DE2415079A1

DE2415079A1 - Verfahren zur isolierung von albumin aus blut

Info

Publication number: DE2415079A1
Application number: DE2415079A
Authority: DE
Inventors: Waldemar Dr Schneider
Original assignee: Individual
Current assignee: Armour Pharma GmbH
Priority date: 1974-03-28
Filing date: 1974-03-28
Publication date: 1975-10-02
Also published as: FR2265757B1; CH629819A5; PL93587B1; IN140388B; DE2415079C3; DK125275A; DK141523B; NL177886C; ATA238175A; DE2415079B2; JPS5418325B2; FR2265757A1; DK141523C; AT338977B; SE7503075L; SE436649B; BE827050A; JPS50154413A; GB1480184A; NL7503132A

Description

Verfahren zur Isolierung von Albumin aus Blut

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von hitzebeständigen Eiweißfraktionen, insbesondere Albumin aus Blut oder Blutprodukten.

Blut ist eine Flüssigkeit, die aus festen und flüssigen Bestandteilen besteht. Zu den festen Bestandteilen gehören rote und weiße Blutkörperchen sowie die Blutplättchen. Das Plasma oder der flüssige Teil des Blutes enthält etwa 90 fo Wasser und 10 fo Feststoffe. Zu den im Plasma gelösten Stoffen gehört u. a. das Albumin, das als einziger Eiweißbestandteil des Plasmas über etwa 60° C hitzebeständig ist. Es ist an sich bekannt, das Blutplasma von den roten und weißen Blutkörperchen sowie von den Blutplättchen zu trennen. Weiterhin ist es bekannt, aus dem Plasma gerinnungsfordernde Substanzen, wie z. B. Fibrinogen, zu entfernen. Für therapeutische oder diagnostische Zwecke ist es erwünscht, eine möglichst reine Albuminlösung oder Albumin-Paste zu erhalten, die möglichst keine weiteren Eiweißbestandteile des Blutplasmas mehr enthalten soll.

Zur Isolierung des Albumins aus dem Blut bedient man sich insbesondere eines unter dem Namen "Cohn-Methode" bekannten Verfahrens, welches bei einer Ausbeute von etwa 70 % einen Reinheitsgrad des Endproduktes von nur 95 - 98 fo ermöglicht. Dieses Verfahren geht aus von einem aus verschiedenen Blutproben gemischten Plasma. Dieses Verfahren ist im Prinzip eine fraktionierte Fällung unter verschiedenen Konditionen. Bei der ersten Stufe wird bei minus 3° C und einem pH-Wert von 7,2 bei einer Alkoholzugabe von 8 fo zunächst das erste Sediment, vornehmlich Fibrinogen, abgeschieden. Die aufste-

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hende Flüssigkeit wird in drei weiteren Schritten, jeweils bei Minus-Temperaturen und steigendem Alkoholgehalt der Flüssigkeit, nach und nach von /"-Globulinen sowie *■- und /tf-Globulinen befreit. Anschließend erhält man eine sogenannte Roh-Albumin-Paste, die entweder in eine 5%-Lösung übergeführt oder einer weiteren Reinigung unterzogen wird, an deren Ende eine 20 %ige Albumin-Lösung steht. Die gesamte fraktionierte Abtrennung nach der bekannten Cohn-Methode erfordert etwa 6-8 Tage bei normalen 8-Stunden-Arbeitstagen. Weiterhin wird bei dieser Methode als nachteilig empfunden, daß zahlreiche Arbeitsgänge bei genau eingestellten Minus-Temperaturen durchgeführt werden müssen. Dies erfordert entweder, daß das gesamte Laboratorium auf dieser Temperatur gehalten wird oder daß die Reaktionsgefäße mit großem Aufwand gekühlt werden. Beides ist nachteilig und wird insbesondere vom Laboratoriumspersonal als sehr lästig empfunden.

Es stellt sich demnach die Aufgabe, die bekannte Methode in entscheidender Weise zu verbessern, wobei insbesondere erreicht werden soll, daß die Arbeitszeit verkürzt, die Arbeitsgänge verringert, die Belastung des Personals eingeschränkt und die Ausbeute ohne Verminderung des Reinheitsgrades gesteigert werden. Darüber hinaus soll erreicht werden, daß auch der technische Aufwand wesentlich verringert wird.

Diese Aufgaben werden gelöst durch ein Verfahren zur Isolierung von Albumin aus Blut, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

a) Abtrennen des Plasmas von den festen Bestandteilen des Blutes (Blutzellen und Blutplättchen) sowie Gewinnung der gerinnungsfördernden gelösten Bestandteile aus dem Plasma;

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b) Erhitzen des Plasmas in Anwesenheit^ stabilisierenden Substanzen auf Temperaturen zwischen 60 - 75° C, Ausfällen und Abtrennen von Globulinen;

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c) Versetzen des albuminhaltigen Restplasmas mit einem Präzipitationsmedium, Ausfällen und Abtrennen der niedergeschlagenen Albuminpaste.

Der wesentliche Teilschritt des neuen Verfahrens ist die Erhitzung des Blutplasmas. Das Albumin wird dabei - im Gegensatz zu allen anderen Plasmaproteinen - durch Zusatz stabilisierender Substanzen vor der Ausfällung geschützt. Besonders geeignet als stabilisierende Substanzen sind aliphatische Carbonsäuren bzw. deren Salze, insbesondere Natriumcaprylat. Dadurch, daß die Globuline bei etwa 68 C ausgefällt werden, ist es überraschenderweise möglich, auf die Kühlung bei der Trennung zu verzichten. Darüber hinaus werden noch
zahlreiche Arbeitsgänge eingespart, da das fraktionierte
Ausfällen entfällt. Vielmehr können alle Globuline in einem Arbeitsgang entfernt werden.

Als optimale Arbeitstemperatur zur Ausfällung der Globuline bei Anwesenheit von Natriumcaprylat hat sich eine Temperatur von 68° C +3 erwiesen.

Für die Ausfällung des Albumins aus dem Restplasma hat sich als Präzipitationsmedium insbesondere Polyaethylenglykol als geeignet erwiesen; es ist jedoch auch möglich, für diesen
Konzentrationsschritt andere polymerisierte, aliphatische
mehrwertige Alkohole, bestimmte Salze, monomere Alkohole
oder sonstige zur Eiweißanreicherung geeignete Verfahren
einzusetzen.

Um die gefällte Albuminpaste in eine Lösung der gewünschten Konzentration zu überführen, wird sie im Anschluß an die genannten Schritte in einer vorzugsweise gepufferten Flüssigkeit gelöst. Die Albuminlösung kann dann vorzugsweise und
ohne Zusatz eines Stabilisators hitzesterilisiert werden.

Varianten des Verfahrensganges sowie weitere Eigenschaften
und Vorteile des neuen Verfahrens werden anhand der Zeich-

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nung erläutert. Die Figuren zeigen:

Fig. la das Fällungsverfahren naeh der sogenannten Cohn-Methode;

Fig. Ib schematisch das neue Verfahren;

Fig. 2a - 2h Immun-Elektrophorese-Diagramme (IEP) verschiedener Albumin-Präparate, hergestellt, nach bekannten bzw. nach dem neuen Verfahren.

In der Fig. la ist schematisch das Verfahren der sogenannten Cohn-Methode in Schritten dargestellt. Es wird ausgegangen von einem gemischten Plasma, das mit 8 % Äthanol versetzt wird und mit einem pH-Wert von 7,2 bei minus 3° C ausgefällt wird. Hierbei wird die Fraktion I ausgeschieden. Die überstehende Flüssigkeit wird anschließend bei minus 5° C und einem pH-Wert von 5>8 mit 19 % Äthanol versetzt. Hierbei wird die Fraktion Il/lII ausgeschieden, die hauptsächlich aus j^-Globulinen besteht. Wiederum wird die überstehende Flüssigkeit bei höherem Alkoholgehalt, einem pH-Wert von 5,8 und einer Temperatur von minus 7° C behandelt. Hierbei wird die Fraktion IV, hauptsächlich bestehend aus <*- und/S-Globulinen, gewonnen. Die überstehende Flüssigkeit wird bei einem pH-Wert von k_s8 und einer Temperatur von minus 7° C (Äthanolgehalt kO %) nochmals behandelt. Hierbei scheidet sich als Sediment das sogenannte Rohalbumin aus. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Das Rohalbumin kann nach Gefriertrocknung zur Entfernung des Alkohols in eine 5%-Lösung aufgenommen bzw. überführt werden. Es ist jedoch auch möglich, die Rohalbuminpaste nochmals aufzunehmen und in zwei weiteren Schritten (Bedingungen aus dem Diagramm abzulesen) in eine gereinigte Albuminpaste überzuführen.

Insgesamt werden für die Herstellung der gereinigten Paste etwa 6-8 Tage benötigt, wenn in normalen 8-Stunden-Tagen gearbeitet wird. Außerdem muß sehr sorgfältig gekühlt werden, was einen entsprechend hohen Aufwand an verfahrenstechnischer Apparatur erfordert.

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Dagegen kann das neue Verfahren wesentlich einfacher durchgeführt werden (s. Fig. ib). Auch hier wird von gemischtem Plasma ausgegangen, welches zunächst - völlig im Gegensatz zum bekannten Verfahren - einer Hitzebehandlung bei einer Temperatur von 68° C in Anwesenheit von Alkohol und albuminstabilisierenden Substanzen unterworfen wird. Als stabilisierende Substanzen eignen sich insbesondere aliphatische Carbonsäuren bzw. deren Salze, wie etwa Natriumcaprylat. Bei diesem ersten Verfahrensschritt, der bei einem pH-Wert von 6,5 und einem Äthanolgehalt von 9 % durchgeführt wird, scheiden sich denaturierte Globuline ab. Die überstehende Flüssigkeit wird nach Abkühlung auf pH 4,8 abgesäuert und mit einem Präzipitationsmedium, wie etwa 22 % Polyaethylenglyko1 (PEG), versetzt. Nach einer angemessenen Reaktionszeit scheidet sich eine sehr reine Albumin-Paste ab, die entweder gefriergetrocknet oder zu einer 5$-Lösung aufgenommen wird. Wie schon aus den grundsätzlichen Beschreibungen ersichtlich ist, ist für das neue Verfahren eine wesentlich kürzere Zeit und ein wesentlich geringerer verfahrenstechnischer Aufwand erforderlich. Darüber hinaus ist jedoch das gewonnene Albumin noch wesentlich reiner als das, was nach bekannten Methoden gewonnen wird. Die Figuren 2a bis 2h zeigen Immun-Elektrophorese-Diagramme (IEP), aus denen folgendes zu erkennen ist:

Fig. 2a und c zeigen IEP-Diagramme eines natürlichen Plasmas, bei dem links die Sichel von Albumin gebildet wird; die sich rechts anschließenden dünneren Sicheln rühren von Globulinen und anderen Plasma-Bestandteilen her, die bei einer "reinen" Albumin-Lösung als Verunreinigungen angesehen werden müssen. Albumin-Lösungen, die nach einem bekannten Verfahren hergestellt sind, zeigen die Fig. 2g und h. Deutlich ist zu erkennen, daß ein Teil der Verunreinigungen entfernt ist; jedoch sind bei weitem noch nicht alle unerwünschten Eiweiß-Bestandteile entfernt. Die Fig. 2b und d zeigen Albumin-Lösungen, die nach dem neuen Verfahren gewonnen wurden. Hier ist eine fast 100 $>ige Reinheit zu erreichen. Die Fig. 2f

zeigt die über-

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stehende Flüssigkeit, die nach dem letzten Verfahrensschritt (Niederschlag durch Polyaethylenglykol) gewonnen wurde. Hierbei ist zu erkennen, daß diese Flüssigkeit praktisch kein Albumin mehr enthält. Daraus folgert, daß schon bei dem ersten Verfahrensschritt (Erhitzen auf 68° C unter Anwesenheit von Alkohol und Natriumcaprylat) praktisch eine vollkommene Trennung von Albuminen und anderen Eiweißstoffen des Plasmas erreicht worden ist.

Die einzelnen Verfahrensschritte werden anhand von Beispiel i_ erläutert:

Plasma-Trennung

Für die Plasma-Trennung wird ein Plasma verwendet, dem die Gerinnungsfaktoren entzogen worden sind. Der Gerinnungsfaktor VIII und das Fibrinogen sind durch Cryo-Äthanolsedimentation entfernt worden. Der Prothrombin-Komplex wird durch DEAE-Zellulose-Adsorption entfernt. Das ursprüngliche Plasma ist HBAg-negativ, hat normale Transaminase-Werte und enthält kein sichtbares Hämoglobin. Dem Ursprungsplasma wird Natriumcaprylat zugefügt, bis eine Konzentration von 0,004 mol erhalten wird. Die Mischung, welche etwa 9 fo Äthanol enthält, wird bei einem pH-Wert von 6,5 erhitzt. Der pH-Wert wird durch 0,5 η HCl erreicht. Die Temperatur wird in etwa 3 Stunden bei gleichmäßiger Wärmezuführung bis auf 68 C gebracht. Anschließend wird die Flüssigkeit abgekühlt. Der pH-Wert wird auf pH 4,4 mit HCl erniedrigt. Das angesäuerte Plasma wird nun über Nacht (bei etwa 10° C) stehengelassen.

Abtrennung der Fraktion

Das bereits hitzefraktionierte Plasma wird in Zentrifugen mit kontinuierlichem Fluß durch Silikonschläuche eingepumpt. Die abgeschiedenen Eiweißstoffe sammeln sich in den Rotoren. Das Albumin verbleibt in der überstehenden Flüssigkeit. Die in den Rotoren abgeschiedenen Eiweißstoffe enthalten noch Albumin, welches durch Wiederaufachwemmen und erneutes Zentrifugieren zusätzlich gewonnen werden kann,

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Konzentrierung des Albumins bei gleichzeitiger Reduzierung des Salzgehaltes

Die überstehende Flüssigkeit wird durch sogenannte SSK-FiI-ter gefiltert, um verbliebene Lipide und veränderte Proteine zu entfernen. Anschließend wird das Präzipitationsmlttel zugegeben, im vorliegenden Falle Polyaethylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 4000 - 6000 in einer Konzentration von 22 % bei Zimmertemperatur. Innerhalb von 30 Minuten schlägt sich das Albumin nieder. Die Albumin—Suspension wird wiederum zentrifugiert. Dabei verbleiben das Polyaethylenglykol und die Salze in der proteinfreien Flüssigkeit. Das Albumin sammelt sich in den Rotoren als Paste. Es wird in einem Behälter in destilliertem Wasser aufgenommen und in eine ca. 8%ige Lösung überführt. Nach Klärfiltration kann das Albumin unmittelbar in eine *t - 5 $ige Gebrauchslösung überführt werden, wobei die Osmolalität mit Glucose oder anderen geeigneten Substanzen eingestellt wird. Anschließend wird das Produkt sterilfiltriert, in Flaschen abgefüllt und mindestens 10 Stunden lang bei 60 C pasteurisiert.

Beispiel 2

Herstellung einer 20 folgen Albumin-Lösung Hierzu wird das 8 folge Albumin zunächst gefriergetrocknet (nach der Klär-Filtration). Das getrocknete Pulver wird mit destilliertem Wasser aufgenommen, wobei die Osmolalität unter Umständen einer Justierung bedarf (s. o.!).

Wie die Verfahrensbeispiele zeigen, werden für die grundsätzlichen Schritte keine Kühlanlagen gefordert. Dadurch ist die Verarbeitung und Konzentration wesentlich vereinfacht. Gefriertrocknung ist außerdem nur erforderlich, wenn Produkte mit höherer Konzentration hergestellt werden sollen. Daneben wird die Arbeitszeit wesentlich verringert.

Außer Blutplasma bzw. Blutserum können alle albuminhaltigen Produkte auf diese Weise fraktioniert werden, unabhängig da-

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von, welchem Verfahren diese Fraktionen vorher unterzogen
worden sind. Beispielsweise könnte auch eine der Zwischenfraktionen bei der Cohn-Methode dem neuen Verfahren unterzogen werden.

Die Ausbeute beträgt mehr als 90 % des ursprünglich vorhandenen Albumins, während bei bekannten Methoden trotz geringeren Reinheitsgrades höchstens mit einer Ausbeute von
60 - 70 % zu rechnen ist.

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Claims

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atentansprüche

^. Verfahren zum Isolieren von hitzestabilen Eiweißfraktionen, insbesondere Albumin aus Blut oder Blutprodukten, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

a) Abtrennen des Plasmas von den festen Bestandteilen des Blutes (Blutzellen und Blutplättchen) sowie Gewinnung der gerinnungsfordernden gelösten Bestandteile aus dem Plasma;

b) Erhitzen des Plasmas in Anwesenheit von Alkohol und stabilisierenden Substanzen auf Temperaturen zwischen ca. 60 - 75° C, Ausfällen und Abtrennen der Globuline;

c) Anreichern des Albumins, vorzugsweise durch Ausfällen und Abtrennen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Verwendung von Äthylalkohol bei der Hitzefällung (Punkt 16)
3. Verfahren nach Anspruch 1, 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei Anwesenheit von Natriumcaprylat und Äthylalkohol bei einer Temperatur von ca. 60 - 75° C niedergeschlagen wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Anreicherung des Albumins durch Ausfällung mit einem Eiweißpräzipitationsmedium erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch Verwendung von etwa 20 - 30 % Polyaethylenglykol.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als weiterer Schritt die gefällte Albuminpaste in einer vorzugsweise gepufferten Flüssigkeit gelöst und auf eine gewünschte Konzentration gebracht wird.

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7. Verfahren nach Anspruch 1 und β, dadurch gekennzeichnet, daß als letzter Schritt die Albuminlösung ohne Zusatz eines Stabilisators hitzesterilisiert wird.

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