DK141523B - Fremgangsmaade til isolering af albumin fra blod blodprodukterog placentablod - Google Patents

Description

(W) \*a/ (11) FREMLÆGGELSESSItRIFT 1 i|15Z3 r\ A M IWI A D Y (51) Intel.· A 61 K 37/02 // A 61 K 35/14 DANMAKK a 61 k 35/50 f(21) Ansøgning nr. 1252/75 (22) Indleveret døn 25 · <nai* . 1975 (23) Løbedag 25· mar. 1975 (44) Ansøgningen fremlagt og .

fremleeggslseeekrlftet offentliggjort den 1^· · »9®0 DIREKTORATET FOR ^ PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET PHorltet begæret fra den

28. mar. 1974, 2415079s DE

(71) PLASMESCO AG, Haenibuehl 8, 6300 Zug, CH.

(72) Opfinder: Waldemar Schneider, 58 Hagen, Felthetr. 180, DE: Christian Froehlich, 58 Hagen, Feithstr. 180, DE: Harald Fiedler, 44 Mueneter, Sperlichstr. 15, DE: Hans Lefevre, 44 Mueneter, Sperlichstr. 15» DE.

i (74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Ingeniørfirmaet Giersing & Stallinger._'_ " (B4) Fremgangsmåde til isolering af albumin fra blod, blodprodukter og placentablod.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til isolering af albumin, egnet til terapeutisk og diagnostisk anvendelse hos mennesker, ud fra humant blod, blodprodukter og plaoentablod, hvilken fremgangsmåde omfatter følgende trins a) fraskillelse af plasma fra blodets faste bestanddele (blod celler og blodplader) samt, om ønsket, udvinding af opløste ikke-albu-min-plasmabestanddele fra plasmaet, b) fuldstændig udfældning og fraskillelse af globuliner , idet man til udfældning heraf opvarmer den fraskilte væske til 60-75° i nærværelse af et albuminstabiliserende stof, f.eks. natriumcaprylat, c) berigelse af albuminet, fortrinsvis ved udfældning og fraskil- 2 141523 lelse.

Blod er en væske, som består af faste og flydende bestanddele.

Til de faste bestanddele hører røde og hvide blodlegemer samt blodpladerne. Plasmaet eller den flydende del af blodet indeholder ca. 90$ vand og 10$ faste stoffer. Til de i ^plasmaet opløste stoffer hører blandt andet albuminet, der som eneste æggehvidebestanddel af plasmaet er varmebeståndig til over ca. 60°C. Det er i og for sig kendt at adskille blodplasmaet fra de røde og hvide blodlegemer såvel som fra blodpladerne. Endvidere er det kendt at fjerne -globuliner samt størkningsfremmende substanser som f.eks. fibrinogen fra plasmaet. Til terapeutiske eller diagnostiske formål er det ønskeligt at få en så vidt muligt ren albuminopløsning aller albuminpasta, der så vidt muligt ikke mere skal indeholde yderligere æggehvidebestanddele af blodplasmaet.

Til isolering af albuminet fra blodet betjener man sig navnlig af en under navnet "COHN-metoden" kendt fremgangsmåde (J0Am0ChemSoc.68 (1946), side 459) som ved et udbytte på ca. 70$ muliggør en renhedsgrad af slutproduktet på kun 95-98$. Ved denne fremgangsmåde går man ud fra et af forskellige blodprøver dannet plasma, og fremgangsmåden er i princippet en fraktioneret udfældning under forskellige betingelser. I det første trin fraskilles ved -3°C og en pH-værdi på 7*2 under en alkoholtilsætning på 8$ først det første sediment, overvejende fibrinogen.

Den resterende væske befries i tre yderligere operationer, alle ved temperaturer under 0°C og stigende alkoholindhold af væsken, efterhånden for /{-globuliner såvel som og p>-globuliner. Derefter får man en såkaldt råalbuminpasta, som enten omdannes til en 5$ albuminopløsning eller tinderkastes en yderligere rensning, ved hvis afslutning fremkommer en 20$ albuminopløsning. Hele den fraktionerede fraskillelse ved den kendte COHN-metode kræver ca.6 - 8 dage ved normale 8-timers arbejdsdage. Endvidere er det ved denne metode en ulempe, at talrige operationer må udføres ved nøjagtigt indstillede temperaturer under 0°C. Dette kræver enten, at hele laboratoriet holdes på denne temperatur, eller at reaktionsbeholderne køles med stor bekostning. Begge dele er en ulempe og føles navnlig af laboratoriepersonalet som meget ubehageligt.

Endvidere kendes fra GB-patentskrift nr. 739 oZk en fremgangsmåde til isolering af albumin fra pattedyrblod ved selektiv denaturering og ud· fældning af globulinerne fra en vandig opløsning af so rum-albuminet ved en temperatur på 45 - 75°C i nærværelse af caprylationer. Ved denne kendte fremgangsmåde kan opnås udbytter på op til 76$ af den oprindeligt foreliggende albuminmængde og en renhed af produktet på 9h - 98$.

Opfindelsen har til formål at tilvejebringe en fremgangsmåde af den indledningsvis angivne art, med hvilken der kan opnås albuminproduk- 3 141523 ter med en renhedsgrad på praktisk taget 100 $ og i et væsentligt højere udbytte end ved de kendte fremgangsmåder, samtidig med at de omtalt^., praktiske ulemper ved COHN-metoden undgås.

Ved én fremgangsmåde af den indledningsvis angivne art opnås dette ifølge opfindelsen ved, at udfældningen af globulineme yderligere sker i nærværelse af mere end 4$ alkohol med sammensætningen CH^-n(CH2)-0H (n = 0, 1, 2) ved en pH-værdi på over 6,0.

Som udgangeprodukter for fremgangsmåden ifølge opfindelsen-skal kunne anvendes blod, blodprodukter eller placentablod* Ved blodprodukter skal f.eks. forstås mellemprodukter, som er udvundet ved CQHN-raeto-den.

Det væsentligste ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er fældningen af globuliner (operation b) ved varmning af den albuminholdige væske i nærværelse af alkohol. Herunder beskyttes albuminet - i modsætning til alle andre plasmaproteiner - mod udfældning på grund af tilsætning af stabiliserende substanser. Ved protein henholdsvis albuminstabi-liserende substanser forstås sådanne, som selv ved opvarmning af rene albuminopløsninger til over 60°C forhindrer enhver synlig forandring af albuminet. Værker af Ballou et.a. (j. Clinical Xnveet. 23(1944), side 454, J.Brol.Chem. 153 (1944), side 5^9) henviser til, at propionat, butyrat, valerat, caprylat, phenylacetat, phenylbutyrat, tryptophan osv. har de ønskede stabiliserende egenskaber.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen giver et væsentligt større udT bytte og en større renbød af slutproduktet end både CHON-metoden og fremgangsmåden ifølge GB-Patentskrift nr. 739 o24, idet den muliggør opnåeLsen af udbytter på over 9o# ved en renhed på loo$, jfr. Schneider, Fefåvre, Fiedler og McCarty* "An Alternative Method of Large Scale Plasma Fractionation for the Isolation of Serum Albuminum*, offentliggjort i tidsskriftet "Blut", Band 30, side 121-134 (1975), ee især side 124, Table 2* Relation of plasma temperature and pH to albumin recovery, og side 129, tredie afsnit med tilhørende fig.l. Samtidig er fremgangsmåden ifølge opfindelsen væsentlig enklere end COHN-sætoden.

Til opnåelse af det omtalte høje udbytte og den høje renhed er det ifølge opfindelsen hensigtsmæssigt, at der ved varmfældningen anvendes omkring 9$ ethylalkohol i den fraskilte væske, på basis af den totale mængde. I samme øjemed kan der endvidere anvendes ca.0,004 mol natrlui caprylat som albuminstabiliserende stof.

Det skal bemærkes, at ikke-albuminøse plasmabestanddele, som ikke er blevet udvundet i den første fremgangsmådeoperation, kan forblive i den albuminholdige væske, uden at globullnudfældningen forstyrres.

141523 h

Til berigelse af albuminet fra den albuminholdige væske har navnlig maleinsyre og polyethylenglycol vist sig som egnede udfældningsmedier. Det er dog også muligt til denne koncentrations operation at anvende andre polymeriserede, aliphatiske polyvalente alkoholer, organiske syrer, bestemte salte, monomere alkoholer eller andre til æggehvideberigelse egnede midler.

Til omdannelse af den udfældede albuminpasta til en opløsning med den ønskede koncentration opløses pastaen i tilslutning til de nævnte operationer i en fortrinsvis puffert væske. Albuminopløsningen kan så fortrinsvis varmester ilis er es uden tilsætning af en stabilisator.

Varianter af fremgangsmåden såvel som yderligere egenskaber og fordele ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er nærmere forklaret i det følgende under henvisning til tegningen, på hvilken fig.la anskueliggør udfældningsforløbet ved den såkaldte COHN-metode, fig.lb på lignende måde anskueliggør fremgangsmåden ifølge opfindelsen og fig. 2a til 2h viser immunelektrophoresediagrammer (iEP) for forskellige albuminpræparater, som er fremstillet ved kendte fremgangsmåder henholdsvis ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

I fig.la er skematisk vist de forskellige trin i den såkaldte COHN-metode. Man går ud fra et blandet plasma, til hvilket der tilsættes 8$ ethanol, og som udfældes med en pH-værdi på 7» 2 ved -3°C. Her fraskilles fraktion I. Den resterende væske blandes derefter ved -5°C og med en pH-værdi på 5»8 med 19$ ethanol. Derved udskilles fraktionerne II og III, der hovedsagelig består af ^-globuliner. Påny behandles den resterende væske med højere alkoholindhold, en pH-værdi på 5»8 og en temperatur på -7°G. Herved udvindes fraktion IV, der hovedsagelig består af .jC- og H-globuliner„ Den resterende væske behandles endnu engang ved en pH-værdi på k, 8 og en temperatur på -7°C (efchanolindhold 4θ$). Derved udskilles det såkaldte råalbumin som sediment. Den resterende væske bortkastes»· Råalbuminet kan efter frysetørring til fjernelse af alkoholen omdannes til en 5$ opløsning. Det er imidlertid også muligt påny at udrøre råalbuminpaståen og i to yderligere operationer (som vist i diagrammet) at omdanne den til en renset albuminpasta0

Ialt behøves til fremstillingen af den rensede pasta 6-8 dage hvis der arbejdes med en normal 8-timers dag. Endvidere må der afkøles meget omhyggeligt, hvilket kræver et tilsvarende højt opbud af proces-teknisk apparatur.

5 k.' ' 1A152 3 I modsætning hertil kan fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres væsentlig enklere, se fig. Ib. Også her går man ud fra blandet plasma eller andre væsker, der indeholder såvel albumin aom globuliner· Væsken underkastes - på lignende måde som ved fremgangsmåden ifølge GB-Patént-skrift nr. 739 o24 - en varmebehandling ved en temperatur på 68°C, men i nærværelse af aliphatiske, lavmolekulære alkoholer og stabiliserende sttft-stanser. Som stabiliserende substanser egner sig, som nævnt, bestemte aliphatiske carbonsyrer eller disses salte, såsom natriumcaprylat og andre forbindelser, som er opført i tabel III hos Ballou (J.Brol.Chem. 153 (1944) side 599) og tabel I (J.Chera.Invest. *23 (1944) side 45¾)¾ 1

Ved denne første operation, soia udføres ved’ en pH-værdi på 6^5 og et ethanolindhold på 9$, denatureres og udfældes alle globuliner.

Den resterende væske syrnes til |»H 4,8 efter afkøling og blandes med et præclpitationsmedium, såsom ca. 22$ p o lye thyl engly c o 1 (pEG) eller maleinsyre. Der udskilles en meget ren albtt&érøasta, sum omdanåes til en 5 - 20$ opløsning. * ~ ' 1 ^

Som det allerede fremgår af de principielle beskrivelser, kræves der til fremgangsmåden ifølge opfindelsen en væsentlig kortere tid' og et væsentligt mindre proces teknisk opbud end væd COHN -me t oden, Derud- ' over er imidlertid det udvundne albumin også væsentligt renere end &é1f, der udvindes ved de omta&te kendte metoder. Fig. 2a til 2h viser itmoun-elektrophoresediagrammer (lEP)* af hvilke fremgår følgende!

Fig. 2a og 2c viser I EP-diagrammer for en naturlig plasma, ve<i hvilken albuminseglen dannes til venstre. De derefter til højre følgende tyndere segle hidrører fra globuliner og andre plasmabestanddele, som ved en "ren" albuminopløsning må anses som forureninger. Albumin-opløsninger, som er fremstillet ved COHN-metoden, er vist i fig. 2g og 2h, jfr. den førnævnte tidsskriftartikel. Det ses tydeligt, at en del af forureningerne er fjernet, uden dog at alle uønskede ægge hvide-bestanddele på langt nær er fjernet. Fig. 2b og 2d viser albtådnopløs-ninger, som er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Her kan opnås næsten 100$ renhed. Fig. 2f viser den resteréhde væske, Bom er fremkommet efter den sidste operation i fremgangsmåden (udfældning af albuminet). Det vil her ses, at denne vaske praktisk taget ikke J mere indeholder albumin. Det følger heraf, at der allerede ved den første fremgangsmådeoperation (opvarmning til 68° C i nærværelse af*. -alkohol og natriumcaprylat) er opnået en praktisk taget fuldstændig adskillelse af albuminer og andre æggehvidestoffer i plasmaen.

De enkelte operationer i fremgangsmåden ifølge opfindelsen er forklaret i 6 U1523

Eksempel Xt Plasmaadskillelse

Til plasmaadskillelsen anvendes et plasma, fra hvilket størkningsfaktorerne er fjernet. Størknings faktoren VIII og fibrinogenet er fjernet ved cryoethanolsedimentation. Prothrombirikomplekset fjernes ved DEAE-celluloseadsorption. Det anvendte plasma er Hepatitis-B-antigen-negativ, har normale transaminase-værdier og indeholder intet synligt hæmoglobin. Til det anvendte plasma tilsættes natriumcaprylat, indtil der opnås en koncentration på 0,004 mol. Blandingen, som indeholder ca. 9$ ethanol, opvarmes ved en pH-værdi på 6,5. PH-værdien opnås ved hjælp af 0,5 n HClo Temperaturen bringes i løbet af ca. 3 timer under ensartet varmetilførsel op på ca. 68° C. Derefter afkøles væsken. PH-værdien formindskes ved hjælp af HC1 til pH 4,8. Man lader derefter det syrnede plasma stå natten over ved ca. 10° C.

Fraskillelse af fraktionen

Det allerede varmfraktionerede plasma pumpes gennem silikon-slanger ind i centrifuger med kontinuerlig strømning. De ved plasmaadskillelsen udskilte æggehvidestoffer samler sig i rotorerne. Albuminet forbliver i den resterende væske. De i rotorerne fraskilte æggehvides toffer indeholder stadig albumin, som kan udvindes ved fornyet opslemning og centrifugering og tilføres. den ved første centrifugering opnåede væske inden koncentreringsoperationen.

Koncentrering af albuminet under samtidig reduktion af saltindholdet (udfældning af albuminet)

Den resterende væske filtreres gennem et såkaldt SSK-filter til fjernelse af resterende lipider og forandrede proteiner. Derefter tilsættes præcipitationsmidlet, i det foreliggende tilfælde maleinsyre i en koncentration på 18$ ved stuetemperatur. I løbet af få sekunder bundfældes albuminet. Albuminsuspensionen centrifugeres påny. Herunder forbliver maleinsyren og saltene i den proteinfri væske. Albuminet samler sig i rotorerne som pasta. Det udrøres i en beholder i destilleret vand og omdannes til en 8$ opløsning. Efter klaringsfiltrering kan albuminet direkte omdannes til en 4-5$ brugs opløsning, hvorhos osmolaliteten indstilles med glucose eller andre egnede stoffer. Derefter sterilfiltreres produktet, tappes på flasker og pasteuriseres i mindst 10 timer ved 60° C.

Eksempel 2s

Fremstilling af en 20$ albuminopløsning.

Operationerne "plasmaadskilleIse" og "fraskillelse af fraktionerne" er de samme som i eksempel 1. Der følger udfældning af albuminet og fremstilling af en 20$ albuminopløsning.

7 141523

Den resterende væske filtreres gennem SSK-filter til fjernelse af resterende llplder og forandrede proteiner» Derefter tilsættes som præcipitationsmiddel polyethylenglycol med en molekylvægt på ca. 4000 til 6000 i en koncentration på 22$ ved stuetemperatur. I løbet af 30 minutter bundfældes albuminet. Albuminsuspensionen centrifugeres påny. Herunder forbliver polyethylenglycolet og saltene i den proteinfri væske. Albuminet samler sig 1 rotorerne som pasta. Den udrøres 1 en beholder i destilleret vand og omdannes til en 8$ opløsning. Denne opløsning frysetørres efter en klaringsfiltrering« Det tørrede pulver udrøres i destilleret vand, hvorhos osanolaliteten - som allerede forklaret i eksempel 1 - eventuelt kan tilpasses«

Eksempel 3:

Forbemærkning:

Det er kendt, at to fraktioner, som fremkommer og bortkastes ved COHN-metoden, indeholder albumin i en mængde, som det lønner sig at udvinde. Hertil kræves ganske vist, at der findes en enkel udvin-dingsmetode. Det drejer sig her om fraktionerne IV-1 og fraktion IV-2.

Som fraktion IV-1 betegnes de fraktioner, som udvindes fra den resterende væske II og IH ved tilsætning af 19$ alkohol ved en temperatur på -7° C og en pH-værdi på 5»2. Denne operation er ikke vist i fig. la. Udbyttet er ca. 20-25 g fugtig pasta pr« liter udgangsplasma, der indeholder ca. 30$ protein. Ved fraktion IV-2 forståes den fraktion, som i to operationer udvindes fra den resterende væske II til III.

Disse to operationer er først udvindingen af fraktionen IV-1 sera ovenfor. Derefter tilsættes alkohol indtil en mængde af 40$, medens temperaturen på -6° C og en pH-værdi på 6,5 opretholdes. Derved udfældes fraktion IV-2. Bundfaldet fjernes ved centrifugering. Resultatet er ca. 30 til 35 S pasta pr. liter plasma. Pastaen består for 30$ ved-r kommende af protein.

Til udvindingen foreslås følgende fremgangsmåde: 1,0 kg af fraktionen IV-1 (pasta) suspenderes i 2,0 liter vand, der indeholder 0,004 mol natriumcaprylat som stabiliserende substans. Med natriumhydroxid bringes pH-værdien op på 7 til 7»5* Suspensionen omrøres svagt ved stuetemperatur. Ph-værdien kontrolleres og reguleres periodisk. Størstedelen af pastaen opløses i løbet af 1 time. Den fremkomne råopløsning indeholder ca, 10$ protein og 4 til 5$ alkohol. Opløsningen indstilles til 9$ alkohol.

Derefter følger en opvarmning til 68° C. Bundfaldet, som hovedsagelig indeholder uønskede globuliner, centrifugeres og vaskes til 8 141623 fjernelse af det endnu indeholdte albumin. Den resterende væske klarfiltreres og fældes på den beskrevne måde (eksempel 1 og 2) med polyethylenglycol eller maleinsyre eller andre fældningsmedier.

Eksempel ki På lignende måde som i eksempel 3 kan 1,0 kg af fraktion IV-2 (pasta) suspenderes i 3*0 1 vand, som indeholder 0,004 mol natri-umcaprylat som stabiliserende substans. Opløsningen indeholder ca.

7,5# protein og ca. 7# alkohol.

Udvindingen af albuminet fra opløsningen sker på den i eksempel 3 beskrevne måde. Til udvinding af albuminet fra opløsningen bør denne indstilles til 9# alkohol.

Det har eksperimentelt vist sig, at ca. 20# af proteinet i fraktion IV-1 er albumin. Der kan yderligere udvindes 1 til 2 g albumin pr. liter udgangsplasma. I samme størrelsesorden ligger den yderligere albumingevinst ved fraktion IV-2.

I stedet for den i eksemplerne nævnte berigelse af albuminet ved PEG-fældning og/elier frysetørring kan der også foretages en ultrafiltrering eller en forsigtig fordampning af opløsningsvandet ved r o t ations fordampning.

Hvis koncentreringen af den efter globulinfraskillelsen resterende væske sker ved andre metoder end ved albuminfældning (f.eks. ved ultrafiltrering, rotationsfordampning), må den ønskede osmolalitet, saltsammensætningen og hydrogenionkoncentrationen indstilles ved dialyse mod en tilsvarende væske.

Udbyttet andrager efter eksperimentel erfaring over 9o# af det oprindeligt tilstedeværende albumin, medens der ved de ovenfor omtalte kendte fremgangsmåder kun kan regnes med et udbytte på højst 76#, til trods for den mindre renhedsgrad.