CN113975276B - 考比替尼在制备治疗缺血/再灌注损伤药物及细胞保护药物中的应用 - Google Patents

考比替尼在制备治疗缺血/再灌注损伤药物及细胞保护药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及考比替尼在制备治疗缺血/再灌注损伤药物及细胞保护药物中的应用。将考比替尼用于制备治疗缺血/再灌注损伤的药物，尤其是治疗心肌细胞和神经细胞损伤的药物，该药物尤其是对心、脑缺血/再灌注有良好的保护作用(心肌梗死、缺血性脑卒中)，能显著减轻心、脑缺血/再灌注损伤。

Description

考比替尼在制备治疗缺血/再灌注损伤药物及细胞保护药物 中的应用
技术领域
本发明涉及考比替尼在制备治疗或预防缺血/再灌注损伤的药物中的应用，属于生物医药领域。本发明提供了考比替尼的新用途和给药方式，包括对心、脑缺血/再灌注的保护作用(尤其是心肌梗死、缺血性脑卒中)，减轻缺血/再灌注损伤；以及细胞保护药物用于保护器官、组织或细胞抵抗细胞损伤和功能障碍的作用，扩大了考比替尼的适应症范围；另外，本发明还涵盖了考比替尼在制备心肌细胞损伤和神经细胞损伤保护药物中的应用。
背景技术
心肌梗死主要是由心脏缺血引起。如果没有及时再灌注或没有侧支循环存在时，心肌细胞将造成不可逆地损伤并被几乎无收缩功能的纤维疤痕组织所代替。脑梗死也称缺血性脑卒中，是由多种原因导致的局部脑组织血液供应障碍，导致脑组织缺血、缺氧性坏死，神经功能缺失。缺血性脑卒中是严重危害人类健康的常见和多发病，在全球已成为第一致残和第三致死的原因，缺血性脑卒中的发病率约占脑血管病的70-80％。
梗死治疗的主要措施之一是尽快恢复梗死组织灌注供血，但再灌注治疗往往伴随着一些组织损伤，引起病理生理学病变。由缺血和再灌注引起的损伤称为“缺血/再灌注(I/R)损伤”。I/R损伤涉及氧化应激、钙超载、能量代谢障碍、炎症反应等多种机制，导致细胞出现凋亡、坏死等多种死亡方式。研究表明，抑制凋亡和/或坏死，能减少缺血/再灌注导致的心肌细胞和神经细胞死亡，减轻心、脑缺血/再灌注损伤程度，缩小梗死范围。
研究表明，RIPK1/RIPK3/MLKL依赖的坏死样凋亡存在于多种损伤相关性疾病中，包括缺血性脑卒中、心肌梗死、肝肾损伤、神经退行性疾病、炎症性疾病、自身免疫性疾病等。因此，抑制RIPK1/RIPK3/MLKL依赖的坏死样凋亡可抑制或减轻上述疾病导致的细胞死亡和组织损伤。文献报道，RIPK1抑制剂necrostatin-1(Nec-1)能减少鼠的心、脑、肝、肾等缺血/再灌注损伤。然而，Nec-1仅作为工具药用于动物实验，目前临床上尚无针对RIPK1/RIPK3/MLKL药物用于临床治疗。
考比替尼(Cobimetinib，Cotellic)是一种靶向抗癌药，小分子MEK抑制剂，可选择性阻断MEK活性，继而阻断其下游的信号通路，抑制细胞分裂和增殖。适用于携带BRAFV600E或V600K基因突变、已扩散至人体其他部位或不能经手术切除的晚期黑色素瘤，但考比替尼是否具有抗缺血/再灌注损伤作用尚未见报道。
在本发明中，除非另有说明，“考比替尼”应理解为“考比替尼的化合物或它的半合成衍生物之一或它们的盐(化合物的盐或半合成衍生物的盐)之一或它们的酯(化合物的酯或半合成衍生物的酯)之一或它们的酯盐(化合物的酯的盐或半合成衍生物的酯的盐)之一”。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供考比替尼在制备治疗或预防缺血/再灌注损伤药物中的应用；本发明的目的之二在于提供考比替尼在制备细胞保护药物中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
考比替尼在制备治疗或预防缺血/再灌注损伤的药物中的应用。
一般地，所述考比替尼的分子式为:C21H21F3IN3O2，结构式如式Ⅰ所示。。
Figure BDA0003386881410000021
进一步地，考比替尼在制备抗缺血/再灌注损伤的药物中的应用。
进一步地，考比替尼在制备减轻缺血/再灌注损伤的药物中的应用。
进一步地，所述缺血/再灌注损伤包括心肌缺血/再灌注损伤、脑缺血/再灌注损伤、肝缺血/再灌注损伤和肾缺血/再灌注损伤中的一种或几种。
进一步地，所述心肌缺血/再灌注损伤为缺血性心脏病。
进一步地，所述脑缺血/再灌注损伤为缺血性脑卒中。
进一步地，所述缺血/再灌注损伤为心肌梗死。
进一步地，所述药物的给药方式为肌肉注射、皮下注射、静脉注射、口服给药、舌下含服、病灶内或脑内或植入的递送、喷雾给药中的一种或几种，优选为口服，肌肉、皮下或静脉注射。
进一步地，所述药物的给药方式为肌肉、皮下或静脉注射给药。
进一步地，所述药物可以制备成药剂学上可以接受的任意一种剂型。
进一步地，所述剂型包括注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、喷雾剂、散剂、脂质体、口服液、滴丸中的一种，其中优选剂型为注射剂。
可选的，考比替尼为其药学上可接受的盐，所述药学上可接受的盐为药学上常用的盐，进一步地，所述盐选自乙酸盐、盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸、苯甲酸盐、富马酸盐、马来酸盐、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸盐、草酸、乙醛酸、天冬氨酸、酒石酸盐、2，5－二羟基苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、月佳基磺酸盐、氢醌磺酸盐和对甲苯磺酸盐中的一种或几种。
本发明人发现，考比替尼可减少心肌缺血和脑缺血导致的心肌细胞和神经细胞死亡，显著降低心、脑缺血梗死体(面)积，降低血清肌酸激酶活性，改善神经学功能，减少心肌细胞和神经细胞死亡，具有神经细胞和心肌保护作用，其减轻心、脑缺血/再灌注损伤的作用优于目前常用的心、脑血管药物。
基于同一发明构思，本发明还提供考比替尼在制备细胞保护药物中的应用。
进一步地，所述细胞保护药物是指具有预防、抑制或治疗组织、器官和细胞的损伤、变性或功能障碍的作用的药物。
可选地，所述细胞保护药物是用于治疗或预防心肌细胞损伤或神经细胞损伤的药物。
进一步地，所述细胞保护药物是指预防、抑制或治疗心血管系统疾病、神经系统疾病或眼科疾病的药物。
进一步地，细胞保护药物是减少细胞死亡的药物。
优选地，所述细胞包括心肌细胞和神经细胞中的一种或几种。
可选地，细胞保护药物是包括用于神经系统、脑、心脏、眼等器官或细胞抵抗细胞死亡或导致细胞死亡的过程的药物，例如用于治疗坏死和/或病理性凋亡和/或坏死样凋亡和/或铁死亡和/或细胞焦亡和/或自噬等导致的疾病的药物。
进一步地，所述细胞保护药物是预防、抑制或治疗心血管系统疾病、神经系统疾病或眼科疾病的药物。
进一步地，所述器官包括脑、肺、心脏、血管、肾、胰腺、皮肤、眼、角膜中的一种或几种。
优选地，本发明针对的器官包括神经系统、脑和心脏。本发明的目的之一是提供考比替尼(单独的化合物或含有该化合物的药物组合物)的新用途，其可用于预防和/或治疗细胞死亡或抵制导致细胞死亡的过程，例如坏死和/或病理性凋亡和/或坏死样凋亡和/或铁死亡和/或细胞焦亡和/或自噬等导致的细胞死亡。
进一步，其可保护、预防和/或治疗细胞抵抗细胞死亡或导致细胞死亡的过程，包括抑制神经细胞损伤、死亡，如治疗和预防神经系统疾病，青光眼、视网膜色素变性，角膜网络状营养不良，年龄相关性黄斑变性(AMD)，湿性或干性AMD相关光感受器变性，其它视网膜变性，视神经病变和视神经炎，视神经玻璃疣，脑卒中，阿尔茨海默氏病，帕金森病，亨廷顿病，帕金森叠加综合症，局部缺血，肌萎缩侧索硬化(ALS)，颅内出血，脑出血，三叉神经痛，舌咽神经痛，重症肌无力，肌肉萎缩症，进行性肌萎缩症，贝尔麻痹，进行性延髓麻痹，脊髓性肌萎缩，原发性侧索硬化(PLS)，假性延髓麻痹，无脊椎动物盘综合征，颈椎病，遗传性肌萎缩，丛紊乱，胸廓出口破坏综合征，卟啉症，周围神经病变，多系统萎缩，皮质基底节变性，进行性核上麻痹，路易体痴呆，脱髓鞘疾病，多发性硬化，额颞叶痴呆，古兰-巴雷综合征，多发性硬化，克罗伊茨费尔特-雅各布病，进行性神经性腓骨肌萎缩症，朊粒病，致死性家族失眠症(FFI)，格-施-沙综合征(GSS)，牛海绵状脑病，癫痫，皮克氏病，AIDS痴呆综合征，由暴露于由工业溶剂、重金属、药物和化疗剂组成的组中的毒性化合物引起的神经损伤；由机械的、物理的或化学的创伤引起的神经系统损伤。
进一步地，其可保护、预防和/或治疗细胞抵抗细胞死亡或导致细胞死亡的过程，包括抑制心肌细胞损伤、死亡，如治疗和预防心血管系统疾病，心脏缺血和/或血管缺血、心肌梗死、缺血性心脏病、心肌重构、慢性或急性心力衰竭、肥厚型心肌病、药物治疗(特别是抗癌药物)引起的心脏副作用。
如上所述的药物在制备预防或治疗抗癌药物心血管毒性中的应用，所述抗癌药物包括但不限于蒽环类抗生素、酪氨酸激酶抑制剂、氟尿嘧啶类，VEGF信号通路抑制剂、免疫检查点抑制剂、铂类抗肿瘤药物、其他抗肿瘤药物。
进一步地，所述的抗癌药物包括蒽环类抗生素包括多柔比星(即阿霉素)、表柔比星(即表阿霉素)、吡柔比星、阿柔比星、伊达比星、柔红霉素、米托蒽醌等；酪氨酸激酶抑制剂，如尼诺替尼、舒尼替尼、拉帕替尼、瑞戈非尼、普纳替尼和达沙替尼；氟尿嘧啶类包括氟尿嘧啶、卡培他滨、替吉奥、替加氟；VEGF信号通路抑制剂包括贝伐珠单抗；免疫检查点抑制剂如曲妥珠单抗；铂类抗肿瘤药物顺铂等；其它抗肿瘤药物茹紫杉醇、环磷酰胺等。
本发明人意外地发现，考比替尼可减少心肌缺血/再灌注和脑缺血/再灌注导致的心肌细胞和神经细胞死亡，显著降低心、脑缺血梗死体(面)积，降低血清肌酸激酶活性及改善神经学功能，具有心肌细胞和神经细胞的保护作用，也可作为血清肌酸激酶抑制剂。本发明的药物减轻心、脑缺血/再灌注损伤的作用优于目前常用的脑血管药物，有可能用于治疗心肌梗死和缺血性脑卒中，具有良好的开发应用前景。
本发明人研究发现考比替尼能特异性下调RIPK1、RIPK3、MLKL表达和磷酸化水平,抑制细胞坏死样凋亡，可减少细胞死亡和提高神经细胞功能。
通常，考比替尼是用作MEK抑制剂，在选择性阻断MEK蛋白的活性，从而阻断其下游的信号通路，适用于携带BRAF V600E或V600K基因突变、已扩散至人体其他部位或不能经手术切除的晚期黑色素瘤。本发明中，首次将考比替尼用于治疗大鼠心肌缺血/再灌注损伤及缺血性脑卒中模型，发现考比替尼能下调心、脑组织中RIPK1、RIPK3、MLKL表达和磷酸化水平，意外地发现，其可显著降低心肌梗死和脑梗死体(面)积，降低血清肌酸激酶活性和改善神经学功能，减少心肌细胞和神经细胞死亡，具有神经细胞和心肌细胞保护作用，这是意想不到的，与考比替尼的已知用途毫不相关，也不存在现有其他化合物给出相关启示，具备突出的实质性特点，故本发明将考比替尼用于制备治疗缺血/再灌注损伤及细胞保护的药物，具有显著的进步。
本发明扩大了考比替尼的适应症，可适用于心肌梗死和缺血性脑卒中及细胞保护。
总之，本发明将考比替尼可用于治疗或预防心肌细胞损伤或神经细胞损伤，尤其是对心肌梗死、缺血性脑卒中的保护作用，能显著减轻心、脑缺血/再灌注损伤，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中考比替尼对大鼠心肌梗死面积及血清肌酸激酶活性的影响情况图；缺血30分钟给药，A-考比替尼给药后，大鼠心肌组织TTC染色及梗死面积测定，B-考比替尼给药后，血清肌酸激酶活性。
图2为实施例2中考比替尼对大鼠脑梗死体积及神经学功能的影响情况图；缺血2h再灌1h后给药，A-大鼠脑组织TTC染色及梗死体积测定，B-大鼠神经学功能评分。
图3为实施例2中考比替尼对大鼠脑组织中MLKL及磷酸化MLKL(p-MLKL)的调节作用。
具体实施方式
以下将结合实施例来详细说明本发明。
考比替尼在制备治疗缺血/再灌注损伤药物及细胞保护作用药物中的应用。
材料和方法：
为证明考比替尼在抗缺血/再灌注损伤和细胞保护中作用，申请人采用心肌缺血/再灌注损伤大鼠模型和缺血性脑卒中大鼠模型，并用考比替尼缺血/再灌注后不同时间点给药处理，再灌注24小时处死动物，用TTC染色和血清肌酸激酶活性检测心肌细胞损伤，用神经生物学评分及TTC染色检测神经细胞损伤。
实施药品：考比替尼(考比替尼的化合物)购于试剂公司。
实施例1
动物实验：考比替尼对心肌缺血/再灌注损伤大鼠模型的保护作用。
实验动物：
体重250～300g的健康雄性SD大鼠若干。将实验动物在温度25℃、相对湿度60％、自由饮水、定时定量的环境中饲养一周，然后按实验各分组要求给药。
大鼠心肌缺血/再灌注模型建立方法：SPF级Sprague-Dawley大鼠用3％戊巴比妥钠(0.1mL/kg)进行腹腔注射麻醉后，固定于鼠板上，剔除颈部和左胸的毛发。将大鼠肢体连接到心电图机，观察手术过程中大鼠心电图的变化。钝性分离颈部肌肉，暴露气管，在气管上剪开一个“T”型切口，将与呼吸机连接的软管的另一端插入大鼠气管，并用丝线固定。呼吸机参数设置为潮气量为7mL/kg，频率每分钟53次。待大鼠呼吸平缓后，于左胸第三、四肋间处用止血钳钝性分离各层肌肉，固定胸骨，轻轻挑开心包膜，暴露整个心脏。待心跳恢复规律以后，快速挤出心脏，在肺动脉圆锥与左心耳之间可观察到明显的左冠状静脉，用5-0缝合线穿一截塑料软管结扎冠状动脉左前降支，或从左心耳下方2-3mm处穿针至肺动脉圆锥下方，迅速将心脏复位并快速结扎。监测大鼠心电图变化，以ST段抬高，并同时能肉眼观察到心尖处变白等指标判定心肌梗死。缺血1小时后，剪开心脏结扎处的塑料软管，结扎线即断开，心脏恢复血流灌注。再灌注3小时后，剪开开胸处的胸骨，心尖取血2-3mL。
心尖采血后取出心脏，剪掉结扎处上方的所有心肌组织，除去右心室及室间隔。于-20℃冰箱冷冻30min后，取出，将心脏切成厚薄均匀的片块，加入1％TTC染液(PBS配制)于37℃条件下共孵育15min。染色结束，去除染液，PBS洗涤一次，4％多聚甲醛固定24小时后取出心脏切片，观察染色情况并拍照。梗死区域呈现白色，非梗死区呈现红色；通过ImageJ软件测定心肌梗死面积。
实验分组：将实验动物随机分为5组，即：
假手术组(Sham组)：对大鼠心脏进行手术，但不做血管结扎；
心肌缺血/再灌注组(I/R组)：结扎左冠状动脉前降支1小时，剪线，再灌注3小时；
考比替尼+心肌缺血/再灌注组(Cobimetinib+I/R):在大鼠缺血30min后给予考比替尼(4mg/kg)处理。
溶媒+心肌缺血/再灌注组(Vehicle+I/R)：在大鼠缺血30min后给予溶媒。
收集血及心肌组织并测定相关指标：大鼠心肌梗死面积测定及血清肌酸激酶活性检测。
血清肌酸激酶(CK)活性检测
缺血/再灌注手术结束后，心尖采血1-2mL，3000rpm，4℃，离心10min后取上清，-40℃保存。按照市购试剂盒说明书测定血清CK活性步骤如下：取10mL R2溶解一瓶R1配成工作液，取4μL血清，加到200μL CK试剂盒工作液中，于37℃条件下孵育2min，酶标仪下波长设定为340nm，分别在0、1、2、3min时读取吸光度A0，A1，A2，A3，计算每分钟平均吸光度的变化(△A)，并计算血清中CK的浓度(U/L)。
实验结果：
考比替尼具有抗大鼠心肌缺血/再灌注损伤作用，减少大鼠心肌组织梗死面积，降低血清肌酸激酶，减少心肌细胞死亡。
如图1中的A所示，缺血30分钟给予考比替尼给药可有效减少大鼠心肌组织梗死面积；如图2中的B所示，给予考比替尼可明显降低血清肌酸激酶活性，数据表示为均数±标准误，n＝4～5,**P＜0.01vs Sham，##P＜0.01vs I/R。
实验结论：
考比替尼可减少心肌细胞死亡，减轻心肌缺血/再灌注损伤，能应用于制备治疗心肌缺血/再灌注的药物。
实施例2
动物实验：考比替尼对缺血性脑卒中大鼠模型的保护作用。
实验动物：体重250～300g的健康雄性SD大鼠若干。将实验动物在温度25℃、相对湿度60％、自由饮水、定时定量的环境中饲养一周，然后按实验各分组要求给药。
缺血性脑卒中大鼠模型建立方法：用脑中动脉阻塞(MCAO)法法制备大鼠脑缺血/再灌注模型。步骤如下：(1)分离颈外动脉(CCA)，向上分离右颈外动脉(ECA)与颈内动脉(ICA)；(2)用眼科镊暂时夹闭ECA和ICA，并结扎CCA近心端；(3)于CCA远心端放置一打好结的备用丝线，在此线下端剪一小口，将栓线插入至颈内动脉，收紧丝线，放开ECA和ICA上的动脉夹，顺ICA将栓线送至颅内；(4)遇阻力而止，从CCA分叉处算起，插入深度约为18～20mm；(5)缺血120min后，将栓线拔出，缝好皮肤，再灌注24h后处理动物。
模型成功评判标准采用Longa“5分法”对大鼠脑缺血/再灌注损伤模型的神经功能缺损进行评分。0分：无神经缺损症状；1分：右前肢不能完全伸直；2分：向右旋转；3分：行走向右侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。1～4分为有效模型。
大鼠脑TTC染色和梗死体积测定。大鼠麻醉后，迅速将脑取出，去掉嗅球及后脑，从额极开始切取4张冠状脑片，厚约2.0mm，立刻置于1％TTC溶液中，于37℃避光孵育30min。然后用10％多聚甲醛溶液浸泡固定。梗死区呈现白色，非梗死区呈现红色。将每组脑片排列整齐后进行扫描。再应用ImageJ测出各脑片的梗塞面积，根据公式：梗死体积＝[(各片正面梗死面积之和+各片反面梗死面积之和)/2]×每片厚度，同样方法计算出全脑体积。
实验分组：将实验动物随机分为4组，即：
假手术组(Sham组)：进行颈内、外动脉分离手术，不插栓线入动脉。
脑缺血/再灌注组(I/R组)：脑缺血2h，再灌注24h。
考比替尼+脑缺血/再灌注组(Cobimetinib+I/R)：缺血2h、再灌1h后给予考比替尼(8mg/kg)处理。
溶媒+脑缺血/再灌注组(Vehicle+I/R)：缺血2h、再灌1h后给予溶媒处理。
检测大鼠神经功能评分和测定脑梗死体积。
Western blot(WB)检测MLKL及磷酸化MLKL表达水平。取适量脑组织，加入预冷的PBS清洗。往匀浆管内加入磁珠，置于冰上预冷，将组织加入匀浆管内匀浆(70Hz，180s)。4℃，12000rpm离心10min，留上清。用BCA法测蛋白浓度后，20～40ug蛋白用8-10％的SDS-PAGE胶分离并装膜到PVDF膜上，并用MLKL及p-MLKL(Abcam,Cambridge,UK)抗体和β-actin(Beyotime,江苏)抗体进行过夜孵育，相应二抗孵育后经Molecular Imager ChemiDoc XRSSystem(Bio-Rad,Philadelphia,PA)显影，β-actin作为内参。通过Image J软件测定蛋白灰度值以评价蛋白表达水平。
实验结果：
考比替尼具有抗大鼠脑缺血/再灌注损伤作用，减少梗死体积，改善神经功能缺损症状，减少神经细胞死亡，具有神经细胞保护作用。
如图2中的A所示，I/R组有明显的白色梗死灶，缺血2h、再灌1h后给予考比替尼大鼠脑梗死体积显著缩小，明显缓解脑缺血损伤。如图2中的B所示，考比替尼可明显改善神经功能缺损症状(n＝5～6,**P＜0.01vs Sham，#P＜0.05vs I/R，##P＜0.01vs I/R)。
图3所示，I/R诱导大鼠脑组织MLKL及p-MLKL上调，而考比替尼明显抑制MLKL及p-MLKL上调。
实验结论：
考比替尼可减少神经细胞死亡，减轻脑缺血/再灌注损伤，具有保护神经细胞作用，能应用于制备减轻脑缺血/再灌注损伤药物，用于治疗缺血性脑卒中。
但本发明不局限于心、脑缺血/再灌注损伤，因肝和肾缺血/再灌注损伤与心、脑缺血/再灌注损伤机制具有相似之处，故该药物同样适用于治疗肝和肾缺血/再灌注损伤。
上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。

Claims (6)

1.考比替尼在制备治疗或预防缺血/再灌注损伤的药物中的应用，其特征在于，所述缺血/再灌注损伤为心肌缺血/再灌注损伤、脑缺血/再灌注损伤中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述心肌缺血/再灌注损伤为缺血性心脏病。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脑缺血/再灌注损伤为缺血性脑卒中。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缺血/再灌注损伤为心肌梗死。
5.考比替尼在制备细胞保护药物中的应用，其特征在于，所述细胞保护药物是用于治疗或预防心肌细胞损伤或神经细胞损伤的药物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述细胞为心肌细胞和神经细胞中的一种或几种。
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