血性疾病包括但并不限于：缺血性心脏病、缺血性脑卒中、缺血性肝损伤、缺血性肺损伤、缺血性肾损伤，或其组合。
本发明中，所述的缺血性心脏病是由冠状动脉循环改变而导致心肌缺血、缺氧而引起的心脏病。常见的缺血性心脏病包括下组(但并不限于)：冠心病、心肌梗死、心肌纤维化、心绞痛，或其组合。
本发明中，所述的缺血再灌注损伤包括再灌注所导致的组织器官损伤。所述组织器官包括下组(但并不限于)：心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、神经，或其组合。所述组织器官损伤还包括手术后再灌注损伤，所述手术包括下组(但并不限于)：动脉搭桥术、溶栓疗法、经皮腔内冠脉血管成形术、体外循环下心脏手术、心脏骤停后心、肺和/或脑复苏、断肢再植或器官移植。所述再灌注损伤还包括：休克后微循环疏通后的再灌注损伤、冠状动脉痉挛缓解后的再灌注损伤。
本发明中，所述预防和/或治疗缺血性疾病、预防和/或治疗缺血再灌注损伤等应用，包括在预防性的应用，也包括事后改善性的应用。例如，对于再灌注损伤，包括在再灌注之前、之中、和/或之后施用本发明的药物组合物、活性成分的组合物或药盒，以对再灌注损伤后的组织器官的保护、修复或功能的改善或增强。
本发明的药物组合物、活性成分的组合或药盒中，第一活性成分与第二活性成分还可以与其他药学上可接受的化合物联合给药，包括(但并不限于)：降血压药、降血脂药、降糖药、抗血小板聚集药等。
本发明的药物组合物、活性成分的组合或药盒还可用于抑制乳酸脱氢酶。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)是将糖转化为细胞能量过程中所需的一种酶，存在于全身多种器官和组织中，例如：肝脏、心脏、胰腺、肾脏、骨骼肌、淋巴组织和血细胞。乳酸脱氢酶在丙酮酸被转化成乳酸的糖酵解的最后步骤中涉及，尽管正常组织通常仅当氧气供应不足时使用糖酵解，但癌症组织严重依赖有氧糖酵解，而与氧气供应水平无关，LDH抑制剂被用于涉及从氧化磷酸化到糖酵解的代谢转化的病理，例如，可用于(但并不限于)：治疗患有其中出现从氧化磷酸化到糖酵解的代谢转化的癌症、纤维化或其它病症的患者。同时乳酸脱氢酶是负责肝脏和胰脏的线粒体/过氧化物酶体甘氨酸代谢通路中将乙醛酸转化为草酸的酶，抑制LDH可用于治疗慢性肾病，如高草酸尿症。本发明的药物组合物可使血液中LDH浓度降低和/或抑制LDH的活性，可作为LDH抑制剂。
本发明的药物组合物、活性成分的组合或药盒中，第一活性成分和第二活性成分可以在施用时同时给药、分别给药或顺序给药。
本发明的药物组合物、活性成分的组合或药盒中，第一活性成分和第二活性成分的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性成分也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明活性成分的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明的药物组合物、活性成分的组合或药盒中，按丹酚酸B和人参皂苷Rg1总量计，活性成分的治疗有效剂量的一般范围将是：约1-2000mg/天、约10-约1000mg/天、约10-约500mg/天、约10-约250mg/天、约10-约100mg/天，或约10-约80mg/天。治疗有效剂量将以一个或多个剂量给予。然而，应理解，对于任何特定患者的本发明活性成分的特定剂量将取决于多种因素，例如，待治疗的患者的年龄、性别、体重、一般健康状况、饮食、个体响应，给予时间、待治疗的疾病的严重性、剂型、应用模式和伴用药物。给定情况的治疗有效量能用常规实验测定，并在临床医生或医师能力和判断范围内。在任何情况中，所述活性成分将基于患者的个体情况以多个剂量给予并以允许递送治疗有效量的方式给予。
本发明的主要优点包括：
1.与现有技术相比，本发明的药物组合物具更优地活性成分配比，对治疗缺血性疾病、缺血再灌注损伤具有更佳疗效(如优异的减小梗死面积、改善组织脏器功能的效果)。
2.本发明的药物组合物不仅对心脏，而且还对脑、肝、肺和肾脏等不同器官的再灌注损伤具有治疗效果，可广泛应用于多种组织器官的缺血再灌注损伤。
3.本发明的药物组合物还具有抑制乳酸脱氢酶的效果，能快速降低血液中乳酸脱氢酶含量和/或活性，可作为乳酸脱氢酶抑制剂，用于与乳酸脱氢酶相关疾病。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
一、试剂和材料
1.1动物
清洁级雄性Wistar大鼠134只，体重220±10g；其中56只用于不同配比组合药物对心肌梗死大鼠心脏的保护作用研究；16只用于组合药物对缺血再灌注心脏的保护作用研究；32只用于组合药物对缺血再灌注肾脏的保护作用研究；30只用于评价组合药物对于肺栓塞及其并发症的防治效果。
清洁级雄性SD大鼠96只，体重220±10g；其中30只用于组合药物对缺血性脑梗死的保护作用研究；50只用于组合药物对脑缺血再灌注损伤的保护作用研究；16只用于组合药物对缺血再灌注肝脏的保护作用研究。
Wistar和SD大鼠由中国科学院上海实验动物中心提供，饲养于中国科学院上海药物研究所实验动物中心SPF级动物室，恒温22±2℃，12h光照，标准饮食，自由饮水。
给药方式：如未特别说明，实施例中的给药方式为尾静脉注射。
1.2主要试剂与耗材
Figure BDA0002656222880000121
1.3主要仪器
Figure BDA0002656222880000122
1.4通用实验方法
血液的分离与处理
腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉剂麻醉大鼠，仰卧固定在鼠板上。用剪刀沿正中线剪开腹部，将腹腔内容物取出，用干棉球将腹腔内的液体擦干，在腹主动脉用5mL注射器取血至2ml EP管中；血液于冰上静置0.5小时后，在4℃，8000r/min条件下将采集到的血液离心10min，取上清液，并将血清分装于0.5ml EP管内，置于-80℃冰箱保存，待用。
TTC染色
0.5g TTC粉末溶解于100ml PBS，避光保存，现用现配。将新鲜的组织横切为多片，放置在带盖小盒中加入TTC溶液，置于湿盒中避光，在37℃恒温烘箱内温育20min，期间翻动几次使组织均匀接触染液，20min后拿出拍照。
样品固定、脱水、石蜡包埋、切片
甲醛100ml，磷酸二氢钠4g，磷酸氢二钠6.5g，溶于900mL蒸馏水中，配制成体积比为10％的多聚甲醛固定液。将组织于多聚甲醛固定液中固定72h后，自来水冲洗2h，放置于脱水机中设定程序自动脱水，依次经75％乙醇1.5h，95％乙醇1.5h，100％乙醇1.5h，二甲苯1.5h、石蜡1.5h。提前2h打开石蜡包埋机熔化石蜡，温度控制在60℃。待石蜡融化后，脱水后的组织进行石蜡包埋，倒入包埋盒，用加热的镊子将浸蜡后的组织块放入包埋框内，轻轻移至冷台，待石蜡凝固后取下石蜡块准备切片。切片前，将蜡块放入冰箱内预冷，冷却后切片机连续切5μm厚度的石蜡切片。切片在摊片机38℃温水上展开，用涂有多聚赖氨酸的载玻片捞片，自然风干用于后续的病理组织学染色。
HE染色
将组织切片放置在65℃烤片机上烤60min，迅速放入二甲苯脱蜡15min，依次在100％、95％、75％乙醇中浸泡5min，流水冲洗5min后，苏木素染液中置15min，水洗5min，再放入1％盐酸乙醇分化液(配制：把3mL浓盐酸加入到300mL75％乙醇中，搅拌均匀即可)3s，流水返蓝5min，放入1％伊红溶液10min，快速冲洗掉多余的伊红染液后转移至75％乙醇浸泡4min，95％乙醇中4min，100％乙醇中5min，二甲苯透明15min，最后用二甲苯中性树胶封片，待树胶风干后，采用体视显微镜拍摄大体图，BX51显微镜拍摄局部放大图。
PAS染色
将组织切片放置在65℃烤片机上烤60min，迅速放入二甲苯脱蜡15min，依次在95％、70％、30％乙醇中浸泡2min，蒸馏水浸泡2分钟，将配制好的试剂一应用染液滴加在玻片的样本上，使其全部覆盖样本，将此玻片轻轻平放于染色架上，室温避光孵育8-15分钟。取出染色玻片，自来水流水缓慢冲洗玻片3-5分钟。玻片未完全干透前，滴加试剂二应用液于玻片样本上，用洗耳球将染液吹匀并全部覆盖样本，然后置于室温孵育8-15分钟。孵育结束后，取出染色玻片，自来水流水缓慢冲洗玻片30-60秒，自然晾干。滴加试剂三复染液染色20-30秒，然后流水冲净，待干后用封片剂封片，待封片剂风干后，采用体视显微镜拍摄大体图，BX51显微镜拍摄局部放大图。
生化指标检测
LDH检测按照乳酸脱氢酶测定试剂盒(乳酸底物法，希森美康生物科技(无锡)有限公司，批号：R8004)，使用全自动生化分析仪(JCA-BM6010/C，希森美康医用电子(上海)有限公司)对大鼠血清进行检测。
血流动力学检测
大鼠腹腔注射40mg/kg戊巴比妥钠麻醉剂麻醉后，分离右颈总动脉并插入米勒导管，用Powerlab8/30生理记录仪(ML870，ADINSTRUMENTS)记录颈动脉压、左心室最大收缩速率、左心室最大舒张速率、左心室末端舒张压等血流动力学指标。
左、右肺指数的计算
大鼠称重后，腹腔注射30mg/kg舒泰麻醉，分离左肺、右肺并称重。依据左肺、右肺与体重的比值分别计算左、右肺指数。
肺间质面积的定量
针对苏木素-伊红染色的肺组织进行定量分析。每个样本除去气管、支气管和肺泡等肺实质，其余紫色部分代表肺间质，每个组织样本在相同倍率下拍照，对肺间质面积进行定量。
免疫组化染色考察中性粒细胞的浸润
将石蜡包埋的组织在65℃，烤片45-50分钟；然后二甲苯15分钟、无水乙醇5分钟、95％乙醇5分钟、75％乙醇3分钟、流水冲洗1分钟、脱蜡至水相；微波条件下，通过柠檬酸修复液修复抗原；于37℃，10％山羊血清孵浴30分钟；4℃，CD44抗体孵浴过夜；37℃，二抗孵浴1小时；滴入DAB溶液40s；苏木素复染15分钟；1％盐酸乙醇分化5秒；二甲苯透化；中性树胶封片。采用Image Pro Plus软件定量每个样本的阳性细胞面积和光密度，平均光密度值通过光密度与阳性细胞面积的比值计算。
动物的行为学检测
手术前两天和术后一天对所有实验动物进行Longa评分、NSS评分和EBST检测。
a.Longa评分法：0分：正常，无神经功能损伤；1分：左侧前爪不能完全伸展，轻度神经功能损伤；2分：行走时，大鼠向左侧(偏瘫侧)转圈，中度神经功能损伤；3分：行走时，大鼠身体向左侧(偏瘫侧)倾倒，重度神经功能损伤；4分：不能自发行走，有意识丧失。
b.NSS评分法：0分：神经功能正常；1分：轻度神经功能缺损(提尾时左前肢屈曲)；2分：中度神经功能缺损(行走时向左侧转圈)；3分：中度神经功能缺损(向左侧倾斜)；4分：无法行走，意识减退；5分：与缺血有关的死亡。
c.Elevated Body Swing Test：测量时首先用手提起大鼠的尾根部，大鼠头部悬垂距平面5cm左右，这时大鼠的头部会向左或向右旋转，向单侧旋转的角度大于100时为计数标准，记录旋转的方向和角度，一次试验后让大鼠休息一分钟，在进行下一次试验，重复20次，记录总的方向和次数。
数据统计方法
使用GraphPad Prism 6.0(GraphPad软件，LA Jolla，CA，美国)进行数据分析，所有计量数据均用平均值±标准差表示，均数间采用单因素方差分析(One-way ANOVA)确认方差是否齐性。若n值一致，采用Tukey法进行比较；若n值不一致，采用Bonferroni法进行比较，P﹤0.05具有统计学意义。
二、动物实验
实施例1
1.1心肌梗死模型的制备
腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)，将大鼠固定于手术板上胸部被毛将笔型静脉留置针套插入气管连接动物呼吸机碘酒消毒在胸部左侧3-4肋间剪开皮肤钝性分离肌肉，撑开第三根和第四根肋骨间隙并固定暴露出心脏上部，撕开心包，持针器夹持5-0带线缝合针以左冠状静脉为标志，从左心耳尖、肺动脉圆锥和心耳交界下1mm处穿线并结扎，结扎冠状动脉后心肌组织立即由红润转为苍白。假手术动物除不结扎冠脉动脉左前降支以外，其余手术操作完全相同。
1.2动物分组及给药方式
56只大鼠随机分为以下7组：假手术组、缺血模型组、丹酚酸B与人参皂苷Rg1联合给药组(分别按照5:4、5:3、5:2、5:1和2:5比例配制)，每组8只。采用双盲的方式给药，即手术者不参与给药，数据统计人员不知道分组信息。将丹酚酸B与人参皂苷Rg1分别按5:4、5:3、5:2、5:1、2:5混合，混匀后随机编号，溶解后，用微孔滤膜过滤待用。假手术组和心肌梗死模型组按照体重给等体积生理盐水。手术后立即按15mg/kg尾静脉注射给药一次，24小时后再给药一次，随后腹主动脉取血以及收集心脏进行心脏组织学检测。
1.3实验结果与分析
1.3.1 SalB/Rg1减小心脏梗死面积
如图1所示，假手术组无梗死区(0％)。与缺血模型组相比，2:5组梗死面积下降了23.4％；5:4组梗死面积下降了15.3％；5:3组梗死面积下降了35.2％(P＜0.01)；5:2组梗死面积下降了33.2％(P＜0.01)；5:1组梗死面积下降了25.1％；*表示与假手术组相比，***P＜0.001；#表示与缺血模型组相比，#P＜0.05。并且，5:3组和5:2组相较于2:5组降低梗死面积效果更为明显，梗死面积相较于2:5组分别降低1.50倍(5:3)和1.42(5:2)倍。
1.3.2 SalB/Rg1减少血液中LDH含量
血液中LDH含量结果如图2所示，与缺血模型组相比，2:5组LDH含量下降了19.7％；5:4组LDH含量下降了7.5％；5:3组LDH含量下降了23.0％；5:2组LDH含量下降了37.9％；5:1组LDH含量下降了13.7％；。*表示与假手术组相比，*P＜0.05。与2:5组相比，5:2组LDH含量下降了1.9倍。
1.3.3 SalB/Rg1改善心脏结构
为进一步评价SalB/Rg1对心脏组织结构的保护，分别分析心脏的梗死区(上)，梗死边缘区(中)，梗死远端区(下)的心脏结构(如图3所示)。缺血模型组的心脏梗死区结构破坏严重，有大量炎症细胞浸润，心肌细胞表现为水肿、坏死、细胞核丢失，肌纤维呈条索状；在梗死边缘区，炎症细胞明显浸润，心肌纤维变长呈波浪状。与缺血模型组比较，无论在梗死区还是梗死边缘区，SalB/Rg1对上述损伤都表现出不同程度的改善，其中5:2组大鼠心肌组织结构改善最为明显：在梗死区，炎症细胞浸润明显减少，心肌细胞水肿、坏死减弱，细胞核丢失数量减少，肌纤维排列较规则；在梗死边缘区，炎症细胞浸润减少，心肌纤维排列规则。各组动物在梗死远端区的细胞排列有序而紧密规则，并无明显差异。
上述结果说明，相对缺血模型组，SalB/Rg1联合给药对减小梗死面积均有效果，且令人惊讶的，与现有技术中公开的SalB/Rg1最佳配比(2:5)相比，本发明中SalB/Rg1为5:3和5:2的组给药后，大鼠心脏的梗死面积更小，且在降低血液中LDH含量和心脏结构改善方面展现出更优异的疗效。
实施例2
使用SalB/Rg1为5:2的组合和现有技术中公开的SalB/Rg1为2：5的最佳配比组合在心肌缺血再灌注损伤模型中进行进一步对比。
2.1心肌缺血再灌注损伤模型的制备
腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)，将大鼠固定于手术板上，胸部被毛。将笔型静脉留置针套插入气管连接动物呼吸机，碘酒消毒，在胸部左侧3-4肋间剪开皮肤钝性分离肌肉，撑开第三根和第四根肋骨间隙并固定暴露出心脏上部，撕开心包，持针器夹持5-0带线缝合针以左冠状静脉为标志，从左心耳尖、肺动脉圆锥和心耳交界下1mm处穿线，两根丝线打结的地方放入一根2-0号线并结扎，结扎冠状动脉后心肌组织立即由红润转为苍白。心肌缺血40分钟后，将丝线剪开，拿掉2-0号线进行心肌缺血再灌注，1h后进行各项检测评价。假手术动物除不结扎冠脉动脉左前降支以外，其余手术操作完全相同。
2.2动物分组及给药方式
16只220g左右大鼠随机分为以下2组：丹酚酸B与人参皂苷Rg1联合给药组(其中按照5:2和2:5比例配制)，每组8只。大鼠心肌缺血40分钟后再灌，再灌的同时立即按15mg/kg尾静脉注射给药，再灌注1小时后进行血流动力学检测，随后收集心脏进行心脏组织学检测。
2.3实验结果
在心脏缺血再灌注损伤模型上，实验结果如图4，图A为梗死面积TTC染色代表图，图B为梗死面积定量结果，图C为HE染色代表图。与SalB/Rg1(2:5)相比，SalB/Rg1(5:2)大鼠心脏梗死面积下降了15.03％。为进一步评价SalB/Rg1对缺血再灌注损伤心脏组织结构的保护，分别分析心脏的梗死区(上)，梗死边缘区(中)，梗死远端区(下)的心脏结构(图C)。与SalB/Rg1(2:5)相比，SalB/Rg1(5:2)在梗死区和梗死边缘区，更加显著地抑制炎症细胞浸润，心肌细胞坏死、细胞核丢失等损害。各组动物在梗死远端区的细胞排列有序而紧密规则，并无明显差异。
图5和图6显示血流动力学结果，与SalB/Rg1(2:5)相比，SalB/Rg1(5:2)提高最大舒张速率18.2％(P＜0.05)、提高最大收缩速率11.6％，说明SalB/Rg1(5:2)相较于SalB/Rg1(2:5)改善心脏功能的效果更加优异；图6显示末端舒张压和平均动脉压无明显差别，说明SalB/Rg1(5:2)相较于SalB/Rg1(2:5)在血压调控方面无不利效果。
实施例3
SalB/Rg1(5:2)与SalB/Rg1(2:5)在肾脏缺血再灌注损伤模型中进行进一步对比。
3.1肾脏缺血再灌注损伤模型的制备
腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)，将大鼠固定于手术板上，腹部被毛碘酒消毒腹部正中切口2.5cm，分离肠道暴露出左侧肾脏，分离肾脏周围脂肪，动脉夹夹闭左侧肾蒂(包括肾动脉、肾静脉、肾盂)40分钟造成肾脏缺血，右侧肾脏和左侧肾脏同样操作。40分钟后，取下左右两侧肾脏的动脉夹，24h后造成肾脏缺血再灌注损伤，缝合肌肉和皮肤。假手术动物除不夹闭两侧肾蒂以外，其余手术操作完全相同。
3.2动物分组及给药方式
32只大鼠随机分为以下4组：假手术组、缺血再灌注模型组、丹酚酸B与人参皂苷Rg1联合给药组(其中按照5:2和2:5比例配制)，每组8只。假手术组和肾脏缺血再灌注模型组按照体重给等体积生理盐水。大鼠肾脏缺血40分钟后再灌，再灌的同时立即按15mg/kg尾静脉注射给药一次，24小时后再给药一次，随后收集肾脏进行肾脏组织学检测。
3.3实验结果
为评价SalB/Rg1对缺血再灌注损伤肾脏组织结构的保护，分析肾脏皮质的结构(如图7)。缺血再灌模型组的肾脏皮质有大量炎症细胞浸润，红细胞大量渗出，细胞间隙增大。与缺血再灌模型组比较，SalB/Rg1对上述损伤都表现出不同程度的改善，而5:2组大鼠肾脏组织结构改善最为明显：肾脏皮质炎症细胞浸润和红细胞渗出均明显减少，细胞间隙减小。
为评价SalB/Rg1对缺血再灌注损伤肾脏组织糖原堆积的作用，分析肾脏皮质糖原堆积的情况(如图8)。缺血再灌模型组的肾脏系膜区糖原聚集，肾小球系膜细胞增生，基底膜增厚，细胞核脱落。与缺血再灌模型组比较，SalB/Rg1对上述损伤都表现出不同程度的改善，与2:5组相比，5:2组大鼠肾脏糖原堆积明显减少，肾小球系膜细胞增生改善，细胞核脱落数量减少。
实施例4
评价丹酚酸B/人参皂苷Rg1联用(5:2)对大鼠肺栓塞及其并发症的防治效果
4.1实验动物及模型制备
30只雄性Wistar大鼠随机分为以下3组：正常对照组、模型对照组、丹酚酸B/Rg1组(20mg/kg)，每组10只。正常对照组分别于第0、7、14、21天，按5ml/kg的剂量给予生理盐水，另外两组在对应时间给予聚苯乙烯微球。聚苯乙烯微球的浓度为20万粒/ml，直径为45μm。分别于第0、7、14、21天，按100万粒/kg(5ml/kg)的剂量，对Wistar大鼠尾静脉注射聚苯乙烯微球。
给予聚苯乙烯微球的两组动物，一组于第7天开始每天注射生理盐水作为模型对照组，连续施用28天；另一组第7天开始每天以20mg/kg的剂量腹腔注射丹酚酸B/Rg1(比例5：2)，连续28天。所有动物在第35天取材，进行心、肺组织学检测。
4.2实验结果
4.2.1丹酚酸B/Rg1(5:2)联用可改善微球诱导的肺栓塞
丹酚酸B/Rg1联用可改善微球诱导的肺栓塞。如图9所示，与模型组相比，丹酚酸B/Rg1显著降低左肺指数(A)和右肺指数(B)；从组织染色图可以看出，丹酚酸B/Rg1显著改善肺脏结构(C)，使肺间质的面积明显下调(D)，这证明丹酚酸B/Rg1对肺功能的改善效果；另外，从(E)可以看出，丹酚酸B/Rg1还可以抑制中性粒细胞浸润于肺脏组织，其抑制效果具有显著的统计学意义(F),提示丹酚酸B/Rg1显著抑制肺栓塞的发生。
4.2.2丹酚酸B/Rg1联用改善肺栓塞引起的心肌肥大
肺栓塞的主要并发症是心肌肥大，在HE染色的心肌组织上，肥大的心肌细胞可以通过细胞横截面积的大小评价。如图10所示，A是心脏HE染色的代表图，B是心肌细胞横截面积的定量图，丹酚酸B/Rg1显著减少了肺栓塞诱导的心肌肥大的发生。
实施例5
丹酚酸B/Rg1联用(5:2)治疗大鼠急性脑梗死
5.1实验动物及模型制备
30只雄性SD大鼠，随机分为以下3组：假手术组、急性脑梗死模型组、丹酚酸B/人参皂苷Rg1联用组(联用组配比为5:2，给药及剂量为10mg/kg)，每组10只。对大鼠实施麻醉、固定、胸部被毛和碘酒消毒后，依次分离肌肉、皮下结缔组织、颈前肌群、暴露颈总动脉(CCA)；距CCA分叉部4mm处剪一小口、栓线从小口插入到颈内动脉(ICA)，从血管分叉处推动线栓约20mm,阻塞大脑中动脉(MCA)诱导脑梗的发生。脑梗死的动物给予10mg/kg丹酚酸B/人参皂苷Rg1治疗(丹酚酸B/Rg1组)；脑梗死的动物给予生理盐水(模型组)；假手术组动物除不插入线栓，其余手术操作完全相同，并在相同的时间点给予生理盐水(假手术组)。
5.2实验结果
5.2.1丹酚酸B/Rg1降低脑梗死面积
脑梗死面积通过TTC染色进行评价，如图11所示，其中图A为大脑TTC染色代表图，梗死区域被染为白色，非梗死区域被染为红色。图B为梗死面积定量结果(白色区域面积/(红色区域面积+白色区域面积)百分比)，丹酚酸B/Rg1显著降低梗死面积，与模型组相比，丹酚酸B/Rg1组脑梗死面积降低了39.42％。注：***p<0.001VS假手术组，&&p<0.01VS模型组。
5.2.2丹酚酸B/Rg1改善脑梗死后大鼠行为学评分
采用Longa评分、NSS评分和EBST评价术前和术后大鼠神经运动功能，结果如图12所示。依据三种评分方法，三组动物在手术前都未见明显行为学差异。在脑梗死造模后，依据EBST评分(p<0.001)、Longa评分(p<0.05)和NSS评分(p<0.05)，丹酚酸B/Rg1显著改善神经运动功能。
5.2.3丹酚酸B/Rg1保护大脑皮层神经细胞
大脑皮层是调节、控制躯体运动的高级中枢。如图13所示，A为大脑皮层的HE染色代表图；B为HE染色单个图像视野下神经细胞数定量结果；C为大脑皮层尼式染色代表图；D是单个图像视野下大脑皮层尼氏小体数的定量结果。结果显示，无论是HE染色，还是尼氏染色，丹酚酸B/Rg1都显现出显著的神经细胞的保护效果。注：***p<0.001VS假手术组，&&p<0.01，&&&p<0.001VS模型组。
5.2.4丹酚酸B/Rg1保护海马神经细胞
从解剖学的角度来看，海马常被看做侧脑室颞角的一个内侧凸起，它由CA1、CA2、CA3和CA4四个区域组成。神经细胞的细胞体与其神经网区域呈层状排列。图14是CA1、CA2、CA3的HE染色图。与假手术组相比，模型组动物呈现明显空泡化、神经元胞体皱缩、丢失和数量减少；与模型组相比，丹酚酸B/Rg1组存活的神经细胞增多，神经细胞排列有序、神经细胞数量明显提升。
图15是CA1、CA2、CA3的尼式染色代表图及其定量结果。CA1、CA2和CA3区尼氏染色的代表图(A、B、C)呈现的细胞数量，与HE染色的趋势相一致。本动物模型的左脑是损伤部位，右脑呈现正常组织学结构。左右脑灰度差值/图像视野，反映了模型动物神经细胞的损害程度，图B、图D和图F的定量结果显示丹酚酸B/Rg1保护神经细胞的完整性。从图15-16可以看出无论HE染色，还是尼氏染色，丹酚酸B/Rg1都显现出都对海马CA1、CA2、CA3的保护效果。
实施例6
丹酚酸B/Rg1联用(5:2)治疗大鼠脑缺血再灌注损伤
6.1实验动物及模型制备
30只雄性SD大鼠随机分为以下3组：假手术组、脑缺血再灌注损伤模型组、依达拉奉(购自国药集团国瑞药业有限公司，批号：1909116)组、丁苯酞(购自石药集团恩必普药业有限公司，批号：6182002117)组、丹酚酸B/Rg1联用组(5:2，给药及剂量为5mg/kg)，每组10只。
对大鼠实施麻醉、固定、胸部被毛和碘酒消毒后，依次分离肌肉、皮下结缔组织、颈前肌群、暴露颈总动脉(CCA)；距CCA分叉部4mm处剪一小口、栓线从小口插入到颈内动脉(ICA)，从血管分叉处推动线栓约20mm,阻塞2h大脑中动脉(MCA)诱导脑梗的发生,2h后拔出线栓制作脑缺血2h再灌注24h的模型。拔出线栓前10分钟进行给药(尾静脉注射)：给予5mg/kg丹酚酸B/人参皂苷Rg1(丹酚酸B/Rg1组)；给予5mg/kg依达拉奉(依达拉奉组，按有效成分计)；给予5mg/kg丁苯酞(丁苯酞组，按有效成分计)；给予5mg/kg生理盐水(模型组)；假手术组动物，除不插入线栓，所有手术操作完全相同，给予5mg/kg生理盐水。
6.2实验结果
6.2.1丹酚酸B/Rg1降低再灌注损伤的脑梗死面积
如图16所示，通过TTC染色对脑梗死面积进行评价，各组染色结果的代表图见图A，梗死面积定量结果见图B，可以看出，丹酚酸B/Rg1与依达拉奉、丁苯酞相比，降低梗死面积的效果更加显著。注：***p<0.001,*p<0.1VS假手术组，&&p<0.01VS模型组。
6.2.2丹酚酸B/Rg1改善脑缺血再灌注后大鼠行为学评分
采用Longa评分评价术前和术后大鼠神经运动功能，结果如图17所示。依据Longa评分方法，五组动物在手术前都未见明显行为学差异。在造模后，依据Longa评价，丹酚酸B/Rg1相较于依达拉奉、丁苯酞呈现更佳的改善神经运动功能的效果。
6.2.3丹酚酸B/Rg1保护大脑皮层神经细胞
如图18所示，A是大脑皮层的HE染色；B是大脑皮层的尼式染色。与假手术组相比，模型组可见明显空泡化、神经元胞体皱缩、丢失、数量减少。与模型组相比，丹酚酸B/Rg1组存活的神经细胞显著高于模型组、依达拉奉组和丁苯酞组。无论HE染色，还是尼氏染色，丹酚酸B/Rg1都显现出都神经细胞的保护效果，且呈现出相较于依达拉奉、丁苯酞更加优异的疗效。
6.2.4丹酚酸B/Rg1保护海马神经细胞
图19是CA1、CA2、CA3的HE染色代表图，图20是CA1、CA2、CA3的尼式染色代表图。无论HE染色，还是尼氏染色，丹酚酸B/Rg1都显现出都对海马CA1、CA2、CA3的保护效果，且呈现出相较于依达拉奉、丁苯酞更加优异的疗效。
实施例7
丹酚酸B/人参皂苷Rg1联用(5:2)对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用
7.1实验动物及模型制备
16只雄性SD大鼠，随机分成两组，一组是肝缺血再灌注损伤模型组，一组是丹酚酸B/Rg1(5：2)组合治疗组。
肝缺血再灌注损伤的模型制备方法如下；对大鼠称重麻醉、腹部被毛、固定于手术台；碘伏消毒，腹部正中纵行切口5cm至剑突；依次剪开皮肤、肌肉和腹膜，充分显露肝脏及胃肠道；分离肝周围韧带；使用显微止血夹夹闭肝脏中叶；暴露左叶门静脉、肝动脉及胆管；肝叶颜色由红色逐渐变为苍白，说明肝血流阻断成功。血流阻断1h后，去除止血夹；肝叶颜色逐渐红润，提示肝脏再灌注成功。模型对照组在再灌注的同时给予生理盐水；丹酚酸B/Rg1联用组在再灌注的同时给予10mg/kg的丹酚酸B/人参皂苷Rg1(5：2)，复灌6小时后取材评价肝脏保护效果。
7.2实验结果
对上述肝脏组织进行HE染色。结果如图21(上图为200X，下图为400X)所示，缺血再灌注6h后，模型组肝小叶结构不完整，肝细胞排列紊乱，充血，肿胀，并明显可见细胞坏死，丹酚酸B/Rg1能够改善肝细胞结构,但效果不如心、脑明显。
讨论
在现有技术中，实验结果显示不同药物对减小梗死面积的效果：丹酚酸B<人参皂苷Rg1<<丹酚酸B:人参皂苷Rg1＝2:5给药组，(参见CN2011102229806，图3)，所以容易认为人参皂苷Rg1对减小心脏梗死面积的效果优于丹酚酸B，联合用药时人参皂苷Rg1占比更大效果更好，但令人惊奇地，与现有技术中公开的最佳配比组合(SalB/Rg1为2:5)的相比，本发明的药物组合物(丹酚酸B重量>人参皂苷Rg1)在治疗心肌梗死、脑梗死、肺栓塞等缺血性疾病和心脏、脑缺血再灌注损伤(如减小梗死面积、改善组织脏器结构、功能)方面展现出更优异的效果。意外地，本发明的药物组合物还可使血液中LDH浓度降低和/或抑制LDH的活性，可作为LDH抑制剂。
不同组织器官(如：心、肝、脾、肺、肾、脑以及肌肉、神经等)，由于其组织结构、功能、血管分布，以及对血液的需求等各不相同，药物对不同器官的缺血灌注损伤是否都具有治疗作用，结果难以预测。令人惊讶地，本发明的药物组合物不仅对心脏，而且还对脑、肾脏、肝脏等器官的缺血再灌注损伤也展现出优异的改善器官功能的效果，可广泛用于多种组织器官的缺血再灌注损伤。
更意外地，SalB/Rg1联合用药对心、脑的缺血性疾病、缺血再灌注损伤表现出优于其他组织器官的治疗效果，尤其是对缺血性脑卒中、和缺血性脑卒中后的再灌注损伤的保护效果尤为令人惊讶，不但显著降低梗死面积，还能显著改善动物的行为，提示该本发明的药物组合物对心脏疾病和脑疾病具有优异的治疗前景。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (15)

1.一种药物组合物，其特征在于，包括：
(a)第一活性成分，所述第一活性成分选自下组：丹酚酸B、其立体异构体、其晶型、其药学上可接受的盐或酯、含丹酚酸B的提取物、或它们的组合；
(b)第二活性成分，所述第二活性成分选自下组：人参皂苷Rg1、其立体异构体、其晶型、其药学上可接受的盐或酯、含人参皂苷Rg1的提取物、或它们的组合；和
(c)药学上可接受的载体；
并且，所述第一活性成分和第二活性成分的重量比为5:(1-4.5)，其中所述重量比以丹酚酸B和人参皂苷Rg1计。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述第一活性成分和第二活性成分的重量比5:(1-4.0)，较佳地5:(1.2-3.8)，更佳地5:(1.5-3.5)。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述第一活性成分和第二活性成分的重量比为5:(1.8-3.2)，较佳地，5:(1.9-3.1)，更佳地5:(2-3)，最佳地5:2。
4.如权利要求1-3中任一所述的药物组合物，其特征在于，第一活性成分为丹酚酸B，而第二活性成分为人参皂苷Rg1。
5.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型选自下组：液体制剂(如溶液、乳液、悬浮液)、固体制剂(如冻干制剂)、气体剂型、半固体剂型。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述剂型选自下组：注射剂(如注射液或粉针剂)、口服制剂(如胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆、口服液或酊剂)、舌下含服制剂、呼吸道给药制剂、皮肤给药制剂、粘膜给药制剂，更佳地，所述剂型为注射剂。
7.一种活性成分的组合，其特征在于，所述的活性成分的组合包括：
(a)第一活性成分，所述第一活性成分选自下组：丹酚酸B、其立体异构体、其晶型、其药学上可接受的盐或酯、含丹酚酸B的提取物、或它们的组合；
(b)第二活性成分，所述第二活性成分选自下组：人参皂苷Rg1、其立体异构体、其晶型、其药学上可接受的盐或酯、含人参皂苷Rg1的提取物、或它们的组合；
并且，所述第一活性成分和第二活性成分的重量比为5:(1-4.5)，其中所述重量比以丹酚酸B和人参皂苷Rg1计。
8.一种药盒，其特征在于，所述的药盒包括：
第一药物组合物，所述第一药物组合物包括：(a)第一活性成分，所述第一活性成分选自下组：丹酚酸B、其立体异构体、其晶型、其药学上可接受的盐或酯、含丹酚酸B的提取物、或它们的组合；和药学上可接受的载体；
第二药物组合物，所述第二药物组合物包括：(b)第二活性成分，所述第二活性成分选自下组：人参皂苷Rg1、其立体异构体、其晶型、其药学上可接受的盐或酯、含人参皂苷Rg1的提取物、或它们的组合；和药学上可接受的载体；
并且，所述第一药物组合物和第二药物组合物是联合施用的，其中所述第一活性成分和第二活性成分的重量比为5:(1-4.5)，其中所述重量比以丹酚酸B和人参皂苷Rg1计。
9.如权利要求7的活性成分的组合、包含其的药物组合物或药盒的用途，其特征在于，用于制备一药物或药盒，所述药物或药盒用于(i)预防和/或治疗缺血性疾病；(ii)预防和/或治疗缺血再灌注损伤；和/或(iii)抑制乳酸脱氢酶。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述缺血性疾病选自下组：由于组织和血管原发性病变导致的组织器官缺血损伤，和/或继发性原因导致的缺血性病变，如外伤导致的血管离断、炎症引起的血管闭塞、肿瘤导致的血管压迫。
11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述缺血性疾病选自下组：缺血性心脏病、缺血性脑卒中、肺栓塞、缺血性肝损伤、缺血性肾病、缺血性神经损伤，或其组合。
12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述缺血性心脏病包括：冠心病、心肌梗死、心绞痛、心肌纤维化、心衰，或其组合。
13.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的缺血再灌注损伤为再灌注所导致的组织器官损伤。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述组织器官选自下组：心、脑、肝、脾、肺、肾、肌肉、神经，或其组合。
15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述组织器官损伤为手术后再灌注损伤和/或溶栓治疗后的再灌注损伤，较佳地，所述手术选自下组：动脉搭桥术、取栓疗法、经皮腔内冠脉血管成形术、体外循环下心脏手术、心脏骤停后心、肺和/或脑复苏、断肢再植或器官移植。
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