DE2556733C3

DE2556733C3 - Verfahren zum Isolieren von Albumin aus Blutplasma

Info

Publication number: DE2556733C3
Application number: DE2556733A
Authority: DE
Inventors: Waldemar Dr. 5800 Hagen Schneider
Original assignee: Armour Pharma & Co Kg 3440 Eschwege GmbH; Armour Pharma GmbH
Current assignee: Armour Pharma GmbH
Priority date: 1975-12-17
Filing date: 1975-12-17
Publication date: 1986-10-02
Also published as: PL106430B3; AU508955B2; DD128726A6; DK149135C; ZA767503B; ES454379A2; MX3915E; FI763610A; CH632277A5; CA1079269A; DE2556733A1; DK559876A; AT346491B; DE2556733B2; NL7613906A; AU2059976A; SE7613968L; IL51110A; FI56844B; BE849464R

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren von Albumin aus menschlichem Blutplasma, dem die Gerinnungsfaktoren entzogen worden sind, durch Hitzebehandlung in Gegenwart von albuminstabilisierenden Substanzen und im Bereich neutraler pH-Werte, sowie anschließender Abkühlung unter Erniedrigung der pH-Werte auf Werte um pH 4, anschließendes Ausfällen des gebildeten Niederschlags, der im wesentlichen Globuline enthält, sowie Abtrennen des Albumins mit Hilfe von Präzipitoren aus der erhaltenen Lösung, wobei die Hitzebehandlung des Plasma in Gegenwart von etwa 9% Alkohol erfolgt und das Gemisch gleichmäßig auf eine Temperatur im Bereich von 60—75° C erhitzt wird, nach Patent 24 15 079.

Die Abtrennung der ausgefällten Globuline und eventueller anderer aufgrund einer Hitzefällung ausgefallener Eiweißstoffe geschieht bei dem Verfahren gemäß Stammpatent bei einem pH-Wert von 4,4 durch Zentrifugieren im kontinuierlichen Fluß. Die abgeschiedenen Eiweißstoffe sammeln sich in den Rotoren, und das Albumin verbleibt in der überstehenden Flüssigkeit.

Bei dieser Abtrennmethode wird es als unvollkommen empfunden, daß relativ viel Albumin in dem abgeschiedenen Konzentrat verbleibt, so daß noch mehrere Wasch- und Zentrifugier-Arbeitsgänge zur Gewinnung des wertvollen Restalbumins erforderlich sind. Außerdem ist das Zentrifugieren sehr zeit- und arbeitsaufwendig. Trotz dieser Nachteile wurde keine andere Arbeitsweise in Erwägung gezogen, weil es bei der seit vielen Jahren praktizierten Cohn-Methode üblich und notwendig ist, die Suspension, bestehend aus gefällten Globulinen und gelöstem Albumin, durch Zentrifugieren zu trennen. Versuche haben ergeben, daß die Suspension gemäß der Cohn-Methode praktisch bei normalen Anforderungen nicht zu filtrieren sind.

Da es sich bei den gemäß Verfahren des Stammpatents und der bekannten Cohn-Methode gewonnenen Substanzen um solche handelt, die aus gleichem Ausgangsmaterial gewonnen wurden und praktisch die gleiche Konsistenz als Zwischenprodukt und als Endprodukt aufweisen, wurdi. zunächst nicht angenommen, daß die gemäß Verfahren des Stammpatents gewonnenen Substanzen überhaupt zu filtrieren waren.

Es zeigte sich auch, daß Filterversuche mit den üblicherweise verwendeten Schichtenfiltern keine Vorteile gegenüber den Zentrifugier-Methode ergaben.

Entgegen Erfahrung und Erwartung läßt sich überraschenderweise die Aufgabe lösen, mit wesentlich geringerem Aufwand die hitze-gefällten Eiweißstoffe aus der Suspension abzutrennen, indem gemäß der Eifindung die Abtrennung der ausgefällten Globuline und eventueller anderer ausgefällter Eiweißstoffe durch eine Schwemmfiltrierung der Suspension an einem Gewebefilterelement erfolgt

Das Schwemmfiltrieren ist an sich bekannt (Storz, H. Die industrielle Obst- und Gemüseverwertung 59, 364-373 (1974); Schuster, K. Die Technologie der is Würzebereitung, Ferd. Enke Verlag, Stuttgart (1968), S. 310 -312 und S. 395-399; F. Keiner: Kieselgur, Enke Verlag Stuttgart 1951, S. 140. Die Schwemmfiltrierung erfolgt üblicherweise in Zentrifugal-Reinigungsfiltern, die im wesentlichen aus einem geschlossenen Druckkessel bestehen, in dem auf einer zentrisch laufenden Hohlwelle runde Filterelemente angeordnet sind, die entweder horizontal oder vertikal parallel zueinander liegen. Die Filterelemente sind üblicherweise mit einem Metalltressengewebe ausgerüstet

Die zu filtrierende Substanz wird mit Filterhilfsmitteln versetzt, üblicherweise Kieselguren, die je nach Trübungsart und Charakter der Rückstände dosiert zugemischt herden.

Das auf den Filterelementen sich ansammelnde FiItrat wird durch Rotation der Filterelemente und Gegenspülung abgeschwemmt Die Rückstände werden als sogenannter Slurry ausgetragen. Das Schwemmfiltrieren bietet im vorliegenden Falle überraschende Vorteile, da andere Filterarten und Filtriermethoden derartig lange Filterzeiten benötigen, daß sie keinerlei Vorteile gegenüber der zeitraubenden Zentrifugiermethode ergeben. Dabei wurden folgende Filtermethoden getestet: Klärfiltration mit Kohle- und Asbestscheibenfilter; Filterschichten auf Zellulosebasis; Glasfaserfilter; gesintertes Glas. Die verwendeten Filtriermethoden führten entweder zu übermäßig langen Filtrierzeiten, Verstopfungen der Filtereinsätze oder zu trüben gefilterten Flüssigkeiten. Nur die Verwendung eines Schwemmfilters ermöglicht es, klare Filtrate zu erhalten, die keine zusätzlichen Klärfiltrationen notwendig machen und die damit ein optimales Arbeiten bei der Albumin-Gewinnung ermöglichen.

Im folgenden wird das erfindungsgenäße Verfahren anhand von Ausführungsbeispielen erläutert. Die Filtrierung wird bei dem Verfahren in einem Zentrifugal-Reinigungsfilter mit geschlossenem Druckkessel und einer Maschenweite der Filterelemente zwischen 20 und 200 μ durchgeführt. Insbesondere wird für die vorliegenden Flüssigkeiten mit einer Maschenweite von 70—90 μ gearbeitet Bei dieser Maschenweite ergibt sich ein Optimum zwischen erreichbarem Durchsatz und vollständiger Ausfiltrierung, wobei jeweils nur ein Filtergang durchgeführt werden muß.

Um die Filterfläche ausreichend für die nachfolgende Filtrierung vorzubereiten, wird in manchen Fällen zunächst eine Primäranschwemmung mit einer Neutralflüssigkeit genommen, bei der das Filterelement mit einer Schichtdicke von etwa 0,5 cm des Filterhilfsmittels belegt wird. Als Filterhilfsmittel eignen sich üblicherweise im Handel angebotene Kieselguren mit den Markenbezeichnungen Hyflo-Super-Gel, Celite 545 oder Perlite. Daneben eignen sich auch Zellulose-Filterhilfsmittel bekannter Art, jedoch mit weniger guten

Fikerleistungen. Mit ihnen läßt sich ebenfalls ein für viele Fälle ausreichendes Produkt gewinnen. Es empfiehlt sich, das Filterhilfsmittel vorzuquellen.

Es kann ein horizontal angeordnetes, mit 80 μ Maschenweite versehenes Metalltresstmgewebe-Filterelement verwendet werden.

Bei dem Verfahren werden beispielsweise etwa 4 bis 6% Plasmaeiweiß suspendiert, und diese Suspension mit etwa 20 bis 70 g Kieselgur-Filterhilfsmittel pro Liter versetzt Diese Suspension wird anschließend Filt-iert Niedrigere Eiweiß-Konzentrationen bedingen u.U. auch niedrigere Filterhilfsmittelmengen.

Um auch das sich im Trubvolumen (Slurry) befindliche Albumin noch zu gewinnen, wird beispielsweise so vorgegangen, daß durch eine Restvolumenfiltereinrichtung mit einem kleinen Teil der Gesamtfilterfläche auch dieses ausgebracht wird, nachdem eine Abreinigung durch Rotation und Gegenspülung oder eine im Kreislaufverfahren erfolgte Klärung des Filterapparatevolumens stattgefunden hat Um die Ausbeute zu vergrößern, kann ohne Einbuße der Filterfähigkeit mit einem Druck von 4,0 ± 2,5 bar gearbeitet werden.

Die Erfindung wird weiterhin an den nachfolgenden, detaillierten Beispielen erläutert Die beiden Beispiele gehen aus von zwei verschiedenen Suspensionen. Bei Beispiel 1 wird ausgegangen von einer Suspension, die mit Hilfe des Verfahrens gemäß Stammpatent gewonnen worden ist

B e i s ρ i e 1 1

Aus Humanblut werden die festen Bestandteile (Blutzellen und Blutplättchen) abgetrennt und die Gerinnungsfaktoren entzogen. Die Ausgangslösung enthält etwa 5—6% Plasmaeiweiß. Gemäß dem im Stammpatent dargestellten Verfahren werden der Gerinnungsfaktor VIII und das Fibrinogen durch Kryo-Aethanol-Sedimentation entfernt Der Prothrombin-Komplex wird durch Absorption entfernt Das ursprüngliche Plasma ist HBAg-negativ, hat normale Transaminase-Werte und enthält kein sichtbares Hämoglobin. Dem Ursprungsplasma wird Natriumcaprylat zugefügt, bis eine Konzentration von 0,004 Mol erhalten wird. Die Mischung, welche etwa 9% Aethanol enthält, wird bei einem pH-Wert von 6,5 erhitzt. Der pH-Wert wird durch 0,5 η HCl erreicht. Die Temperatur wird in etwa 3 Stunden bei gleichmäßiger Wärmezuführung bis auf 68⁰C gebracht Anschließend wird die Flüssigkeit abgekühlt auf 10⁰C. In einem mit Außenmantel kühlbaren Zentrifugal-Reinigungsfilter wird die Suspension bei 10° C weiterverarbeitet. Die zur Weiterverarbeitung gelangende Lösung enthält etwa 2 ... 2,5% Albumin.

In der Zeichnung ist in einer Prinzipskizze dargestellt, wie die Ausgangslösung verarbeitet wird. Zsntrale Vorrichtung der gesamten Einrichtung ist eh. Filterkessei 20, der aus einem geschlossenen Druckkessel besteht, in dem auf einer zentrisch laufenden Hohlwelle 21 runde Filterelemente 22 angeordnet sind. Die Filterelemente sind mit einem Metall+ressengewebe bespannt. Die Filterelemente stellen im Prinzip eine hohle Lade dar, die mit der Hohlwelle 21 in Verbindung steht. Durch die Hohlwelle wird die Flüssigkeit abgesaugt und über eine Leitung 23 und das Klarlaufventil 8 zum Klartank ausgebracht.

Die ungefilterte Ausgangslösung wird in einem Trübtank 24 unter ständigem Rühren (Rührwerk 3) in Suspension gehalten. Mittels einer Pumpe 2 wird die Ausgangssubstanz über das Trübzulauf-Ventil 10 über zwei Einlaufventile 11, 12 in den Filterkessel 20 eingebracht Der Kessel kann über ein Dmckluft-Ventil 5 mit Druckluft beaufschlagt werden.

Zunächst werden die Filterelemente mit in aqua dest aufgeschwemmten Filterhilfsmittel in einer Aufschwemmung von einem kp Celite 545 (Warenzeichen für ein Kieselgur-Filterhilfsmittel) in 500 Liter Wasser mit einer Primäranschwemmung von etwa 0,2 cm Dicke bei Atmosphären-Druck belegt Anschließend werden 500 Liter albuminhaltige Suspension mit 25 kp Celite 545 versetzt und verrührt Die Mischung wird vom Trübtank in den Filterkessel gegeben und bei einem Überdruck von 2 bar durch die Filterflächen der Elemente 22 gedrückt Vor dem eigentlichen Abfüllen der gefilterten Flüssigkeit zum Klartank wird im sogenannten Kreislaufverfahren (Kreislaufventil 6, Pumpe 2) immerwieder die Substanz durch die Filterelemente hindurchgeschickt bis am Schauglas 25 das Filtrat hinreichend klar erscheint Anschließend wird das Filtrat über das Ventil 8 zum Klartank abgefüllt

Die Filterreinigung erfolgt durch Rotation der Filterelemente mit Hilfe des Antriebsmotors 1 und Austragen des Slurry über das Austragventil 9. Über das Ventil 4 kann die ausgetragene Substanz nochmals aufgeschwemmt und filtriert werden.

Die Flüssigkeit weist nach Durchgang durch den Filter keinen Tyndall-Effekt mehr auf und ist wasserklar. Die Flüssigkeit ist frei von Begleitsubstanzen, wie Lipiden oder Fremdeiweißen. Sie kann unmittelbar der Albuminanreicherung und dem nachfolgenden Filtrationsprozeß zugeführt werden (siehe DE-OS 24 15 079).

Beispiel 2

Aus einem Placenta-Extrakt wird zunächst mit Lösungsmitteln, wie z. B. Trichlor-Essigsäure, Chloroform, Diäthylaether, das vorhandene Hämoglobin entfernt Anschließend wird der eiweißhaltige Überstand bei pH 6,5 auf 68⁰C erhitzt. Nach Abkühlung und Einstellen des pH-Wertes von 4,4 durch Zufügen von 0,5 n-HCl werden 100 Liter der erhaltenen Flüssigkeit mit 3 kp Filterhilfsmittel versetzt und verrührt (Filterhilfsmittel: Hyflo-Super-Gel; Warenzeichen für ein Kieselgur-Filterhilfsmittel).

Bei einer Temperatur von 18° C und einem Druck von 4 bar wird die Flüssigkeit durch ein bereits beschriebenes Anschwemm-Filter mit 70 μ Maschenweite gedrückt Es wird demnach ohne Primäranschwemmung gearbeitet Die Flüssigkeit wird im Kreislauf solange geführt, bis sie am Schauglas wasserklar und frei vom Tyndall-Effekt erscheint. Anschließend wird durch bekannte Verfahren das in der Flüssigkeit befindliche Albumin in die gewünschte Konzentration gebracht.

Nach Durchsatz der Gesamtflüssigkeit wird das sich im Anschwemm-Filter befindliche Trubvolumen mit aqua dest. oder 0,9%iger NaCl-Lösung nachgewaschen. Auch die hierbei gewonnene Flüssigkeit ist wasserklar und enthält noch etwa 0,5—20% Albumin. Sie kann ebenfalls unmittelbar der Albumin-Konzentration zugeführt werden, wie sie z.B. in der DE-OS 24 15 079 erläutert ist

Es sei darauf hingewiesen, daß die Schwemmfiltrierung sowohl mit als auch ohne Primäranschwemmung durchgeführt werden kann. Die Abreinigung der Filterelemente erfolgt durch Rotation und Gegenspülung, wobei die Filterelemente in Drehung gebracht und die Rückstände als Slurry ausgetragen werden.

Bei Anwendung genügender Waschflüssigkeit (aqua

dest. oder NaCl-Lösungen) kann eine Ausbeuteerhöhung bis etwa 96% der eingesetzten Albuminmenge erreicht werden. Die bei anderen Separationsverfahren, wie z. B. der Zentrifugiertechnik, insbesondere bei der Elution der erstmals abgeschiedenen Eiweißstoffe erhaltenen Trubstoffmengen — verursacht durch Änderung des Dichteverhältnisses Lösungsmittel: Feststoff und feinste mechanische Verteilung — werden durch eine Restvolumenfilterung vermieden, nachdem entweder eine Abreinigung durch Rotation und Gegenspülung oder eine im Kreislaufverfahren erfolgte Klärung des Filterapparatevolumens stattgefunden hat. Eine Filtration υογ der Weiterverarbeitung der verdünnten Albuminlösung kann wegen der großen Reinheit unterbleiben.

Die Abtrennung der Feststoffe ist temperaturunabhängig. Die Filtrationsgeschwindigkeit ändert sich mit zu- oder abnehmender Temperatur nur geringfügig und

kann vernachläßigt werden. Üblicherweise wird das auf pH 4,4 angesäuerte, hitzebehandelte Plasma bei Zimmertemperatur in einem mit Außenmantel kühlbaren Zentrifugal-Reinigungsfilter zur Abtrennung gebracht. Das Filtrierverfahren kann auch bei anderen Temperaturen stattfinden. Die Erfahrungen haben ergeben, daß ein Temperaturbereich von 4° bis +40⁰C als Arbeitsbereich möglich ist. Der Filtrationsdruck läßt sich nach der fast drucklos erfolgenden Primäranschwemmung auf 4,0 ± 2,5 bar erhöhen. Die daraus resultierende Filtrationsleistung beträgt ca. 150 Liter Filtrat/m²/h. Als Filterhilfsmittel erweisen sich besondere Kieselguren, wie eingangs genannt, geeignet.

Die in den Beispielen genannten Mengen sind variabel je nach Filterfassungsmenge. Es wurden sowohl Versuche in kleinen Volumina (ca. IO i) ais auch in großen Behältern (ca. 5001) erfolgreich durchgeführt.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zum Isolieren von Albumin aus menschlichem Blutplasma, dem die Gerinnungsfaktoren entzogen worden sind, durch Hitzebehandlung in Gegenwart von albuminstabilisierenden Substanzen und im Bereich neutraler pH-Werte, sowie anschließender Abkühlung unter Erniedrigung der pH-Werte auf Werte um pH 4, anschließendes Ausfällen des gebildeten Niederschlags, der im wesentlichen Globuline enthält, sowie Abtrennen des Albumins mit Hilfe von Präzipitoren aus der erhaltenen Lösung, wobei die Hitzebehandlung des Plasmas in Gegenwart von etwa 9% Alkohol erfolgt und das Gemisch gleichmäßig auf eine Temperatur im Bereich von 60-75⁰C erhitzt wird, nach Patent 24 15079, dadurch gekennzeichnet daß die Abtrennung der ausgefällten Globuline und eventueller anderer ausgefällter Eiweißstoffe durch eine Schwemmfiltrierung der Suspension an einem Gewebefilterelement erfolgt