DE3045990A1

DE3045990A1 - Verfahren zur reinigung von teilchen biologischen ursprungs

Info

Publication number: DE3045990A1
Application number: DE19803045990
Authority: DE
Inventors: Philippe 92380 Garches Adamowicz; Ludwig 92350 Le Plessis-Robinson Muller; geb. Bonnet Alberte 92250 La Garenne-Colombes Platel
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1979-12-07
Filing date: 1980-12-05
Publication date: 1981-09-03
Also published as: DE3045990C2; US4335214A; FR2470795B1; JPS5692219A; GB2064322A; JPH0133157B2; FR2470795A1; GB2064322B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Teilchen biologischen Ursprungs, insbesondere von Teilchen mit Antigenwirkung, beispielsweise von Teilchen viraler oder subviraler Herkunft. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet zur Reinigung des Oberflächenantigens des Hepatitisvirus B. Ganz allgemein besteht ein erhebliches Bedürfnis zur Reinigung solcher biologischer Teilchen, die ein relativ niedriges Molekulargewicht (oder Teilchengewicht im Fall von Molekülansammlungen) aufweisen, selbst wenn es etwa doppelt so groß ist wie das der Verunreinigungen mit dem höchsten Molekulargewicht, die diese Bestandteile begleiten. Dies ist beispielsweise der Fall bei dem Antigen HBs (oder AgHBs), dessen Teilchengewicht im Bereich von 2 Mio liegt, und das man ausgehend von Blutserum oder Blutplasma gewinnen kann, welche Ausgangsmaterialien man gegebenenfalls zuvor Reinigungsbehandlungen unterworfen hat, um beispielsweise den Hauptanteil der Immunkomplexe und mindestens einen Teil der Lipoproteine zu entfernen, die das als Ausgangsmaterial eingesetzte Plasma oder Serum begleiten.

Ganz allgemein ist das erfindungsgemäße Verfahren auch für die Reinigung von biologischen Teilchen geeignet, die eine bestimmte Dxchte aufweisen oder innerhalb eines bestimmten Dichtebereichs vorliegen, durch Abtrennen von Verunreinigungen mit einer bestimmten, insbesondere erhöhten Dichte, selbst wenn diese Verunreinigungen niedrigere Molekulargewichte (oder Teilchengewichte) aufweisen.

Das perfektionierte erfindungsgemäße Verfahren nutzt an sich bekannte Methoden aus, indem es eine Geschwindigkeitszonenfraktionierung (oder Geschwindigkeitsfraktionierung)

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anwendet, wobei das Verfahren darin besteht, eine Lösung oder Suspension, die vorzugsweise aufkonzentriert und vorzugsweise ebenfalls teilweise gereinigt worden ist, einer Ultrazentrifugierung in Kontakt mit einem flüssigen Medium zu unterwerfen, das einen Dichtegradienten aufweist, dessen extreme Werte vorzugsweise zu beiden Seiten jener Werte liegen, die den Dichten (Volumenmassen) der zu .trennenden biologischen Teilchen entsprechen, beispielsweise im Bereich einer Dichte von 1,17 bis 1,2o g/cm im Fall des Antigens HBs in einer Cäsiumchloridlösung. Wenn man die Geschwindigkeitszonenfraktionierung bei einer solchen Geschwindigkeit und während einer solchen Zeitdauer bewirkt, daß sich eine differenzierte Wanderung der biologischen Teilchen einerseits und der Verunreinigungen ande- rerseits unter der Einwirkung der Zentrifugalkraft ergibt, kann man, wie bekannt ist, letztlich eine Trennung der durch Zentrifugieren gewonnenen Banden, die die an Verunreinigungen verarmten viralen Teilchen enthalten, einerseits von jenen, die im wesentlichen die abgetrennten Verunreinigungen enthalten, andererseits bewirken.

. In gewisser Hinsicht kann die Erfindung auch als eine Perfektionierung des Verfahrens angesehen werden, das darauf abstellt, eine isopyknische Fraktionierung der in Rede stehenden biologischen Teilchen zu bewirken, wobei dieses Verfahren darin besteht, eine Lösung oder eine Dispersion, die vorzugsweise aufkonzentriert und vorzugsweise teilweise gereinigt ist, einem Dichtegradienten zu unterwerfen, dessen . extreme Dichten vorzugsweise zu beiden Seiten der Dichtewerte liegen, die der Dichte (oder dem Dichtebereich) der zu reinigenden viralen Teilchen entspricht. Es ist bekannt, daß bei Anwendung dieser Methode die biologischen Teilchen der in Rede stehenden Art dazu neigen, dann, wenn die Zentrifugierung ausreichend stark ist, sich in einer Bande des Gradienten zu immobilisieren, deren Dichte oder deren

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Dichtebereich (isodichte Bande) der Dichte oder dem Dichtebereich der Teilchen entspricht, so daß diese in dieser Bande "eingefangen" werden, selbst wenn das Zentrifugieren noch fortgesetzt wird.
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Die Methode der isopyknischen Fraktionierung, die sich für das Aufkonzentrieren und Reinigen von biologischen Teilchen mit hohem Molekulargewicht oder hohem Teilchengewicht, beispielsweise von viralen Teilchen, wie Grippeviren, deren Molekulargewicht im Bereich von 1oo Mio. liegt, besonders gut eignet, kann ein geringes wirtschaftliches Interesse besitzen, wenn die zu trennenden biologischen Teilchen, wie das Antigen HBs, ein relativ geringes Teilchengewicht aufweisen, da dann die Wanderungsgeschwindigkeit dieser Teilchen in dem Gradienten besonders niedrig ist. Die Konzentration dieser Teilchen in der isodichten Bande setzt damit längere Zentrifugierungsdauern voraus. Dieser wirtschaftliche Nachteil kann sich zu jenem hinzuaddieren, der sich durch das schließlich erreichte Gleichgewicht zwischen den Wanderungsabständen der zu reinigenden biologischen Teilchen einerseits und mindestens eines Teils der Verunreinigungen andererseits ergibt, insbesondere wenn diese höhere Dichten aufweisen als die biologischen Teilchen. In der Tat können die Verunreinigungen, wenn diese Verunreinigungen mit niedrigerem Molekulargewicht in einer ersten Stufe wegen ihres geringeren Molekulargewicht s "weniger schnell wandern" als die gereinigten biclogischen Teilchen (ein Phänomen, das man bei der Geschwjndigkeitsfraktionierung ausnützt) neigen diese Verunreinigungen beim Portführen des Zentrifugierens dazu, wieder dxe isodichte Bande, in der sich die zu reinigenden biologischen Teilchen ansammeln, zu erreichen oder schließlich zu durchlaufen. Dies ist insbesondere bei unzureichend vorgereinigten Antigen HBs-Konzentraten zu befürchten, da eine isopyknische Fraktionierung eines Anti-

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gen HBs-Konzentrats in einer Zentrifuge dos Typs, wie er im Handel unter der Bezeichnung "Electro Nucleonics" des Typs "K" oder "RK" erhältlich ist, in einem Dichte.<jradienten bei einer Zentrifugierungsgeschwindigkeit von 35ooo min 16 bis Stunden benötigen kann, so daß sich eine schlechte Produktivität pro Zeiteinheit (wenn man insbesondere die erhöhten Kosten der notwendigen Vorrichtungen berücksichtigt) und eine erhebliche Restverunreinigung ergibt, insbesondere durch Makroglobuline des Plasmas ergeben; weiterhin wird es in der Praxis dann,wenn die zu reinigenden biologischen Teilchen ein geringes Teilchengewicht aufweiscan, unmöglich, in dieser Art von Vorrichtung kontinuierlich zu arbeiten unter den üblichen Bedingungen, die bei der Behandlung von Molekülen oder Molekülaggregaten mit erhöhtem Molekulargewicht angewandt werden, Bedingungen, die es erforderlich machen, den Rotor kontinuierlich mit der zu behandelnden Suspension oder Lösung zu versorgen und die Abströme kontinuierlich abzuziehen (offener Kreislauf).

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, die oben angesprochenen Schwierigkeiten mindestens zum Teil zu beseitigen und insbesondere ein Verfahren zu schaffen, das die Reinigung von biologischen Teilchen auch mit relativ niedrigem Molekulargewicht und insbesondere des Antigens HBs ermöglicht, unter Anwendung von technischen Möglichkeiten, die durch die oben angesprochenen Verfahren geschaffen werden, unter Bildung von Produkten mit hoher Reinheit unter wirtschaftlich günstigen Bedingungen, insbesondere durch eine erhebliche Verringerung

3o der erforderlichen Zentrifugierungsdauer.

Diese Aufgabe wird nun gelöst durch die kennzeichnenden Merkmale des Verfahrens gemäß Hauptanspruch. Die Unteransprüche betreffen besonders bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes.

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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird somit eine Lösung oder Suspension von biologischen Teilchen, wie aufzukonzentrierenden oder zu reinigenden biologischen Teilchen, wie Konzentrate des Antigens HBs, mindestens einer Geschwindigkeitszentrifugierung in einem Gradienten im Inneren einer Zentrifuge unterworfen, deren Rotor mit einem Kern mit kontinuierlichem Durchsatz ausgerüstet ist, wobei gleichzeitig während des Zentrifugierens die Lösung oder Suspension der zu reinigenden Teilchen in einem geschlossenen Kreislauf geführt wird, in den die Zentrifuge eingefügt ist, insbesondere unter Verwendung einer Pumpe oder dergleichen (beispielsweise einer Schlauchpumpe oder peristaltischen Pumpe), die außerhalb der Zentrifuge in dem geschlossenen Kreislauf angeordnet ist.

Bei deit erfindungsgemäßen Verfahren wird somit der gleiche Teil der Suspension oder Lösung mehrfach durch die Zentrifuge geführt, wobei ein Teil der in dieser Suspension oder Lösung enthaltenen Teilchen bei jedem Durchgang von dem Dichtegradienten aufgenommen wird.

Die erfindungsgemäß verwendete Zentrifuge ist vorteilhaft eine Zentrifuge des Typs, wie sie von der Firma Electro-Nucleonics Inc., vertrieben wird, beispielsweise ein Baumuster der Bezeichnungen "K" oder "RK".

Die Eriindung sei im folgenden näher unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert. In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung, die ein Beispiel

der Ausbildung des erfindungsgemäß angewandten geschlossenen Kreislaufs wiedergibt; und

Fig. 2 eine Teildarstellung, die zur Erläuterung der

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Phänomene dient, die im Inneren eier Z sntrifuge ablaufen und die berücksichtigt v/erde ι müssen, insbesondere zur Ermittlung der riaximil anzuwendenden Zentrifugierungsdauer unter Berücksichtigung verschiedener Parameter der gesamten

Einrichtung, der Art der zu rein .gend2η Teilchen und des angewandten Gradienten.

In der Fig. 1 ist der Rotor einer Zentrifuge des Typs "Electro-Nucleonics K" oder "RK" schemati.sch dargestellt, der in an sich bekannter Weise einen Rotor 2 aufweist, der einen Raum definiert, in den die Gradientin und die durch Zentrifugieren zu behandelnden Dispersionen oder Lösungen entweder von oben über die Zuführung 4 od =n von unten über

15. die Zuführung 6 eingeführt werden können. Der Rotor ist in an sich bekannter Weise mit einem Kern 8 mit kontinuierlichem Durchsatz ausgerüstet. Die Zuführungen und Abführungen 4 und 6 (die in Abhängigkeit von der Zirkulationsrichtung der Suspension oder Lösung der zu reinigenden Teilchen, die keinen Einfluß auf das Wirkungsprinzip der Anordnung ausübt, umgekehrt angeordnet sein können) sind mit einem Kreislaufsystem verbunden, das sehenatisch mit der Bezugsziffer 1o dargestellt ist, in welches ein Behälter 12 eingeschaltet ist, der einen .Teil des Volumens der erfindungsgemäß zu behandelnden Lösung oder Suspension enthält neben den Mengen der Lösung oder Suspension, die in dem Raum, der zwischen den Innenwänden des Rotors und des Kerns 8 gebildet wird und in der Leitung 14 des geschlossenen Kreislaufssystems 1o. vorliegen. In der Leitung 1o ist eine Pumpe 16 an sich bekannter Art angeordnet, die dazu geeignet ist, die in Rede stehenden Lösungen oder Suspensionen im Kreislauf zu halten.

Die Zirkulation der Lösung oder Suspension, die gleichzeitig mit dem Zentrifugieren durchgeführt wird, besitzt den

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erheblichen Vorteil, daß es möglich ist, im Verlauf einer einzigen Zentrifugierungsmaßnahme eine wesentlich größere Menge der Suspension oder Lösung zu behandeln, als es möglich wäre, wenn man mit einer festen Beschickung (diskontinuierlich) arbeiten würde, insbesondere wenn man berücksichtigt, daß ein erheblicher Anteil des Innenvolumens des Rotors durch den Gradienten besetzt wird, der zuvor eingeführt worden ist (und der beispielsweise und vorzugsweise mindestens 9/1 ο des Innenvolumens im Fall der Reinigung des Antigens HBs ausmacht).

Es ist ersichtlich, daß sich ein Teil der in der zirkulierenden Flüssigkeit enthaltenen zu reinigenden Teilchen und andererseits der enthaltenen Verunreinigungen unter dem Einfluß des Zentrifugiervorgangs im Inneren des Rotors ansammelt und sich gegen und in dem im Inneren des Rotors ausgebildeten Gradienten bewegt, wobei die nicht zurückgehaltenen Teile, die anschließend aus dem Rotor über die Zuführungen oder Abführungen 4 oder 6 austreten, erneut in Zirkulation versetzt und schließlich über die Zuführung 6 oder 4 wieder in den Rotor eingespeist werden. Es ist in dieser Weise möglich, progressiv insbesondere die zu reinigenden Teilchen in das Innere des in dem Rotor ausgebj ldete-n Gradienten einzubringen durch Steigerung ihrer Lurchqangsfrequenz in dem Gravitationsfeld, was eine Folge ihrer kontinuierlichen Kreislaufführung ist. Je höher diese Fj-equenz ist, um so mehr neigen die Teilchen dazu, vor dem Gradienten eingefangen zu werden.

Die zirkulierende Flüssigkeit muß eine Gesamtdichte aufweisen, die niedriger ist als die des Gradienten und insbesondere auch niedriger als die minimale Dichte, die durch diesen Gradienten definiert wird, wobei der Zirkulation.'-.durchsatz derart goregelt werden muß, daß sich keine Turbulenzen im Inneren des Gradienten ausbilden.

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Aufgrund ihrer geringeren Dichte unterliegt diese Flüssigkeit einer laminaren kontinuierlichen Strömung an der Oberfläche des Kerns.

Das in der Fig. 2 dargestellte Schema dient dazu, die angewandten Phänomene zu verdeutlichen. Dieses Schema zeigt eine vergrößerte Schnittansicht des Freiraums in dem Rotor zwischen der inneren Oberfläche des Rotors 2 und der äußeren Oberfläche des Kerns 8. Hierbei wird von der Hypothese ausgegangen, daß das Molekulargewicht oder Teilchengewicht der Verunreinigungen in diesem Beispiel niedriger ist als das der zu reinigenden biologischen Teilchen.

Die laminare Strömung der zirkulierenden Flüssigkeit wird durch die in der Fig. 2 dargestellten Pfeile f wiedergegeben. Mit den Bezugsziffern 2o und 22 sind Banden dargestellt in den Positionen, die sie zu einem gegebenen Zeitpunkt annehmen, in denen sich nach und nach die zu reinigenden Teilchen einerseits und die Verunreinigungen mit niedrigerem Molekulargewicht andererseits ansammeln. Es ist zu erkennen, daß aufgrund der "progressiven Extraktion" der zu reinigenden Teilchen aus der zirkulierenden Flüssigkeit die Banden sich progressiv in Richtung auf die Innenwände 24 des Rotors bis zu der Position verschieben, die der isodichten Bande entspricht (in dem Maß, wie der Gradient diese umfaßt, was nicht notwendig ist). Die Bande, in der diese Teilchen sich ansammeln, neigt dazu, sich progressiv im Verlaufe der Extraktion zu vergrößern und in Richtung auf die innere Oberfläche des Rotors hin zuzuwandern. Das gleiche trifft auch auf die Bande der schließlich extrahierten Verunreinigungen zu, die aufgrund ihres niedrigeren Molekulargewichts weniger schnell wandern und sich in einer Bande ansammeln, die mehr in der Nähe der Oberfläche des Kerns vorliegt.

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Es ist günstig, die Behandlung zu dem Zeitpunkt zu unterbrechen, da die beiden Banden 2o und 22 sich zu vermischen beginnen, was zur Folge hat, daß die Fraktion der gereinigten Teilchen mit den zuvor abgetrennten Verunreinigungen mit niedrigerem Molekulargewicht wieder verunreinigt wird. Es ist daher erforderlich, vor diesem Zeitpunkt die Zirkulation der zu reinigenden Probe und das Zentrifugieren zu unterbrechen (indem die zirkulierende Probe insbesondere während der Periode des Verlangsamens der Rotorgeschwindigkeit durch eine Pufferlösung ersetzt wird) und in an sich bekannter Weise die an den biologischen Teilchen angereicherte Bande 2o zu gewinnen.

Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bildet man den Gradienten durch eine Lösung mit einer höheren Viskosität (mit einem höheren Viskositätsgrad) als die Lösung oder Suspension der zu reinigenden Teilchen, einerseits um die Wanderung der abzutrennenden Verunreinigungen zu den Wandungen des Rotors zu verlangsamen und andererseits um zu erreichen, daß die laminare Strömung der zirkulierenden Flüssigkeit den Gradienten in seiner Vollständigkeit möglichst wenig stört.

Zu diesem Zweck ist es von Vorteil, zur Ausbildung des Gradienten eine Lösung einer organischen Substanz, insbesondereeines Polyols, wie Saccharose oder Glycerin oder ganz allgemein irgend eines geeigneten Materials (das keine ausfäLlende Wirkung auf die zu reinigenden Teilchen ausübt} zu verwenden, während man das zu reinigende Material in eine Lösung niedrigerer Viskosität und geringerer Dichte, die gegebenenfalls mit einer geeigneten gepufferten Salzlösung verdünnt wird, einbringt. Wenn die zu reinigenden Teilchen aus dem Antigen HBs bestehen, kann man Plasmaextrakte oder Serumextrakte verwenden, die man vorzugsweise zuvor von einem ersten Teil der Verunreini-

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gungen befreit hat, die sie normalerweise in dem Serum begleiten, wie Immunkomplexe und Lipoproteine.

Die Viskositätsunterschiede der in Rede stehenden Flüssigkeiten sind somit der Ausgangspunkt einer "Viskositätsdiskontinuität" , die in der Fig. 2 durch die.Linie 28 symbolisiert wird und die zwischen der laminaren Strömung, die längs des Kerns 8 gleitet, und dem im Inneren des Rotors enthaltenen Dichtegradienten verläuft.

Diese Viskositätsdiskontinuität ermöglicht soirit das Gleiten der laminaren Ströme längs des Dichtegradienten,ohne daß eine merkliche Störung der Banden erfolgt, die die leichteren Fraktionen, insbesondere die Verunreinigungen, enthalten (Bande 22 des in der Fig. 2 dargestellten Schemas) .

Die Durchführung dieser Maßnahme ermöglicht eine schnelle Abtrennung der zu reinigenden Teilchen, selbst wenn diese 2ο ein besonders niedriges Teilchengewicht besitzen. Weiterhin erzielt man ein besonders vorteilhaftes Verhältnis von Menge des gereinigten Materials zu Zentrifugierungsdauer.

Man kann zusätzliche Reinigungen durchführen, indem man die gleiche Maßnahme auf die Fraktion erneut anwendet, die man der ersten Behandlung der oben beschriebenen Art . unterworfen hat. Diese Maßnahmen können so oft wie notwendig wiederholt werden, bis. man den gewünschten Reinheitsgrad erreicht hat. Mit Vorteil kann man dann, wenn ein erster Anreicherungsgrad oder Reinheitsgrad erreicht ist, auch die zuletzt aufgefangene Fraktion einer isopyknischen Fraktionierung unter an sich bekannten Bedingungen unterwerfen. Aufgrund des mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erreichten Reinheitsgrads ist es jedoch möglich, diese isopyknische Fraktionierung in Zentrifugen

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mit geringeren Abmessungen durchzuführen, wodurch sich weitere wirtschaftliche Vorteile ergeben.

VJie aus den obigen Ausführungen hervorgeht, kann die Reinigung eines Konzentrats des Antigens HBs unter besonders zufriedenstellenden Bedingungen erreicht werden, wenn man das Material zwei Geschwindigkeitsfraktionierungsstufen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren und einer abschließenden isopyknischen Fraktionierung unterzieht.

Die Erfindung ist mit besonderem Vorteil auf die Reinigung von sämtlichen biologischen Teilchen mit relativ niedrigem Teilchengewicht, insbesondere mit einem Teilchengewicht unterhalb 2ο Mio. anwendbar. Es ist in der Tat bekannt, daß das klassische kontinuierliche Geschwindigkeitszentrifugierverfahren mit offenem Kreislauf (bei kontinuierlicher Versorgung des Rotors mit der zu reinigenden Suspension oder Lösung und kontinuierlichem Abziehen der Abströme) praktisch nicht mehr anwendbar ist auf Teilchen oder aus Teilchen gebildeten Agglomeraten mit Molekulargewichten oder Teilchengewichten von weniger als 2o Mio.

Man kann zur Definition des Molekültyps der zu reinigendem Teilchen, auf die das erfindungsgemäße Verfahren sich mit besonderem Vorteil anwenden läßt, auch auf die Sedimentär onskonstante zurückgreifen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist mit besonderem Vorteil auf Moleküle oder Teilchen anwendbar, die Sedimentationskonstanten von weniger als 2oo Svedberg aufweisen.

Als niAt einschränkende Beispiele für Teilchen, auf die das erfindungsgemäße Verfahren angewandt werden kann, kann man neben dem Antigen HBs (Teilchengewicht im Bereich von 2 Mio; 4o Svedberg) die Picorna-Viren, den Poliomyelitis-Virus (etwa 15o Svedberg), den Virus des Maul-und-

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Klauenseuche-Fiebers (etwa 14o Svedberg), Virushüllen etc. nennen.

Wenngleich die folgenden Ausführungen keinerlei einschränkenden Charakter besitzen sollen, kann mai darauf hinweisen, daß das erfindungsgemäße Verfahren es ermöglicht, leicht und in einer einzigen Maßnahme ein Volumen einer Lösung oder einer Suspension zu behandeln, das zu dem Volumen des Gradienten in einem Verhältnis von o,5 bis 5 steht. Es versteht sich, daß der Fachmann dazu in der Lage ist, in an sich bekannter Weise den Durchsatz der zirkulierenden Flüssigkeit und die Parameter, deren Einfluß bekannt ist (Sedimentationskonstanten der zu reinigenden biologischen Teilchen einerseits und der Verunreinigungen andererseits, Verunreinigungsgrad etc.) einzustellen. Im besonderen Fall des Antigens.HBs liegt dieses Verhältnis von Volumen der zu behandelnden Probe zu Volumen des Gradienten mit Vorteil in einem Bereich von o,5 bis 1. Man kann auch bei einem Verhältnis arbeiten, das kleiner ist als die Untergrenze der oben angegebenen Bereiche. Hierbei besteht jedoch die Möglichkeit, daß die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens beeinträchtigt wird.

Im folgenden sei - ohne daß hierdurch die vorliegende Lehre eingeschränkt werden soll - eine allgemeine Arbeitsvorschrift zur Reinigung des Antigens HBs (Oberflächenantigen des Hepatitis-Virus B) im Hinblick auf seine Anwendung als Impfstoff erläutert. Es sei erinnert, daß dieses Antigen sich bei zwei Populationstypen findet, nämlich einerseits bei Individuen, die von der Virushepatitis des Typs B befallen sind und die somit pathologische Anzeichen der Krankheit aufweisen, und andererseits bei Individuen, die keine dieser klinischen Anzeichen zeigen und die im allgemeinen als "gesunde Träger" bezeichnet werden.

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Das erfindungsgeinäß eingesetzte Ausgangsmaterial ist das Plasma, das von chronischen oder nichtchronischen Hepatitisträgern stammt.

Man bestimmt die Antigenmenge durch Elektroimmunodiffusion, durch passive Hämagglutination oder durch radioimmunologische Methoden.

Das Antigen HBs wird erfindungsgemäß durch eine von zwei Geschwindigkeitszentrifugierungsstufen auf einem Dichtegradienten (beispielsweise einem Saccharosegradienten) unter den oben angegebenen Bedingungen gereinigt, wonach sich eine isopyknische Zentrifugierung in beispielsweise einem Cäsiumchloridgradienten anschließt. Das diesen Fraktionierungsbehandlungen unterworfene Antigen HBs kann entweder aus dem Plasma oder aus dem durch Defibrinieren des Plasmas gewonnenen Serum oder aus einem Serum, aus dem die Lipoproteine teilweise durch an sich bekannte Ausfällung in Gegenwart von beispielsweise Heparin und Manganchlorid entfernt worden sind, oder aus dem Serum stammen, aus dem die Immunkomplexe und ein Teil der Lipoproteine nach ihrer Ausfällung mit 5,5 %-igem (Gew./Vol. der erhaltenen Mischung aus Polyäthylenglykol und der behandelten Lösung oder Suspension) "Polyäthylenglykol 6ooo (PEG 6coo) " entfernt worden sind (das Polyäthylenglykol 6ooo ist für seine Wirksamkeit zur Abtrennung von Immunkomplexen und Lipoproteinen bekannt).

Als Ausgangsmaterial verwendet man vorzugsweise die überstehende Flüssigkeit des Serums, das einer Ausfällung mit Polyättylenglykol 6ooo unterworfen worden ist.

Die Geichwindigkeitszonenfraktionierung erfolgt bequemerweise in einer Zentrifuge, beispielsweise einer Zentrifuge der Firma "Electro-Nucleonics" des Typs "K" oder "RK".

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Der immobile Rotor, der mit einem Kern mit kontinuierlichem Durchsatz ausgerüstet ist, ist mit einer Salzlösung gefüllt, wonach man über die Unterseite des Rotors eine Menge der dichten Lösung, beispielsweise einer 4o %-igen Saccharoselösung, zuführt, die dazu ausreicht, 5o % des Anfangsvolumens der Salzlösung zu vertreiben. Man erhöht die Geschwindigkeit des Rotors in der Weise, daß sich durch die dynamische Reorientierung ein Saccharosegradient entwickelt. Typischerweise liegen die Grenzkonzentrationer, des selbstgebildeten Gradienten bei 4o % bzw. 7 % Saccharose.

Nachdem die gewünschte Geschwindigkeit des Rotors erreicht ist, wird das das Antigen HBs enthaltende Medium entweder von der Unterseite oder der Oberseite des Rotors mit Hilfe einer Pumpe zugeführt, wobei der durch das Einführen des Antigens vertriebene Abstrom in den Probenbehälter zurückgeführt wird. Es ist darauf hinzuweisen, daß erfindungsgemäß die Zuführung der Probe in geschlossenem Kreislauf erfolgt. .

Die Zentrifugierdauer hängt bei einer gegebenem Geschwindigkeit von dem Volumen der behandelten Probe ab. Man wählt bei einem Probenvolumen, das der Hälfte des Volumens des Gradienten entspricht, vorzugsweise eine Zentrifugierdauer

25 von 2 Stunden bei 35ooo min an.

Der Durchsatz der Zuführung der Probe in, geschlossenem Kreislauf beeinflußt die Ausbeute der Fraktionierung nur wenig. Typischerweise arbeitet man bei einem Durchsatz von 5 bis 1o 1 pro Stunde.

Nachdem die gewünschte Zentrifugierdauer erreicht ist, wird der Rotor unter dem Fachmann an sich bekannten Bedingungen, die eine gute Reorientierung des Gradienten aufrechterhalten, gestoppt. Nach dem Fraktionieren des Ro-

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torinhalts vereinigt man die an dem Antigen HBs angereicherten Fraktionen. Die weniger stark angereicherten Fraktionen sowie der Abstrom werden vereinigt und können nach dem Aufkonzentrieren, beispielsweise durch Ultrafiltration, erneut behandelt werden.

Das durch eine erste Geschwindigkeitszentrifugierung gereinigte und angereicherte Antigen kann erneut einer zweiten Geschwindigkeitszonenfraktionierung unter den oben beschriebenen Bedingungen unterworfen werden. -

Typischerweise besitzt das bei der ersten Geschwindigkeitszentrifugierung erhaltene Produkt einen Proteingehalt, der. um den Faktor 25 geringer ist als das Ausgangsmaterial. Wenn dieses Produkt einer zweiten Geschwindigkeitszentrifugierung unterzogen wird, enthält die an dem Antigen HBs angereicherte Fraktion des Gradienten eine Proteinmenge, die um den Faktor 12 geringer ist als die des anfänglich behandelten Antigens. In dieser Weise gelingt es, mit HiI-fe der beiden hintereinander durchgeführten Geschwindigkeitszentrifugiervorgänge ohne weiteres ein gereinigtes und an AgHBs angereichertes Präparat zu bilden, das um den Faktor 3oo weniger Proteine als das Ausgangsmaterial enthält.

Das in dieser Weise vorzugsweise durch zwei aufeinanderfolgence Ger.chwindigkeitszentrifugiervorgänge gereinigte Antigen wird dann einer isopyknischen Zentrifugierung in einem Zonenrotor unterworfen. Obwohl man identische Ergebnisse mit irgendwelchen beliebigen Salzen erzielen kann, verwendet man vorzugsweise Cäsiumchlorid, das dafür bekannt ist, diis Infektionsverhalten eventuell vorhandener viraler Teilchen zu erniedrigen.

Diese Maßnahme erfolgt bequemerweise in einem Rotor des

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Typs, der unter der Bezeichnung "MSE BXIV" oder "BXV" bekannt ist, wobei man eine Zentrifugierdauer und eine Geschwindigkeit anwendet, die dazu notwendig sind und dazu ausreichen, daß das Antigen HBs den Gleichgewichtszustand erreicht, d. h. in dem Dichtebereich von 1,17 bis 1,2o.

Das Antigenprodukt, das nacheinander zwei Geschwindigkeitszentrifugierungen und einer isopyknischen Zentrifugierung unter den oben angegebenen Bedingungen unterworfen worden ist, enthält im allgemeinen um den Faktor 6ooc weniger Proteine als das Ausgangsmaterial.

Es konnte gezeigt werden, daß das erfindungsgemäß gereinigte Antigen eine solche Reinheit und solche immunogene Eigenschaften (siehe Tabelle I) besitzt, daß es nach einer sterilisierenden Filtration und einer Behandlung mit Formaldehyd als Impfstoff gegen die Hepatitis B verwendet werden kann.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispieli

Man beschickt den Rotor einer Zentrifuge (Electro-Nucleonics K_) mit 3,4 1 eines Tris-NaCl-Puffers und dann führt man über die Unterseite des Rotors 1,7 1 einer. 4o %-igen Saccharoselösung ein, die ein gleich großes Volumen des Puffers verdrängt. Dann beschleunigt man den Rotor.auf 35ooo min und führt 2 1 einer Probe der überstehenden Flüssigkeit des Serums, das man zuvor mit 5,5 %-igem Polyäthylenglykol 6ooo behandelt hat, in geschlossenem Kreislauf bei einem Pumpendurchsatz von 1o l/Stunde ein. Das System wird während einer Dauer von 2 Stunden betrieben.

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Nach dem Stoppen des Rotors gewinnt man 1 1 des an AgHBs angereicherten Materials, das anschließend dialysiert und einer zweiten Geschwindigkeitszentrifugierung in einem Rotor ¹¹RK₃" unterworfen wird. Den Rotor ¹¹RK₃" füllt man mit 1,6 1 des Tris-NaCl-Puffers, wonach man über die Unterseite des Rotors 0,8 1 einer 4o %-igen Saccharoselösung einführt, die ein gleich großes Volumen des Puffers verdrängt. Dann wird der Rotor auf 35ooo min beschleunigt, wonach man eine Probe von 1 1 einführt und das Zentrifugieren in der Weise durchführt, wie es oben im Hinblick auf den Rotor "K " beschrieben worden ist.

Das bei der zweiten Geschwindigkeitszonenzentrifugierung gewonnene an AgHBs reiche Material, das in einer Menge von 500 ml anfällt, wird dialysiert, auf 80 ml eingeengt und einer isopyknischen Zentrifugierung in einem Cäsiumchlorid-Gradienten unterzogen. Man beschickt einen Rotor "BXIV", der mit einer Drehzahl vo:
dem folgenden Gradienten:

der mit einer Drehzahl von 25oo min betrieben wird, mit

1 - 15o ml einer Cäsiumchloridlösung d = 1,15

2 - 15o ml einer Cäsiumchloridlösung d = 1,228

3 - 15o ml einer Cäsiumchloridlösung d = 1,298

4 - 2oo ml einer Cäsiumchloridlösung d = 1,4o5. 25

Das durch die oben beschriebenen Geschwindigkeitszonenzentrifugierbehandlungen gewonnene, an AgHBs angereicherte Material wird über das Herz des Rotors zugeführt, wobei 80 ml der Cäsiumchloridlösung mit einer Dichte von 1,4o5 von der Peripherie verdrängt werden. Der Rotor wird auf 4oooo π in beschleunigt und w
ser Geschwindigkeit betrieben.

4oooo π in beschleunigt und während 2o Stunden bei die-

Nach dem Stoppen des Rotors gewinnt man 80 ml gereinigtes Antigen in dem Dichtebereich von 1,17 bis 1,2o g/cm .

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Beispiel 2

Man behandelt 4 1 der überstehenden Flüssigkeit des Serums, das man mit 5,5 %-igem Polyäthylenglykol 5ooo einer Ausfällung unterzogen hat, in zwei Chargen, >1. h- zweimal 2 in dem Rotor "K-", wie es in Beispiel 1 baschrieben ist.

Man gewinnt die an AgHBs angereicherten Fraktionen, die bei den zwei Geschwindigkeitszentrifugiervorgängen anfallen, d. h. 2 1 des Materials, die dann einer zweiten Geschwindigkeitszentrifugierung in dem Rotor "K " unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen unterworfen werden.

Das bei der zweiten Geschwindigkeitszentrifugierung gebildete an AgHBs reiche Material, das in einer Menge von 1 1 anfällt, wird dialysiert und auf 15o ml eingeengt.

Dann beschickt man einen Rotor (MSE BXV), der mit einer

Drehzahl voi

Gradienten:

Drehzahl von 2ooo min betrieben wird, mit dem folgenden

1 - 4oo ml einer Cäsiumchloridlösung d = 1,15

2 - 4oo ml einer Cäsiumchloridlösung d = 1,228 3 - 4oo ml einer Cäsiumchloridlösung d = 1,298

4 - 55o ml einer Cäsiumchloridlösung d = 1,4o5.

Man injiziert 15o ml des durch die oben beschriebenen Geschwindigkeitszentrifugiervorgänge gewonnenen gereinigten Antigens über das Herz des Rotors, wodurch 15o ml der Cäsiumchloridlösung mit einer Dichte von 1,4o5 an der Peripherie verdrängt werden. Die Zentrifugierdauer beträgt 28 Stunden bei 31ooo min .

Nach dem Stoppen des Rotors gewinnt man 15o ml des gerei-

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nigten Antigens in dem Dichtebereich 1,17 bis 1,2o g/cm .

Beispiel 3

Man behandelt 8 1 der überstehenden Flüssigkeit des Serums, das man zuvor einer Ausfällung mit 5,5 %-igen PoIyäthylenglykol 6oöo unterworfen hat, d. h. viermal 2 1 dieses Materials in dem Rotor "K ", wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.

Man gewinnt nach diesen vier Geschwindigkeitszentrifugiervorgängen die an AgHBs reichen Fraktionen, d.' h. 4 1 des Materials, die man dann in zwei Durchgängen einer zweiten Geschwindigkeitszentrifugierung in dem Rotor "K₂" unter-

15 wirft, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.

Das an AgHBs angereicherte Material, das nach den beiden Geschwindigkeitszentrifugiervorgängen erhalten worden ist, d. h. 2 1 des Materials, werden dialysiert, auf 25o ml eingeengt und dann einer isopyknischen Zentrifugierung in einem Cäsiumchloridgradienten in einem Zonenrotor des Typs MSE BXV unterworfen, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist.

25 Beispiel 4

Man behandelt 8 1 der überstehenden Flüssigkeit eines Serums, cas zuvor einer Ausfällung mit 5,5 %-igem PolyäthylengIyKoI 6ooo unterworfen worden ist, in einem ersten Zyklus von zwei aufeinanderfolgenden Geschwindigkeitszentrif ugierbehandlungen, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist. Weiterhin führt man eine erneute Behandlung der an dem Antigen HBs angereicherten Abströme und Fraktionen, die bei dem ersten Geschwindigkeitszentrifugiervorgang verworfen worden sind, durch. Dann engt man 18 1 des Ma-

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BAD ORlRlMAf

terials durch Ultrafiltration auf ein Volumen von 4 1 ein.

Dieses Konzentrat wird zwei aufeinanderfolgenden Geschwindigkeitszentrifugiervorgängen in dem Rotor "K₂" unterworfen, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist.

Das bei dem ersten Durchgang der Geschwindigkeitszentrifugierung gewonnene und bei dem zweiten Wiederholungsvorgang erhaltene Material, das an dem Antigen HBs angereichert ist, d. h. eine Materialmenge von 3 1, wird dann dialysiert und auf 25o ml eingeengt. Das Konzentrat wird in einem Cäsiumchloridgradienten zentrifugiert, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist.

15 Beispiel". 5

Die nachfolgende Tabelle II verdeutlicht das Ansteigen der Ausbeute pro Zeiteinheit, die sich durch die Steigerung des Volumens des behandelten Materials ergibt. 2o

Beispiel 6

Man behandelt 8 1 Plasma nach der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrensweise.
25

Beispiel7

Man behandelt 8 1 Serum nach der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrensweise.
3o

Beispiele .

Man behandelt 8 1 der überstehenden Flüssigkeit einer Serummischung, aus der man zuvor mit Heparin und Manganchlorid die Lipoproteine ausgefällt hat, nach der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrensweise.

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Beispiel 9

Man unterwirft 8 1 einer Plasitiamischung nach dem Defibrinieren und der sterilisierenden Filtration einer fraktionierten Ausfällung mit Polyäthylenglykol 6ooo. Nach einer ersten Ausfällung mit Polyäthylenglykol 6ooo in einer Konzentration von 5 % unterwirft man die überstehende Flüssigkeit einer zweiten Ausfällung mit Polyäthylenglykol
6ooo einer solchen Konzentration, daß das AgHBs ausgefällt wird. Man wählt vorzugsweise zu diesem Ziel ein Polyäthylenglykol 6ooo mit einer Konzentration von 16 % aus. Der an dem Antigen HBs angereicherte Zentrifugenrückstand wird in einem Tris-NaCl-Puffer mit einem Endvolumen von 2 1 aufgenommen, wonach diese Probe Geschwindigkeitszentrifugierungen und isopyknischen Zentrifugierungen unterworfen
wird, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.

Die hierin angegebenen Dichten oder Volumenmassen der zu
reinigenden Teilchen sind als Verhältnis zu den Werten in den Cäsiumchloridlösungen angegeben. Die Prozentsätze der Bestandteile einer Mischung beziehen sich auf das Gewicht bezogen auf das Volumen dieser Mischung.

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TABELLE I
Immunogene Wirkung auf Meerschweinchen

Proteinmenge pro Prozent der Meerschweinchen Antikörpergehalt ausge-Injektion ^g) mit einem positiven Antikör- drückt in RIA-Einheiten

pergehalt pro Meerschweinchen

12,6 1oo % 3oo

6,08 ' I00 % · 198

3,o4 I00 % 236

⁰ Zur Immunisierung verabreicht man Gruppen von jeweils 8 Meerschweinchen auf subcutanem ■ <*> ■

cn Wege zwei Injektionen des Antigenpräparats im Abstand von 15 Tagen. Die Tiere werden nj

-v. · . .LH

_o dann 15 Tage, nach der zweiten Injektion ausgeblutet. Der Gehalt an Antikörpern und An- _t *P ti-HBs wird durch Radio-Immun-Assay (RIA) bestimmt.

*-■ ■ : : i

CD iS> O

TABELLE II

ω ο ο ω σ>

Menge des	Dauer der	Dauer der 2.	Dauer der
behandelten	1 . Geschwin-	Geschwindig-	pyknischen
Plasmas (1)	digkeitszen-	keitszentri-	trifugieru
	trifugierung	fugierung	(h)
	(h)
2	2	2	2o
4	4	2	28
8	8	4	28

j Gesamtdauer für die Geschwindigkeitszentrifugierungen und die iscpyknische Zentrifugierung (h)

4o

Zentrifugierungsdauer in Std./l des behandelten Plasma

12

8,5

CD CD O

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Reinigung von Teilchen biologischen Ursprungs, insbesondere von Teilchen mit¹ Antigenwirkung, beispielsweise Teilchen, viraler oder subviraler Herkunft, bei dem eine Lösung oder Suspension der biologischen Teilchen mindestens einer Geschwindigkeitszentrifugierung in einem Gradienten im Inneren einer Zentrifuge, deren Rotor mit einem Kern mit kontinuierlichem Durchsatz ausgerüstet ist, unterworfen wird, dadurch gekenn ze i c h n e t , daß man während der Maßnahme des Zentrifugierens die Lösung oder Suspension der zu reinigenden Teilchen

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gleichzeitig in einem geschlossenen Kreislauf, in den die Zentrifuge eingefügt ist, zirkulieren läßt, insbesondere mit Hilfe einer Pumpe oder dergleichen, die außerhalb der Zentrifuge in dem geschlossenen Kreislauf angeordnet ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Gradient durch eine Lösung gebildet wird, die eine höhere Viskosität als die Lösung oder Suspension der zu reinigenden Teilchen aufweist.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Volumen der in einem Vorgang kontinuierlich behandelten Lösung oder Suspension und das Volumen des Gradienten in einem Verhältnis von o,5 bis 5 und vorzugsweise von o,5 bis 1 stehen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß die zu reinigenden biologischen Teilchen Teilchengewichte von weniger als 2o Mio. oder Sedimentationskonstanten von weniger als 2oo Svedberg aufweisen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die zu reinigenden oder aufzukonzentrierenden biologischen Teilchen aus dem Antigen HBs bestehen.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch g e k e η η zeichnet, daß man die bei der Geschwindigkeitszentrifugierung gebildete Fraktion mindestens einer zweiten Geschwindigkeitszonenfraktionierung unterwirft und eine noch weiter an dem Antigen HBs angereicherte Fraktion gewinnt.

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7. Verfahren nach den Ansprüchen 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet , daß man die an dem Antigen HBs angereicherte Fraktion, die bei der letzten Geschwindigkeitszonenfraktionierung erhalten worden ist, einer isopyknischen Fraktionierung in einem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten unterwirft und eine an dem Antigen HBs angereicherte Fraktion mit einer Dichte von etwa 1,17 bis etwa 1,2o g/cm gewinnt.

ο

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß man als Antigenpräparat Humanplasma, das durch Defibrinierung von Humanplasma gewonnene Serum oder ein Medium einsetzt, das die Elemente des Plasmas oder des Serums enthält, die von der überwiegenden Menge der Immunkomplexe und mindestens einem Teil der Lipoproteine, die das Antigen HBs in dem als Ausgangsmaterial eingesetzten Plasma oder Serum begleiten, befreit worden sind.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß man als Antigenpräparat die überstehende Flüssigkeit einsetzt■, die bei einer Fällungsbehandlung einer Serummischung mit 5,5 %-igen Polyäthylen-.glykol 6ooo (PEG 6ooo) anfällt.

25 .

1o. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß man als Antigenpräparat den Zentrifugenrückstand einsetzt, den man erhält, wenn man die überstehende Flüssigkeit nach einer ersten Fällungsbehandlung mit 5,5 %-igen Polyäthylenglykol 6ooo (PEG 6ooo)' einer weiteren Fällung mit Polyäthylenglykol 6ooo (PEG 6ooo) mit einer Konzentration von etwa 16 % unterzieht.

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