Przedmiotem wynalazku jest sposób wydziela¬ nia albuminy z krwi, produktów z krwi, innych cieczy ustrojowych i ekstraktów tkankowych, we¬ dlug patentu glównego nr 93587. Przy otrzymywaniu albuminy z krwi, produktów krwi, zawierajacych albuminy cieczy ustrojowych itij. uzyskuje sie zawiesine, zawierajaca albuminy, która obok rozpuszczonej albuminy zawiera wy¬ tracone substancje bialkowe, w szczególnosci glo¬ buliny. W opisie patentu glównego nr 93587 opi¬ sano sposób wydzielania albuminy z krwi ludz¬ kiej! itp., który obejmuje nastepujace etapy. Pierw¬ szy — oddzielanie plazmy od stalych i zwieksza¬ jacych krzepniecie rozpuszczalnych skladników krwi i — w razie potrzeby — otrzymywanie roz¬ puszczalnych skladników nie-albuminowych. Dru¬ gi — stracanie globulin przez ogrzewanie pozosta¬ lej cieczy w obecnosci 7—12% objetosciowych alkoholi o skladzie CH3-n(CH2)-HO, gdzie n = 0,1 albo 2, i stabilizatorów albuminy, jak np. kapry- lanu sodu, w temperaturze okolo 60—75°C i od¬ dzielanie cieczy od globulin. Trzeci — zatezanie albuminy z roztworu, zawierajacego albuminy. Oddzielanie wytraconych globulin i ewentual¬ nych innych wytraconych substancji bialkowych przez stracanie pod wplywem ciepla przeprowadza sie wedlug sposobu, opisanego w opisie patentu glównego nr 93587 przy wartosci pH = 4,4 przez odwirowanie w strumieniu ciaglym. Oddzielone substancje bialkowe zbieraja sie w wirnikach, i albumina pozostaje w cieczy, znajdujacej sie na wierzchu. Wada znanej metody oddzielania jest to, ze sto¬ sunkowo duzo albuminy pozostaje w oddzielonym koncentracie, tak ze potrzebne sa jeszcze liczne procesy przemywania i wirowania dla uzyskania cennej albuminy resztkowej. Oprócz tego wirowa¬ nie jest bardzo czaso- i pracochlonne, i stwarza wiele halasu. Pomimo tych wad nie brano pod uwage innejf metody pracy, poniewaz w prakty¬ kowanej od wielu lat metodzie Cohn'a przyjete i potrzebne jest rozdzielanie zawiesiny, skladaja¬ cej sie z wytraconych globulin i rozpuszczonej albuminy, przez odwirowanie. Doswiadczenia wy¬ kazaly, ze zawiesiny wedlug metody Cohn'a pra¬ ktycznie przy normalnych wymaganiach nie daja sie filtrowac Zbadano rózne metody saczenia, aby usunac stracone proteiny, otrzymane przy zimnym frak¬ cjonowaniu etanolem. Saczenie utrudniala szcze¬ gólna konsystencja substancji. Stwierdzono, ze globuliny, które otrzymano przy stracaniu etano- lowym pod wplywem ciepla, róznia sie znacznie od tych, które otrzymano przy stracaniu na zimno. Nieoczekiwanie stwierdzono, ze mozna oddzielic z zawiesiny przy znacznie mniejszym nakladzie substancje bialkowe, wytracone pod wplywem ciepla, jesli oddzielanie przeprowadza sie przez saczenie splawiakowe zawiesiny. 106 4303 106 430 4 Wedlug wynalazku sposób wydzielania albuminy z krwi, produktów krwi, innych cieczy ustrojo¬ wych i ekstraktów tkankowych poprzez oddziele¬ nie plazmy od stalych skladników krwi, komórek krwi i plytek krwi, ewentualne odzyskanie roz¬ puszczalnych skladników nie-albuminowo-plazmo- wych z plazmy, wytracenie i oddzielenie globulin, wzbogacenie albuminy, korzystnie przez wytrace¬ nie i oddzielenie, w którym wytracenie globulin prowadzi sie przez ogrzewanie oddzielonej cieczy w temperaturze 60-75°C w obecnosci alkoholi o wzorze CH8-(CH2)n-OH, w którym n = 0,1 lub 2 i substancji stabilizujacych albuminy, po czym wytracone globuijffjf^pddziela sie wedlug patentu nr \ 935S7, polega^ mi ;tym, ze globuliny oddziela sie na drodze saczenia splawiakowego zawiesin na elemencie filtra siatkowego o wielkosci oczek -^200 jo,, pp. czym tak otrzymany klarowny roz¬ tworzawierajacy albuminy poddaje sie ewentu¬ alnie saczeniu przez przepone do dializy. Saczenie splawiakowe jest znane. Saczenie spla- wiakowe przeprowadza sie zwykle w odsrodko¬ wych filtrach oczyszczajacych, które w zasadzie skladaja sie z zamknietego autoklawu, w którym na ustawionym w osi biezacym wale drazonym umieszczone sa okragle elementy filtra, które albo sa umieszczone poziomo, albo pionowo równolegle wzgledem siebie. Elementy filtra sa zwykle wy¬ posazone w trese z siatki metalowej. Saczona substancje traktuje sie pomocniczymi srodkami do saczenia, zwykle ziemia okrzemkowa, która miesza sie w dawkach zaleznych od rodzaju zmetnienia i charakteru pozostalosci. Przesacz, zbierajacy sie na elementach filtra, splukuje sie przez wirowanie elementów filtra i plukanie w przeciwpradzie. Pozostalosci sa wy¬ noszone jako tak zwaine Slurry (szlam). Saczenie splawiakowe ma nieoczekiwane zalety w porównaniu z innymi metodami saczenia. Oprócz saczenia splawiakowego zbadano nastepujace me¬ tody saczenia: saczenie klarujace za pomoca fil¬ trów tarczowych weglowych i azbestowych, war¬ stwy filtrowe oparte na celulozie, filtry z wlókna szklanego, szklo spiekane. Zastosowane metody saczenia prowadzily albo do nadmiernie dlugich czasów saczenia, zatykania wkladek filtra, albo zbyt metnych przesaczonych cieczy. Zastosowanie filtra splawiakowego umozliwia unikniecie dlugie¬ go czasu saczenia, otrzymanie klarownych prze- saczów, które nie wymagaja dodatkowych filtracji klarujacych, tak ze mozliwe jest optymalne prze¬ prowadzenie procesu uzyskiwania albuminy. W szczególnosci proponuje sie saczenie w od¬ srodkowymi filtrze oczyszczajiacym z zamknietym autoklawem i o wielkosci oczka elementów filtra —200 |i. W szczególnosci dla niniejszych cieczy stosuje sie wielkosc oczka 70—90 u-. Przy tej wielkosci oczka uzyskuje sie optimum miedzy osiagalnym przerobem i calkowitym przesaczeniem, przy czym kazdorazowo trzeba przeprowadzic tylko jeden etap saczenia. W celu wystarczajacego przygotowania powierz¬ chni filtra do nastepujacego saczenia korzystne jest w niektórych przypadkach najpierw przeprowadze¬ nie pierwotnego namulenia za pomoca cieczy obo¬ jetnej, w którym element filtra zostaje oblozony warstwa o grubosci okolo 0,5 cm pomocniczego srodka do saczenia. Jako pomocnicze srodki do saczenia stosuje sie zwykle handlowe ziemie okrzemkowe o oznaczeniach znaków towarowych Hyflo-Super-Cel, Celite 545 albo Perlite. Oprócz tego mozna równiez stosowac znane celulozowe pomocnicze srodki do saczenia, jednakze o mniej dobrym dzialaniu filtrujacym. Za ich pomoca mozna równiez uzyskac dla wielu przypadków wystarczajacy produkt. Zalecane jest wstepne specznienie pomocniczego srodka do saczenia. Korzystne wyniki saczenia uzyskuje sie za po¬ moca umieszczonego poziomo elementu filtra, za¬ opatrzonego w trese z siatki metalowej o wielkosci oczek 80^. Korzystnie przy zawartosci w zawiesinie okolo 4—6 % bialka plazmatycznego zadaje sie zawiesine pomocniczym srodkiem filtracyjnym z~ ziemi okrzemkowej w ilosci okolo 20—70 g na litr. Te za¬ wiesine nastepnie saczy sie. Nizsze stezenia bialka pociagaja za soba ewentualnie równiez mniejsze ilosci pomocniczego srodka filtracyjnego. W celu odzyskania takze albuminy, znajdujacej sie w objetosci osadu tacowego (Slurry), mozna szlam, przepuscic równiez przez urzadzenie do sa¬ czenia objetosci resztkowej o malej czesci calko¬ witej powierzchni filtra, po przeprowadzeniu oczyszczenia przez wirowanie i plukanie w prze¬ ciwpradzie albo klarowania w procesie obiegowym objetosci aparatu filtracyjnego. W celu zwiekszenia wydajnosci mozna stosowac bez straty zdolnosci saczenia cisnienia 4,0 + 2,5 barów. Wynalazek wyjasniaja nastepujace przyklady. W obydwu przykladach zastosowano dwie rózne za¬ wiesiny. W przykladzie I zastosowano zawiesine, która uzyskano za pomoca sposobu wedlug opisu patentu glównego nr 93587. Przyklad I. Z krwi ludzkiej oddziela sie skladniki stale (komórki krwi i plytki krwi) i odciaga sie czynniki krzepniecia. Roztwór wyjscio¬ wy zawiera okolo 5—6 0/0 bialka plazmatycznego. Wedlug sposobu, przedstawionego w opisie patentu glównego 93587, usuwa sie czynnik krzepniecia VIII i fibrynogen przez sedymentacje krio-etano- lowa. Kompleks protrombiny usuwa sie przez absorpcje. Pierwotna plazma jest HBAg-ujemna, ma normalne wartosci transaminazy i nie zawiera widocznej hemoglobiny. Do pierwotnej plazmy dodaje sie kaprylan sodu, dotad az uzyska sie stezenie 0,004 mola. Mieszanine, która zawiera okolo 9% etanolu, ogrzewa sie przy wartosci pH = 6,5. Wartosc pH osiaga sie za pomoca 0,5 n HC1. Temperature doprowadza sie w ciagu okolo 3 godzin przy równomiernym doplywie ciepla do 68°C. Nastepnie ciecz oziebia sie do tempera¬ tury 10°C. W oziebionym za pomoca plaszcza ze¬ wnetrznego odsrodkowym filtrze do oczyszczania poddaje sie zawiesine dalszej przeróbce w tem¬ peraturze 10°C. Roztwór, przechodzacy do dalszej przeróbki, zawiera okolo 2—2,5 % albuminy. Na rysunku przedstawiono schematycznie, jak przerabia sie roztwór wyjsciowy. Centralny przy¬ rzad calego urzadzenia stanowi kociol filtracyjny 40 45 50 51 605 106 430 6 12 o podwójnych"scianach, tak ze za jego pomoca mozna zarówno ogrzewac, jak równiez oziebiac. Kociol ma pojemnosc okolo 220 litrów i powierz¬ chnie filtracyjna okolo 3 m2. Okragle elementy filtra (tarcze filtracyjne) 14 sa polaczone z cen¬ tralnym, zdolnym do wirowania walem drazo¬ nym 13, w ten sposób, ze przesacz po przejsciu przez powierzchnie filtracyjna i srodowisko fil¬ tracyjne, które pokrywa kazdy element filtra, wplywa do srodkowej kolumny i nastepnie zo¬ staje tam odessany i przez przewód 15 i zawór przeplywu klarownego 7 zostaje wyniesiony do od- stojnika. Elementy filtra sa pokryte tresa z siatki metalowej. Elementy filtra stanowia w zasadzie wydrazone bidlo, które jest polaczone z walem drazonymi 13. Pomocniczy srodek filtracyjny i wy¬ tracone globuliny zostaja usuniete z elementów filtra miedzy cyklami filtracyjnymi przez odwi¬ rowanie odsrodkowe i przemyte dodatkowo za po¬ moca 1% roztworu NaCl, tak ze filtr jest na¬ stepnie ponownie przygotowany do nastepnego cyklu. - Nieprzesaczony roztwór wyjsciowy utrzymuje sie w zbiorniku zmetniajacym 16 przy ciaglym mieszaniu za pomoca mieszadla 3 w stanie za¬ wiesiny. Za pomoca pompy 2 wprowadza sie sub¬ stancje wyjisciowa przez zmetniajacy zawór do¬ plywu zawiesiny 9, przez dwa zawory wlotowe , 11 do kotla filtracyjnego 12. Kociol mozna za¬ silac powietrzem sprezonym przez zawór sprezo¬ nego powietrza 5. Najpierw zasila sie elementy filtra przeprowa¬ dzonym w zawiesine w wodzie destylowanej po¬ mocniczym srodkiem filtracyjnym w postaci za¬ wiesiny 1 kg Celite 545 (znak towarowy dla po¬ mocniczego srodka filtracyjnego z ziemi okrzem¬ kowej) w 500 litrach wody z pierwotnym nano¬ szeniem o grubosci okolo 0,2 cm pod cisnie¬ niem atmosferycznym., Nastepnie 500 litrów zawie¬ siny, zawierajacej albumine, zadaje sie 25 kg Celite 545 i poddaje wymieszaniu. Mieszanine wprowadza sie ze zbiornika zawiesiny do kotla filtracyjnego i pod cisnieniem 2 barów przetlacza sie przez powierzchnie filtracyjne elementów 14. Przed wlasciwym zlaniem przesaczonej! cieczy do zbiornika klarujacego przesyla sie w tak zwanym procesie obiegowym (zawór obiegu 6, pompa 2) stale na nowo substancje przez elementy filtra, dotad az we wzierniku 17 pojawi sie przesacz wystarczajaco klarowny. Nastepnie przesacz wy¬ lewa sie przez zawór 7 do zbiornika klarujacego. Skoro tylko oczyszczony, zawierajacy albuminy roztwór opusci filtr, pompuje sie jednoczesnie przez filtr 1%-wy wodny roztwór soli kuchennej. Ilosc tego roztworu jest w przyblizeniu równa objetosci polowy ilosci wsadowej. Szybkosc przeplywu wynosi okolo 150 litrów na godzine. Stezenie proteiny w przesaczu na po¬ czatku procesu wynosi okolo 2,5%, podczas gdy stezenie koncowe wynosi w przyblizeniu 0,05%. Otrzymany roztwór jest klarowny przy stezeniu proteiny w przyblizeniu 1,5% albuminy i wspól¬ czynniku osmotycznym okolo 1000 mosm. Klarowny przesacz poddaje sie nastepnie dja- saczeniu z zastosowaniem systemu kasetowego Millipore Pellicon (powierzchnia filtra okolo 0,9 m2, producent: Millipore GmbH Neu-Isenburg, /JfcFN) az do osiagniecia wspólczynnika osmotycznego 100—200 mosm. Szybkosc zmian przeplywu na po- czatku procesu wynosi okolo 5—6 litrów przesa¬ czu na minute. Diasaczenie stanowi saczenie przez przepone do dializy. Oczyszczanie filtra przeprowadza sie przez wi¬ rowanie elementów filtra za pomoca silnika na- pedowego 1 i wynoszenie szlamu (Slurry) przez zawór wyladowczy 8. Przez zawór 4 mozna wyla¬ dowana substancje ponownie przeprowadzic w za¬ wiesine i przesaczyc. Ciecz juz po przejsciu przez pierwszy filtr nie wykazuje wiecej efektu TyndalFa i ma klarow¬ nosc wody. Ciecz nie zawiera praktycznie sub¬ stancji towarzyszacych, takich jak lipidy albo obce bialka. Mozna ja równiez doprowadzic bez¬ posrednio do wzbogacania albuminy i do opisa- 29 nego nastepujacego procesu filtracyjnego. Wzbo¬ gacanie albuminy jest znane i opisane w opisie patentu glównego nr 93587. W zasadzie przeprowadza sie ogólem nastepu¬ jace etapy: 36 Plazma, 600 kg zawiera: 33,6 kg proteiny, z tego 18,48 kg al¬ buminy (= 55%). 1. +9% etanolu • +0,004 M kaprylanu sodu 38 +HC1 (do pH = 6,5) 2. Stracanie w podwyzszonej temperaturze: , 30 minut, 68°C 3. +HC1 (pH = 4,4) 4. Saczenie splawiakowe Roztwór albuminy o zawartosci 17,2 kg albu¬ miny (stopien-skutecznosci 93%). Przyklad II. Z ekstraktu lozyska usuwa sie najpierw obecna hemoglobine za pomoca rozpusz- ^ czalników, takich jak np. kwas trójchlorooctowy, chloroform, eter dwuetylowy; Nastepnie zawiera¬ jaca bialko pozostalosc ogrzewa sie przy wartosci pH = 6,5 do temperatury 68°C. Po oziebieniu i usta¬ leniu wartosci pH = 4,4 przez dodanie 0,3 n HC1 45 dodaje sie do 100 litrów otrzymanej cieczy- 3 kg pomocniczego srodka filtracyjnego i poddaje wy¬ mieszaniu (pomocniczy srodek filtracyjny: Hyflo- -Super-Cel; znak towarowy dla pomocniczego srodka filtracyjnego z ziemi okrzemkowej). 50 W temperaturze 18°C i pod cisnieniem 4 ba¬ rów przetlacza sie ciecz przefz opisany juz filtr z pomocnicza warstwa filtracyjna o wielkosci ocz¬ ka 70 \jl. Proces prowadzi sie zatem bez pierwot¬ nego namulania. Ciecz prowadzi sie w obiegu tak 55 dlugo, az we wzierniku wykaze ona klarownosc wody i brak efektu Tyndaira. Nastepnie w zna¬ ny sposób doprowadza sie albumine, znajdujaca sie w cieczy, do zadanego stezenia. Po przerobie calej cieczy objetosc osadu taco- «o wego, znajdujaca sie w filtrze z pomocnicza war¬ stwa filtracyjna, przemywa sie dodatkowo za po¬ mocavwody destylowanej albo 0;9%-wego roztwo¬ ru NaCl. Równiez ciecz, uzyskana przy tym,, ma klarpwnosc wody i zawiera jeszcze okolo 0,5—20% •5 albuminy. Mozna ja równiez doprowadzic bezpo-7 10C430 8 srednio do stezenia albuminy, jak to jest np. opisane w opisie patentu glównego nr 93587. Saczenie splawiakowe mozna przeprowadzac za¬ równo z pierwotnym namulaniem, jak równiez bez niego. Oczyszczanie elementów filtracyjnych przeprowadza sie przez wirowanie i plukanie prze- ciwpradowe, przy czym elementy filtracyjne wpro¬ wadza sie w ruch obrotowy i pozostalosci sa wy¬ noszone jako Slurry. Przez zastosowanie dostatecznej ilosci cieczy przemywajacej (woda destylowana albo roztwór NaCl), podczas prowadzenia procesu przemywania dotad, az zostanie uzyskana praktycznie calkowita ilosc albuminy, mozna uzyskac zwiekszenie wydaj¬ nosci do okolo 96% wprowadzonej ilosci albumi¬ ny. Tworzeniu sie osadu tacowego, otrzymywa¬ nego w innych procesach separacji, jak np. tech¬ nika wirowania, w szczególnosci przy wymywa¬ niu po raz pierwszy oddzielonych substancji bialkowych, w wyniku zmiany stosunku gestosci rozpuszczalnika do gestosci substancji stalej i mak¬ symalnego mechanicznego rozdrobnienia, zapobie¬ ga sie przez saczenie objetosci resztkowej, po przeprowadzeniu albo oczyszczenia przez wirowa¬ nie i plukanie w przeciwpradzie, albo klarowania objetosci aparatu filtracyjnego w procesie obie¬ gowym. Z powodu praktycznie 100%-wej czysto¬ sci albuminy mozna zrezygnowac z saczenia przed dalsza przeróbka rozcienczonego roztworu albuminy. Oddzielanie substancji stalych jest niezalezne od temperatury. Szybkosc saczenia zmienia sie ze wzrostem albo spadkiem temperatury tylko nie¬ znacznie i moze byc pominieta. Zwykle zakwa¬ szona do pH = 4,4, poddana obróbce cieplnej plazme doprowadza sie do oddzielania w tempe¬ raturze pokojowej w odsrodkowym filtrze oczy¬ szczajacym, oziebianym za pomoca plaszcza ze¬ wnetrznego. Proces saczenia mozna równiez prze¬ prowadzic w innej temperaturze. Doswiadczenia wykazaly, ze zakres temperatur 4° do +40°C mozna stosowac jako zakres roboczy. Cisnienie filtracyjne mozna po prawie bezcisnieniowo prze¬ biegajacym pierwotnym namulaniu zwiekszyc do 4,0 + 2,5 barów. Wynikajaca stad sprawnosc sa¬ czenia wynosi okolo 150 litrów przesaczu ma/n. Jako pomocnicze srodki filtracyjne nadaja sie szczególnie ziemie okrzemkowe, jak podano na wstepie. Ilosci wymienione -w przykladach sa zmienne w zaleznosci od ilosci oprawy filtra. Przeprowa¬ dzono zarówno próby w malych objetosciach (okolo 10 litrów), jak równiez w duzych zbior- s nikach (okolo 500 litrów) z dobrym wynikiem. PL PL PL PL PL PL PL