CN115737622A

CN115737622A - 丹酚酸b在制备预防或缓解水母蜇伤药物中的应用

Info

Publication number: CN115737622A
Application number: CN202211196554.4A
Authority: CN
Inventors: 肖良; 蒯文豪; 吴建华; 王庭芳; 王玉莲; 杨积顺; 王永芳; 王毅超; 朱伊娜; 耿晓宇
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2022-09-28
Filing date: 2022-09-28
Publication date: 2023-03-07

Abstract

本发明涉及医药技术领域，提供了丹酚酸B(SAB)在制备预防或缓解水母蜇伤药物中的应用。通过实验验证，SAB混合给药和提前腹腔给药均有效的抑制了水母触手提取物引起的小鼠足掌肿胀；SAB可以拮抗TE对人角质形成细胞HaCaT的细胞毒性，提高HaCaT的细胞存活率，为SAB预防或缓解水母蜇伤后引起的皮肤炎症性肿胀等中毒症状及细胞损伤提供了新的理论依据。此外，SAB具有安全无副作用的抗炎和抗氧化损伤作用，注射用丹参酚酸及其衍生产品等已得到临床认可，因此本发明提供的SAB的新适应症可较快实现临床转化。由于SAB在水母蜇伤造成的损伤防护应用上具有巨大潜力，本发明也为预防或缓解水母蜇伤后引起的全身性中毒反应及细胞损伤提供了新的临床治疗手段。

Description

丹酚酸B在制备预防或缓解水母蜇伤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，提供了SAB的新用途，具体涉及SAB在制备预防或缓解水母蜇伤药物中的应用。

背景技术

水母是对人类伤害最大的海洋生物之一，由于水母暴发的频繁发生，蜇伤人数在沿海地区显著增长，全球估计每年有超过1.5亿人被水母蜇伤。沙海蜇水母是我国海域内的主要有毒水母，在每年的晚夏至早秋期间大量出现于渤海和黄海造成游泳者和渔民受伤。沙海蜇水母蛰伤后的症状严重程度从皮肤瘙痒、局部水肿、肌肉肿痛到呼吸困难、休克直至死亡不等。而研究报道表明，不同剂量的水母毒液造成的致死性系统综合征所包含的致病机理并不相同，高剂量水母毒素会引发心血管衰竭和心脏骤停，人体在蜇伤后几小时内丧失生命特征；中剂量水母毒素在蜇伤初期的几分钟到几小时内，通过中枢神经系统抑制呼吸作用，造成人体缺氧并死亡；而剂量相对较低的水母毒素却会引发以延迟性的多脏器损伤为主的慢性病，其中肾脏和肝脏的损伤尤为严重，死亡周期在一周以内。

丹酚酸B(Salvianolic acid B，SAB)是我国传统中药丹参(Salvia miltiorrhizaBge.)的干燥根及根茎中的主要水溶性复合物之一，是丹参总酚酸含量最高、活性最强的成分。SAB又称为丹参酚酸乙，是由三分子3,4－二羟基苯基乳酸和一分子咖啡酸缩合而成的低聚体型化合物，是目前研究最多的酚酸之一。SAB的药理活性已经得到了多方面的证实，具有显著的抗氧化、抗炎、抗血小板聚集、抗肿瘤、抗细胞凋亡、保护微血管内皮细胞等多种药理活性，对心、脑、肝、肺、肾等多个器官都具有保护作用。SAB能够清除氧自由基、抑制脂质过氧化反应，是已知的具有较强抗氧化作用的天然产物之一。研究表明，在动物损伤模型中，SAB可以改善大鼠组织病理学损害，显著提高大鼠过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和还原型谷胱甘肽活性，抑制大鼠体内氧自由基的释放，增强抗氧化应激的能力。SAB可以抑制各种炎症因子释放，降低内皮细胞间的黏附分子表达，起到保护内皮细胞的作用，并通过发挥抗炎功能来保护心脏内皮细胞，保护心脏免受损伤。在体外实验中，SAB对心肌细胞凋亡起到保护作用，有助于提高其抗氧化性能，还通过纠正心肌细胞内外离子失衡尤其是调整Ca²⁺稳态，改善了心肌细胞的能量代谢障碍，抗心脏缺血再灌注损伤。同时，SAB在抗动脉粥样硬化、抗脑缺血损伤、抗内脏纤维化、抗抑郁、保护神经元、改善学习记忆能力方面都显示出较好的疗效。皮肤病方面，SAB在银屑病和其他紫外线介导的皮肤损伤模型中也表现出较好的抗衰老和皮肤保护作用，可以有效缓解皮肤细胞致死性损伤，抑制炎症细胞因子分泌，减轻疾病严重程度。此外，SAB作为一种有效、安全的天然抗肿瘤药物，在对肿瘤的预防和治疗中具有重要意义。迄今为止，大量研究已经探索了用于体内外损伤模型和人类疾病的SAB广泛医学属性，其作用机制主要涉及抗氧化应激，以及在不同器官系统中的抗炎、抗凋亡、抗纤维化作用。

针对水母毒素引起的体内和细胞内炎症性损伤，SAB的拮抗效应是否有效，目前尚未见相关研究报道，本发明采用SAB进行拮抗效应研究以寻找水母蜇伤的救治方法和SAB更广泛的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种SAB的新医药用途；另一目的在于提供一种新的预防或缓解水母蜇伤的药物组合物。

本发明的第一方面，提供了SAB在制备预防或缓解水母蜇伤药物中的应用。第二方面，提供了中药丹参在制备预防或缓解水母蜇伤药物中的应用。

优选的，该预防或缓解水母蜇伤药物为减轻水母蜇伤后引起的皮肤炎症性肿胀或组织损伤的药物、或拮抗TE对人角质形成细胞HaCaT的细胞毒性，提高HaCaT的细胞存活率的药物。

其中，减轻水母蜇伤后引起的皮肤炎症性肿胀或组织损伤的药物为改善TE引起的表皮棘层水肿、基底层液化变性、真皮层毛细血管扩张、胶原纤维分离断裂、大量炎症细胞浸润情况的药物。

优选的，本发明所述预防或缓解水母蜇伤药物是以SAB作为唯一活性成分或者是包含SAB的药物组合物。该药物组合物形式优选为注射剂、口服液、外用制剂等形式。

通过小鼠实验验证，SAB和水母TE混合注射或者预先注射SAB均能够显著降低小鼠足掌的炎症性肿胀程度。病理学检查显示SAB组均有效的改善了TE引起的表皮棘层和基底层水肿，真皮层毛细血管扩张、胶原纤维分离断裂、炎症细胞浸润的情况。

通过细胞实验验证，SAB能够显著提高HaCaT的细胞存活率，拮抗TE对人角质形成细胞HaCaT的细胞毒性。

本发明的第二方面，提供一种预防或缓解水母蜇伤的药物组合物，包括活性组分以及药学上可接受的辅料，其中，所述活性组分包括丹酚酸B或以丹酚酸B作为唯一活性组分。

本发明的上述方法适用于海上工作人员、海军战士、海边游客、海上救生员遭遇到水母蜇伤的情况，可用于预防或缓解水母蜇伤，推荐先提前服用SAB并在蜇伤时立即持续注射SAB或口服SAB，给药方式不限于口服、注射等。

发明的作用与效果

通过实验验证，SAB同时给药和提前腹腔给药均有效的抑制了TE引起的小鼠足掌肿胀，另外，SAB能够显著提高HaCaT细胞的细胞存活率，拮抗TE对HaCaT细胞的细胞毒性，为SAB预防或缓解水母蜇伤后引起的皮肤炎症性肿胀等中毒症状及细胞损伤提供了新的理论依据。

此外，SAB具有安全无副作用的抗炎和抗氧化作用，SAB及其它丹参衍生产品等已得到临床认可，因此本发明提供的SAB的新适应症可较快实现临床转化。由于SAB在水母蜇伤造成的损伤防护应用上具有巨大潜力，本发明也为预防或缓解水母蜇伤后引起的全身性中毒反应及细胞损伤提供了新的临床治疗手段。

附图说明

图1为SAB拮抗TE在动物水平的毒性评价。其中A为小鼠皮内注射TE、混合皮内注射不同浓度SAB-TE(TE+SABMix；SAB：1mM)、皮内注射生理盐水(Normal Saline，NS)4h时的足掌形态图；B为小鼠皮内注射TE、TE+SABMix、皮内注射NS足掌厚度变化图；C为小鼠皮内注射TE、TE+SABMix、皮内注射NS足掌肿胀百分比变化图，柱子从左往右依次为NS、TE、TE+50μMSAB、TE+200μM SAB和TE+1mM SAB；D为小鼠皮内注射TE、腹腔注射SAB-皮内注射TE(TE+SABIP；SAB：3mg/mL)、皮内注射NS 4h时足掌形态图；E为小鼠皮内注射TE、TE+SAB IP、皮内注射NS足掌厚度变化图；F为小鼠皮内注射TE、TE+SAB IP、皮内注射NS足掌肿胀百分比变化图，柱子从左往右依次为NS、TE、TE+3mg/mL SAB；

*，TE+SABMix组或TE+SAB IP组与TE组的差异显著，SAB：Salvianolic acid B；μM：μmoL/L；mM：mmoL/L，n＝4～6，*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

图2为小鼠皮内注射TE、TE+SABMix(SAB：1mM)、TE+SAB IP、皮内注射NS的足掌在12h和24h两个时间点的足掌病理切片，n＝4，放大倍数400×，比例尺＝200px。

图3为SAB拮抗TE在细胞水平的毒性评价。其中A为TE介导的HaCaT细胞存活率的影响；B为不同浓度SAB对TE介导的HaCaT细胞存活率的影响，n＝4～6，*，P<0.05；**，P<0.01。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。

一、实验材料

沙海蛰水母：将沙海蛰水母从辽宁省大连市渤海捕获后，尽快从其活体阶段手工切除其新鲜的触手部分，放入于1,000mL的塑料盒中液氮速冻，干冰运至上海后于-80℃冰箱长期保存。

沙海蛰TE制备：将冷冻样品置于4℃冰箱中，于磁力搅拌器中持续搅拌72h至完全溶解，随后使用200目筛过滤2次，剔除未自溶的部分组织。收集滤液于4℃，1,000×g下离心15min，收集上清液作为TE样品放置于-80℃冰箱保存。

SAB购自上海众瑞生物科技有限公司。

二、实验方法

1、动物模型实验

选择7周龄的雄性ICR小鼠，左足掌皮内注射50μL浓度为1mg/mL的TE作为实验组；左足掌注射50μl的NS作为对照组；使用SAB稀释TE，使TE终浓度为1mg/mL同时SAB终浓度分别为50μM，200μM和1mM作为TE+SAB Mix组；SAB的另一种方式采用预先0.5h腹腔注射100μL/10g(小鼠体重)3mg/mL的SAB(浓度根据人体用药量换算小鼠确定即30mg/kg)，随后足掌注射50μl终浓度为1mg/mL的TE作为TE+SAB IP组。

分别测量注射后0h，0.5h，1h，2h，4h，12h，24h和48h时的足掌厚度并拍照。

分别选择对照组、TE+SAB Mix(SAB：1mM)和TE+SAB IP组12h和24h的足掌进行病理切片检查。

2、细胞实验

选择生长良好的HaCaT细胞进行细胞实验。取出一瓶HaCaT细胞，根据其细胞浓度，用细胞培养基进行稀释制备8000个细胞/80μL细胞悬液。

TE介导的HaCaT细胞存活率的影响：按照下表1条件在96孔板中加入相应试剂后孵育，用酶标仪检测其在450nm处光吸收值(OD450)，其中空白组用细胞培养基代替细胞悬液，用1×PBS代替TE为对照组。

表1 TE对HaCaT细胞毒性测定加样表

不同浓度SAB对TE介导的HaCaT细胞存活率的影响：按照下表2条件在96孔板中加入相应试剂后孵育，用酶标仪检测其在450nm处光吸收值(OD450)，其中空白组用细胞培养基代替细胞悬液，用1×PBS代替TE和SAB为对照组，用1×PBS代替SAB为TE组。

表2 SAB拮抗TE对HaCaT细胞毒性测定加样表

三、结果分析

与实验组(TE)相比，混合皮内注射SAB-TE(TE+SABMix)、腹腔注射SAB-皮内注射TE(TE+SAB IP)两种给药方式均有效降低了小鼠足掌厚度及肿胀百分比：TE+SAB Mix组对TE组小鼠足掌肿胀程度的拮抗效应具有剂量依赖性，其中1mM SAB的拮抗效果最好，有效改善了TE介导的小鼠足掌红斑、水肿症状，并显著降低TE的肿胀峰值及0.5～48h之间各时间点足掌肿胀百分比(24h时，P<0.01；0.5h、1h、2h、4h、12h和48h时，P<0.001)(图1A～C)；200μMSAB在12～48h之间可以显著降低小鼠足掌肿胀百分比(12h时，P<0.05；24h和48h时，P<0.01)；TE+SAB IP组也明显减轻了TE介导的小鼠足掌红肿等炎症表现，并显著降低TE的足掌肿胀峰值及0.5～48h之间各时间点肿胀百分比(0.5h、1h、2h、4h、12h时，P<0.01；24h和48h时，P<0.001)(图1D～F)。结果表明，SAB可以有效抑制TE引起的小鼠足掌炎症性肿胀，抗氧化治疗可能是潜在的治疗水母蜇伤的有效方法。

病理学检查显示TE+SAB Mix与TE+SAB IP组均有效的改善了TE引起的小鼠足掌表皮及真皮水肿和炎症细胞浸润的病理改变。TE造成了小鼠足掌棘层细胞内外水肿，基底层液化变性，真皮层毛细血管扩张、胶原纤维淡染分离断裂、真皮浅中层大量炎症细胞浸润的情况；相较于TE组，TE+SABMix(SAB：1mM)在12h和24h时有效减轻了表皮海绵状水肿，基底层液化变性，真皮层毛细血管扩张及大量混合炎症细胞浸润的情况；而TE+SAB IP(SAB IP：3mg/mL)组，在12h和24h也有效改善了表皮棘层细胞内外水肿，真皮层毛细血管扩张、胶原纤维分离断裂及大量混合炎症细胞浸润等急性非特异性炎症病理改变的情况(图2)。结果表明，抗氧化剂SAB可以显著抑制TE引起的致炎和致水肿活性，改善局部组织损伤。

通过实验发现，TE对HaCaT细胞具有剂量依赖性的细胞毒性，随着TE浓度的增加，HaCaT细胞的细胞存活率越低，其LC₅₀(Lethal Concentration 50％)为28.3μg/mL(图3A)。SAB可以通过拮抗TE对HaCaT细胞的毒性损伤而提高细胞存活率，当SAB浓度在100μM以上时，可以显著提高细胞活力并具有剂量依赖性(SAB为100μM和200μM时，P<0.05；SAB为500μM和1000μM时，P<0.01)(图3B)。这可能是由于SAB的抗氧化及抗炎作用，使得细胞受到的活性氧的攻击减少从而减少了炎症损伤并使其细胞活力明显高于TE组。结果表明，SAB可以有效拮抗TE对HaCaT细胞的细胞毒性，提高细胞存活率，保护HaCaT细胞免受毒性损伤。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims

1.丹酚酸B在制备预防或缓解水母蜇伤药物中的应用。

2.中药丹参在制备预防或缓解水母蜇伤药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

其中，所述水母为沙海蜇水母。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

其中，所述预防或缓解水母蜇伤药物为减轻水母蜇伤后引起的皮肤炎症性肿胀或组织损伤的药物，或拮抗TE对人角质形成细胞HaCaT的细胞毒性，提高HaCaT的细胞存活率的药物。

5.根据权利要求4所述的丹酚酸B在制备预防或缓解水母蜇伤后全身系统性中毒药物中的应用，其特征在于：

其中，所述减轻水母蜇伤后引起的皮肤炎症性肿胀或组织损伤的药物为改善TE引起的表皮棘层水肿、基底层液化变性、真皮层毛细血管扩张、胶原纤维分离断裂、大量炎症细胞浸润情况的药物。

6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

其中，所述预防或缓解水母蜇伤药物是以丹酚酸B作为唯一活性成分或者是包含丹酚酸B的药物组合物。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

其中，所述预防或缓解水母蜇伤药物为汤剂、散剂、丸剂、注射剂、合剂、口服安瓿剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂或乳剂。

8.一种预防或缓解水母蜇伤的药物组合物，其特征在于，包括活性组分以及药学上可接受的辅料，其特征在于，所述活性组分包括丹酚酸B或以丹酚酸B作为唯一活性组分。