DE69920209T2

DE69920209T2 - Verfahren zur kontinuierlichen reinigung und konzentrierung von leukozyten aus dem blut

Info

Publication number: DE69920209T2
Application number: DE69920209T
Authority: DE
Inventors: Mats Jarekrans
Original assignee: VIRANATIVE AB
Current assignee: Swedish Orphan International AB
Priority date: 1998-03-26
Filing date: 1999-03-23
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2019-03-24
Also published as: HU228495B1; HK1035210A1; DE69920209D1; EP1078041B1; DK1078041T3; AU3447099A; WO1999049016A1; EP1078041A1; US6743624B1; ATE276356T1; ES2224631T3; HUP0103429A2; HUP0103429A3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren und eine neue Vorrichtung zur kontinuierlichen Reinigung und Konzentrierung von Leukozyten aus Blut, vorzugsweise Leukozytenschichten. Die Leukozyten werden bei der Herstellung von Interferon verwendet.
Stand der Technik
Interferone stellen eine endogen erzeugte immunologisch aktive Gruppe kleiner Proteine dar, die als eine natürliche Abwehr gegen Virusinfektionen wirken. Sie werden durch vertebrale Zellen synthetisiert und abgeschieden nach einer Virusinfektion. Interferone binden an die Plasma-Membran anderer Zellen in dem Organismus und induzieren einen antiviralen Zustand in ihnen durch Erhöhung der Produktion von drei Enzymen: einer Oligonukleotidsynthetase, einer Endonuklease und einer Kinase. Bei der modernen medizinischen Versorgung werden pharmazeutische Präparate, die Interferone enthalten, als ein Mittel gegen Infektionen, besonders virale Infektionen, doch auch ganz allgemein zur Stärkung des immunologischen Abwehrsystems des Patienten verabreicht.
Interferone werden derzeit auf drei unterschiedlichen Wegen hergestellt: rekombinant, Zellinienderivat und menschliches Leukozytenderivat. Die menschlichen Leukozytenderivate von Interferonprodukten können weiter in teilgereinigte und hochgereinigte Produkte unterteilt werden. Die vorliegende Anmeldung befaßt sich insbesondere mit hochgereinigtem menschlichem Leukozyteninterferon.
Die Herstellung von Interferon, das sich von menschlichen Leukozyten herleitet, wird in großem Maßstab, allgemein gemäß dem Verfahren durchgeführt, das von Kari Cantell et al., 1981 (Cantell, K., Hirvonen, S., Kauppinen, H-L., und Myllyla, G., „Herstellung von Interferon in menschlichen Leukozyten aus normalen Donoren mit der Verwendung von Sendai-Virus", veröffentlicht in Methods in Enzymology, Band 78, Seiten 29-38 und Cantell, K., Hirvonen, S. und Koistinen, V., „Teilreinigung von menschlichem Leukozyteninterferon in einem großen Maßstab", in Methods in Enzymology, Band 78, Seiten 499-505) beschrieben wurde. Das Verfahren nach Cantell kann folgendermaßen zusammengefaßt werden: gepoolte Leukozytenschichten von gesunden Donoren werden in kaltem 0, 83% NH₄Cl suspendiert und zentrifugiert. In dieser Stufe werden die Leukozyten gereinigt und von anderen Blutzellen getrennt. Etwa 30% der Leukozyten gehen verloren. Die Leukozyten werden gesammelt und in modifiziertem Eagle's mindest-essentiellem Medium (MEM) inkubiert. Danach wird die Suspension mit Zünd-Interferon gezündet und dann mit Sendai-Virus beimpft, um die Produktion von Interferon einzuleiten. Das geerntete Roh-Interferon wird dann gepoolt, und das Interferon wird ausgefällt und weiter gereinigt.
Bei der Herstellung mit Blut kann ein Anti-Koaguliermittel zu dem Blut zugesetzt werden, um eine Klumpenbildung zu verhindern und dabei das Blut in einem flüssigen Zustand zu halten. Wenn auf diesem Weg behandeltes Blut ungestört bleibt, setzen sich die Zellen allmählich ab, da sie dichter als das Plasma sind. Die roten Blutzellen gehen zum Boden. Die weißen Zellen und Blutplättchen bilden eine dünne weiße Schicht (Leukozytenschicht), die über den roten Zellen liegt, und das Plasma erscheint im oberen Teil des Behälters.
Die Leukozyten-Herstellungsstufen werden noch häufiger ansatzweise durchgeführt, wobei man manuell gehandhabte Laboratoriumskolben und geeignete Ausrüstung verwendet. Maßstabsvergrößerung wurde bis heute durch Zugabe von mehr Kolben und Zentrifugen und natürlich mehr Personal, das diese Kolben handhabt, erreicht. Die Produktion von Interferon nach Stand der Technik wird somit durch die Nachteile beeinträchtigt, die für intensive Laboratoriumsverfahren typisch sind: hohe Laborkosten, niedrige Reproduzierbarkeit, Veränderungen in der Ausbeute usw. Nichtsdestoweniger wurden die meisten der vorliegenden Verfahren darauf konzentriert, wie man am besten verfügbare Laboratoriumsausrüstung und -methodologie bekommt.
Die vorliegende Erfindung hat zum Ziel, diese Nachteile zu überwinden und höhere Ausbeuten, bessere Reproduzierbarkeit und niedrigere Arbeitskosten zu ermöglichen. Außerdem hat die Erfindung die Aufgabe, eine leichtere Maßstabvergrößerung und GMP-Nachprüfbarkeit des Verfahrens zu ermöglichen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bietet eine Lösung der oben erwähnten Probleme und Nachteile herkömmlicher Verfahren durch Einführung eines Verfahrens gemäß den beigefügten Ansprüchen. Das erfinderische Verfahren hat beispielsweise die Vorteile, geeignet für Automatisierung zu sein, und so die Reproduzierbarkeit zu verbessern, die erforderliche Arbeitskraft zu vermindern und die Arbeitskosten zu reduzieren. Weiterhin ist das erfinderische Verfahren leicht maßstäblich zu vergrößern und auf größere Produktionsvolumina angepaßt zu werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird nun in größeren Einzelheiten nachfolgend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben, in welchen
1 ein Blockdiagramm zeigt, welches die Prinzipien des Verfahrens nach der vorliegenden Erfindung erläutert, und
2 ein schematisches Beispiel eines automatisierten Leukozytenreinigungsverfahrens nach der vorliegenden Erfindung zeigt.
Beschreibung der Erfindung
Der vorliegende Erfinder zeigte überraschenderweise, daß ein kontinuierliches und automatisiertes Verfahren bei der Reinigung und Konzentrierung von Leukozyten verwendet werden kann. Gemäß der Erfindung bekommt man ein Verfahren zur kontinuierlichen Reinigung und Konzentrierung von Leukozyten aus Blut. Das Verfahren umfaßt die folgenden Stufen:

(a) Plasma wird von dem Blut durch Filtration getrennt, um eine filtrierte Leukozytenschicht-Fraktion zu bekommen,
(b) eine wäßrige Lösung, die in Bezug auf Plasma hypotonisch ist, wird zu der Leukozytenschicht-Fraktion aus der Stufe (a) zusetzt, um eine Lysierung von Erythrozyten zu bekommen, die in der Leukozytenschicht-Fraktion enthalten sind,
(c) die Leukozytenschicht-Fraktion und die wäßrige hypotonische Lösung aus der Stufe (b) werden in einer Mischeinrichtung vermengt,
(d) das Gemisch aus der Stufe (c) geht durch einen Rückhaltebehälter,
(e) das Gemisch aus der Stufe (d) wird durch eine Zentrifuge geführt, um die Leukozyten abzutrennen, und
(f) die abgetrennten Leukozyten aus der Stufe (e) werden sammelt.

Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung ist eine Vorrichtung zur kontinuierlichen Reinigung und Konzentrierung von Leukozyten aus Blut vorgesehen. Die Vorrichtung enthält die folgenden Einrichtungen:

(i) eine Membranfiltereinrichtung zur Abtrennung von Plasma von dem Blut durch Filtration, um eine filtrierte Leukozytenschicht-Fraktion zu erhalten,
(ii) eine statische Mischereinrichtung zum Vermengen der Leukozytenschicht-Fraktion und einer wäßrigen hypotonischen Lösung, um eine Lysierung von Erythrozyten zu erreichen, die in der Leukozytenschicht-Fraktion enthalten sind,
(iii) eine Rückhalte-Behältereinrichtung und
(iv) eine Zentrifugeneinrichtung, um die Leukozyten abzutrennen.

Unter Bezugnahme auf das Blockdiagramm in 1 ist die erste Stufe des vorliegenden Verfahrens eine Stufe der Abtrennung des Plasmas von dem Blut mit Hilfe einer Filtration. Gemäß bekannten Verfahren wird Plasma gewöhnlich von Blut durch Zentrifugieren abgetrennt, was zu einer Plasmafraktion führen kann, die mit lysierten Erythrozyten verunreinigt ist, so daß eine solche Plas mafraktion nicht weiter verwendet werden kann. Siehe zum Beispiel die US-4,294,824. Die Verwendung einer Zentrifugierung anstelle der Filtration führt zu höheren Investitionskosten, mehr Wartung und höherem Bedarf an Hygiene und Sauberhaltung. Bei der vorliegenden Erfindung wird das Plasma von dem Blut durch Filtration abgetrennt, und dann werden die Erythrozyten, die in der Leukozytenschicht enthalten sind, welche man bei der Trennung erhält, lysiert. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beginnt das Verfahren mit einer im Handel erhältlichen Leukozytenschicht-Fraktion, die man bei einer Blutbank erhält. Diese Leukozytenschicht-Fraktion wird von dem darin enthaltenen Plasma durch Filtration abgetrennt. Das erhaltene Plasma ist rein und kann weiter verwendet werden. Bei der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, daß durch Abtrennung von Plasma durch Filtration es möglich war, ein kontinuierliches Verfahren zu erhalten, das im Maßstab bis zu einem Wert für große technische Produktion vergrößert werden kann. Mit herkömmlicher Zentrifugentrennung in dieser Stufe war es nicht möglich, das Verfahren zu vergrößern. Die Zentrifugenstufe neigte bei Vergrößerung dazu, die Erythrozyten unverändert in der Leukozytenschicht zu halten, und das abgetrennte Plasma konnte weiter verwendet werden.
Die Filtrations-Parameter in dem Verfahren werden so abgeglichen, um einerseits eine dichte konzentrierte Leukozytenschicht-Fraktion, welche die Leukozyten enthält, und andererseits eine reine Plasmafraktion mit geringst möglicher Verfärbung zu produzieren. Die Plasmafraktion kann als Ausgangsmaterial in anderen Verfahren verwendet werden, da sie rein ist und keine Zusatzstoffe enthält. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird die Filtrationsstufe zur Trennung von Plasma und Leukozyten mit Hilfe eines Membranfilters durchgeführt. Geeignete Filter haben Porengrößen im Bereich von 0,1 bis 1,0 μm, vorzugsweise zwischen 0,4 und 0,6 μm. Nach einer anderen Ausführungsform wird die Filtration durch Hohlfasern vorgenommen, zweckmäßig für die Verwendung in dem erfinderischen Verfahren und als Teil der erfinderischen Apparatur oder dem erfinderischen System.
Um ein Lysieren der Erythrozyten in der Leukozytenschicht-Fraktion zu erhalten, wird diese Fraktion mit einer hypotonischen Lösung in Bezug auf Plasma, zum Beispiel mit einer wäßrigen Ammoniumchloridlösung (zum Beispiel 0,8 – 0% Gewicht/Volumen) oder vorzugsweise mit 0,8% Lösung vermischt, doch bei Verwendung niedrigerer Konzentrationen ist die Lysierungszeit zu senken. Der Strom von hypotonischer Lösung ist vorzugsweise zweimal der Strom der Leukozytenschicht-Fraktion. Um ein wirksames Vermischen zu gewährleisten, wird das Gemisch der Leukozytenschicht-Fraktion und beispielsweise die NH₄Cl-Lösung durch einen statischen Mischer geführt und weiter zu einem Rückhaltebehälter.
Der Rückhaltebehälter ist in einer Weise gestaltet, daß er das Strömungs-/Volumenverhältnis berücksichtigt, d.h. eine Rückhaltezeit von etwa 0,5 bis 10 Minuten erreicht ist. Je nach der Art der hypotonischen Lösung und der verwendeten Temperatur und dem, was die Lösung homogen in dem gesamten Behälter macht ist der Rückhaltebehälter ist so geschnitten, daß eine Verweilzeit von vor zugsweise 5 bis 10 Minuten erreicht wird, wenn Ammoniumchloridlösung verwendet wird, am meisten bevorzugt 10 Minuten; wenn kalte 0,8% Ammoniumchloridlösung verwendet wird.
Anschließen wird das Gemisch der Leukozytenschicht-Fraktion und der NH₄Cl-Lösung einer kontinuierlichen Zentrifuge zugeführt, um die Leukozyten abzutrennen. Die Zentrifuge kann eine kontinuierliche oder halb-kontinuierliche Zentrifuge von hygienischer Gestaltung sein und vorzugsweise eine Zentrifuge, die für eine Pflege ohne Entmantelung ausgebildet ist, eine Plege-am-Platz (SIP) und auch Sauber-am-Platz (CIP) sein. In dieser Stufe gibt es kein Problem, eine Zentrifuge für die Trennung zu verwenden, auch nicht in einem Verfahren in großem Maßstab, da die Erythrozyten durch Lysieren entfernt wurden.
Weitere Bearbeitung kann eine zweite Erythrozyten-Lysierstufe einschließen. Schließlich werden die gereinigten und konzentrierten Leukozyten, die auch als Zellsuspension bezeichnet werden, zu einem Inkubationsbehälter überführt, wo die Interferon-Produktion durch Zugabe von Sendai-Virus eingeleitet wird. Vorzugsweise wird die Interferon-Erzeugung in einem Bioreaktor durchgeführt. Die Vorteile mit einer Verwendung eines Bioreaktors als Inkubationsbehälter sind die Möglichkeit, bessere Kontrolle der Inkubationsstufe zu erzielen, leichtere Übertragung auf größeren Maßstab, erleichterte Pflege am Platz und Reinigung am Platz. Zusammen mit den anderen im Text oben beschriebenen Stufen gibt dies ein komplexeres Verfahren, das besser für industrielle Herstellung von Interferon geeignet ist.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform ist das bei der vorliegenden Erfindung verwendete Blut Menschenblut.
Beispiele
Beispiel 1
Kunststoffbeutel, welche die Leukozytenschicht-Fraktion enthalten, werden aus dem gewöhnlichen Produktionsansatz genommen und separat entleert. Die Hälfte der Menge dieser Fraktion wurde in einen getrennten Behälter (2, a) entleert und durch das experimentelle Verfahren nach 2 behandelt, und die andere Hälfte wurde gemäß gewöhnlichem Produktionsverfahren verarbeitet. In dem experimentellen Verfahren wird das Plasma durch Filtration durch Hohlfasern mit geeignetem Faserdurchmesser und geeigneter Porengröße (b) abgetrennt. Das filtrierte Plasma wird fraktioniert, und die Fraktionen mit der höchsten Absorptionsfähigkeit bei 280 nm (A₂₈₀) werden für spätere funktionelle Tests gespeichert (Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt). Die Plasmasammlung mit der höchsten Absorptionsfähigkeit wird durch Messen der Absorptionsfähigkeit bei 280 nm on-line mit Hilfe eines Spektrophotometers (c) ermittelt, und wenn die Absorptionsfähigkeit einen vorbestimmten Wert erreicht hat, wird das Ventil (d) automatisch in der Richtung zum Plasmabehälter (e) geöff net. Das Spektrophotometer (c) wird auch zur Messung der Menge an zerbrochenen Erythrozyten im Plasma benutzt. Wenn Erythrozyten beispielsweise durch mechanische Kräfte zerbrochen werden, werden sie lysiert, und das Plasma wird rötlich infolge von freiem Hämoglobin. Wenn das filtrierte Plasma aus irgendeinem Grund rötlich wird, wird es weggeworfen, indem man ein zweites Kriterium für das Spektrophotometer (c) bei etwa 410 nm einstellt. Wenn die Absorptionsfähigkeit einen vorbestimmten Wert bei 410 nm erreicht hat, wird das Ventil (d) automatisch in der Richtung Abfall (f) geöffnet.
Mechanische Kräfte können, wie oben erwähnt, die Erythrozyten zerbrechen. Ein Weg, um die Erythrozyten zu zerbrechen, ist jener, einen hohen Beschickungsdruck in die Hohlfasern hinein zu haben. Daher wird der Beschickungsdruck automatisch durch Messen des Beschickungsdrucks mit einem Drucksensor (g) reguliert und es erfolgt automatisches Einstellen der Pumpen (h)-Geschwindigkeit in Bezug auf das Beschickungsgemisch, um den Beschickungsdruck konstant bei etwa 0,4 bar zu halten.
Nach der Abtrennung von Plasma fließt die Leukozyten-Fraktion direkt in eine Mischkammer, einen statischen Mischer zusammen mit Ammoniumchlorid. Der Strom der Leukozyten-Fraktion wird mit einem ersten Strömungsmesser (i) gemessen. Der Fluß von 0,8 % (Gewicht/Volumen) Ammoniumchloridfraktion wird mit einem zweiten Strömungsmesser (j) gemessen. Da der Fluß der Leukozyten-Fraktion während der Filtrationsstufe sich ändern kann, wird der Fluß von 0,8% (Gewicht/Volumen) Ammoniumchlorid-Fraktion automatisch in Bezug auf den Fluß der Leukozyten-Fraktion reguliert. Der Ammoniumchloridstrom ist zweimal so groß wie der Leukozyten-Fraktionsstrom. Die gemischte Lösung wird dann in einen statischen Mischer (k) eingeführt, um ein vollständiges Vermischen der beiden Lösungen zu erhalten. Die gemischte Lösung fließt dann kontinuierlich in den Rückhaltebehälter (l). Die Verweilzeit in dem Rückhaltebehälter ist 10 Minuten, was die Zeit für Lysierung nach der gewöhnlichen Ansatzmethode ist. Das Lysat, welches aus dem Rückhaltebehälter kommt, fließt direkt in die halb-kontinuierliche Zentrifuge (m), die bei 3000 Umdrehungen/Minute arbeitet. Der Zentrifugeninhalt wurde dann intermittierend geerntet. Die gewonnenen Zellen wurden noch einmal lysiert und mit etwas Medium unter Bildung der Zellsuspension suspendiert.
Bestimmte Mengen der Zellsuspension werden dann zu 100 ml/Inkubationskolben oder zu 3 Liter-Laboratoriumsfermentatoren zugegeben, um Zellen aus der gewöhnlichen Produktion und die Zellen aus dem experimentellen Verfahren zu vergleichen. Das Interferon aus den Laboratoriumsfermentatoren und 100 ml/Kolben werden dann hinsichtlich des Interferon-Gehalts nach einer ELISA-Methode analysiert.
In dem gewöhnlichen Verfahren wird die Fraktionierung von Plasma durch Zentrifugieren der Leukozytenschicht-Fraktion erreicht. Das Zentrifugieren wird mit 1 Liter-Kunststoffflaschen ausgeführt. Die Lyse erfolgt in einem Behälter, wo die Leukozyten-Fraktion und die 0,8% (Gewicht/Volumen) Am moniumchloridlösung vermischt und zehn Minuten stehen gelassen werden. Die folgende Zentrifugierungsstufe wird auch in 1 Liter-Kunststoffflaschen durchgeführt. Tabelle 1: experimentelle Ausbeuten: Interferon
Tabelle 1
Die Tabelle zeigt das Ergebnis von Funktionstests von Zellen aus dem Verfahren nach der Erfindung im Vergleich mit Zellen von einem gewöhnlichen Ansatz. Exp.-Zellen bedeutet Zellen, die man aus dem Verfahren nach der Erfindung bekommt. Ref.-Zellen bedeutet Zellen aus einem gewöhnlichen Ansatz, der aus Leukozytenschichten aus dem gleichen Blutzentrum und vom gleichen Tag hergestellt wurden. Labferm.Exp bedeutet Zellen, die aus dem Verfahren nach der Erfindung erhalten wurden, doch wird der Test in größerem Maßstab (3 Liter) als Exp.-Zellen durchgeführt. Labferm.Ref bedeutet Zellen aus einem gewöhnlichen Ansatz, hergestellt aus Leukozytenschichten vom gleichen Blutzentrum und vom gleichen Tag nach der Erfindung, doch wird der Test in größerem Maßstab (3 Liter) durchgeführt als Ref.-Zellen. Zugesetzte Menge bedeutet, daß unterschiedliche Mengen an Zellsuspension zugegeben wurden, um Unterschiedliche Zellkonzentrationen für den Funktionstest zu bekommen. Zellkonz. ist die gemessene Zellkonzentration nach Zugabe der Zel lenmenge. ELISA ist das Ergebnis ausgedrückt in der Menge von Interferon-alpha, erzeugt mit den unterschiedlichen Zellen je Milliliter. Ausbeute/Zelle ist das Ergebnis, ausgedrückt in der Menge von Interferon-alpha, erzeugt mit den unterschiedlichen Zellen je Zelle. Ausbeute ist das durchschnittliche Ergebnis als Prozentsatz, ausgedrückt als produzierte Menge an Interferon-alpha je Milliliter, hergestellt mit den Ex.-Zellen/Labferm.Exp. im Vergleich mit den Ref.-Zellen/Labferm.Ref. Ausbeute/Zelle II ist das durchschnittliche Ergebnis als Prozentsatz, ausgedrückt als die Menge von produziertem Interferon-alpha je Zelle durch die Exp.-Zellen/Labferm.Exp. im Vergleich mit den Ref.-Zellen/Labferm.Ref. Die Gesamtausbeute ist die durchschnittliche Gesamtmenge an produziertem Interferon-alpha durch die Exp.-Zellen/Labferm.Ref., wenn die gleiche Menge an Zellen zugegeben wurde. Als Prozentsatz im Vergleich mit den Re.-Zellen/Labferm.Ref.
Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen im Durchschnitt eine bessere Gesamtausbeute mit den erfinderischen Exp.-Zellen im Vergleich mit Ref.-Zellen. Da die beiden Verfahren, Exp.-Zellen und Ref.-Zellen mit der gleichen Menge an Zellen begannen und das Volumen der am Ende konzentrierten Leukozytenzellsuspension das gleiche für beide Verfahren ist, ist es möglich, die Gewinnung von Zellen aus jedem Verfahren zu berechnen. Man bekommt mehr Zellen bei dem Experiment. Vergleicht man die Zellenkonzentration in den Versuchen 961121 und 961127, wenn die gleiche Menge an Zellsuspension zugesetzt wurde, ist es offensichtlich, daß das Verfahren nach der Erfindung zu einer stärkeren Zellgewinnung führt. Daher ist es auch möglich, mehr Interferon aus dem erfindungsgemäßen Verfahren zu bekommen, da die Ausbeute und die Ausbeute je Zelle etwa die gleichen sind.
Das aus der Filtrationsstufe gewonnene Plasma wird als eine Komponente in dem Inkubationsmedium (EMEM) erwendet. Bevor das Plasma zu dem Inkubationsmedium zugegeben wird, wird die Immunoglobulin-Fraktion durch Zugabe von 25% (Gewicht/Gewicht) Polyethylenglycol (Macrogol 6000)-Lösung ausgefällt. Die Polyethylenglycol-Lösung wird durch Auflösen von 430 g in einem Liter destillierten Wassers hergestellt.
In dem gewöhnlichen Verfahren muß eine extra Zentrifugierstufe (1600 Umdrehungen/Minute) mit der Plasmafraktion durchgeführt werden, um restliche Zellen zu entfernen.
Die Funktionstests für Plasma, abgetrennt durch Hohlfasern, wurden durch Zugabe dieses Plasmas anstelle des gewöhnlichen Plasmas zu dem Medium, wenn man Leukozyten in kleinem Maßstab, 100 ml Kolben, inkubierte. Plasma wurde zu dem Inkubationsmedium in gleichen Mengen in Bezug auf den Proteingehalt A₂₈₀-Wert, zugegeben. Das in diesen Kolben erzeugte Interferon wurde mit der ELISA-Methode analysiert und mit ELISA-Ergebnissen von Kolben verglichen, die mit gewöhnlichem Plasma arbeiteten. Tabelle 2. Experimentelle Ausbeuten: Plasma-Qualität
Tabelle 2
Die Tabelle zeigt das Ergebnis von Funktionstests von Plasma aus dem Verfahren nach der Erfindung im Vergleich mit Plasma aus einem gewöhnlichen Ansatz, M-5296.Ref, 961014, 961028, 961030, 961104 und 961202 sind die Daten, wenn das filtrierte Plasma hergestellt wurde. A 280 ist die Absorptionsfähigkeit bei 280 nm. Zugesetzte Menge bedeutet, daß unterschiedliche Plasmamengen zugegeben wurden, um den gleichen Proteingehalt in dem Inkubationsmedium zu erzielen. Zugesetzte Medien bedeutet die Menge an Inkubationsmedien, die verwendet wurde. Zell-Konzentration ist die gemessene Zell-Konzentration nach Zugabe von Zellen aus der gleichen Zellsuspension. ELISA ist das Ergebnis, ausgedrückt als die Menge von Interferon-alpha, produziert je Milliliter. Ausbeute/Zelle ist das Ergebnis, ausgedrückt als die Menge an Interferon-alpha je Zelle. Ausbeute ist das durchschnittliche Ergebnis als Prozentsatz, ausgedrückt als die Menge an Interferon-alpha, erzeugt je Milliliter durch die mit unterschiedlichem Plasma inkubierten Zellen, wobei unterschiedliches Plasma nach dem erfinderischen Verfahren hergestellt wurde, im Vergleich mit dem Plasma aus einem gewöhnlichen Ansatz M-5296. Ausbeute/Zelle II ist das durchschnittliche Ergebnis als Prozentsatz, ausgedrückt als die Menge an Interferon-alpha, die je Zelle durch die unter schiedlichen Plasmapräparate im Vergleich mit diesen Präparaten erzeugt wurde. Gesamtausbeute ist die durchschnittliche gesamte Menge an Interferon-alpha, produziert mit den Zellen, die mit unterschiedlichen Plasmapräparaten inkubiert wurden und wobei der Prozentsatz im Vergleich mit dem M-5296, Ref., inkubiert wurde.
Beispiel 2
Pflege des Systems nach dem erfinderischen Verfahren erfolgte stufenweise automatisch: Spülen des Leukozytenschichtbehälters (a) und Filters (b) mit PBS (mit Phosphat-gepufferter Salzlösung) aus dem Behälter (n), Umkehr der Fließrichtung von PBS in den Plasmafilter, Spülen des statischen Mischers (k), Rückhaltebehälters (1) und der Zentrifuge (m) mit NH₄Cl aus dem Behälter (o). Entwässerung des gesamten Systems.
Reinigen des gesamten Systems mit 0,5 M NaOH aus dem Behälter (p) für wenigstens eine halbe Stunde. Ablaufenlassen des gesamten Systems.
Das System wird dann mit Speicherlösung, 25% Ethanol (Volumen/Volumen) aus dem Behälter (q) gefüllt.
Vor der Verwendung läßt man das System ablaufen und spült dann mit destilliertem Wasser und dann sterilem PBS.
Nach Reinigung wurde das System an kritischen Punkten auseinandergenommen und visuell inspiziert, um zu sehen, daß keine Zellen, Zellfragmente usw. im Inneren des Systems zurückgehalten wurden. Proben wurden aus sterilem PBS oder sterilem Wasser vor jedem Versuch entnommen, wenn die Lösung das ganze System passiert hatte oder, wie in Tabelle 3 angegeben. Die Proben wurden für bakterielle Auszählung (nach European Pharmacopeia, 2. Auflage) analysiert, und Endotoxin wurde bestimmt (nach European Pharmacopeia, 2. Auflage). Tabelle 3. Experimentelle Ergebnisse: Pflegestatus
Keine Zellen, Zellfragmente usw. wurden in dem System gefunden. Tabelle 3 zeigt, daß das erfinderische System unter aseptischen Bedingungen laufen kann und zweckmäßig für CIP ist, das am Platz gereinigt wird.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf ihre bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, welche die derzeit beste, den Erfindern bekannte Arbeitsweise darstellt, sollte verstanden werden, daß verschiedene Änderungen und Abwandlungen, wie sie für einen Fachmann auf diesem Gebiet auf der Hand liegen, ohne Verlassen des Gedankens der Erfindung vorgenommen werden können, ohne den Schutzumfang der Erfindung zu verlassen, der in den anhängenden Ansprüchen definiert ist.

Claims

Verfahren zur kontinuierlichen Reinigung und Konzentrierung von Leukozyten aus Blut, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt, in denen man: (a) Plasma vom Blut durch Filtration trennt, um eine filtrierte Leukozytenschicht-Fraktion zu bekommen, (b) eine wäßrige Lösung, die in Bezug auf Plasma hypotonisch ist, zu der Leukozytenschicht-Fraktion aus der Stufe (a) zusetzt, um eine Lysierung von Erythrozyten zu bekommen, die in der Leukozytenschicht-Fraktion enthalten sind, (c) die Leukozytenschicht-Fraktion und die wäßrige hypotonische Lösung aus der Stufe (b) in einer Mischeinrichtung vermengt, (d) das Gemisch von der Stufe (c) durch einen Rückhaltebehälter führt, (e) das Gemisch aus der Stufe (d) durch eine Zentrifuge führt, um die Leukozyten abzutrennen, und (f) die abgetrennten Leukozyten aus der Stufe (e) sammelt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Leukozytenschicht-Fraktion, die man aus Blut erhalten hat, anstelle von Blut in der Stufe (a) verwendet und Plasma durch Filtration aus dieser Leukozytenschicht-Fraktion entfernt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in der Stufe (b) die wäßrige hypotonische Lösung Ammoniumchlorid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Filtration unter Führung des Blutes durch ein Membranfilter mit einer Porengröße im Intervall von 0,1 bis 1,0 μm durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Filtration durch Führen des Blutes durch ein Membranfilter mit einer Porengröße im Intervall von 0,4 bis 0,6 μm durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Rückhaltebehälter in einer Weise gestaltet ist, daß er eine Rückhaltezeit für das Gemisch in der Stufe (d) von 0,5 bis 10 Minuten bekommt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die in der Stufe (f) gesammelten Leukozyten einer zweiten Erythrozytolyse-Stufe unterzogen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die in der Stufe (f) gesammelten Leukozyten in einem Bioreaktor für Interferon-Erzeugung inkubiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das separierte Plasma in der Stufe (a) zurückgewonnen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren automatisch arbeitet und für Reinigen sauber am Platz (CIP) und Hygiene am Platz (SIP) angepaßt ist.
Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Blut menschliches Blut ist.