ES2224631T3 - Proceso para la purificacion continua y la concentracion de leucocitos a partir de sangre. - Google Patents
Proceso para la purificacion continua y la concentracion de leucocitos a partir de sangre.Info
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Abstract
Un procedimiento para la purificación y concentración continuas de leucocitos a partir de sangre, caracterizado porque dicho procedimiento comprende las etapas siguientes: (a) separar el plasma de la sangre por filtración para obtener una fracción de capa leucocítica filtrada; (b) añadir una disolución acuosa, que es hipotónica en relación con el plasma, a la fracción de la capa leucocítica de la etapa (a) para producir la lisis de los eritrocitos contenidos en la fracción de la capa leucocítica; (c) mezclar la fracción de la capa leucocítica y la disolución acuosa hipotónica de la etapa (b) en un aparato mezclador; (d) hacer pasar la mezcla de la etapa (c) a través de un recipiente de retención; (e) hacer pasar la mezcla de la etapa (d) a través de una centrifugadora para separar los leucocitos; (f) recoger los leucocitos separados de la etapa (e).
Description
Proceso para la purificación continua y la
concentración de leucocitos a partir de sangre.
La presente invención se refiere a nuevos
procedimientos y aparatos para la purificación continua y la
concentración de leucocitos a partir de sangre, preferiblemente a
partir de capas leucocíticas. Los leucocitos se utilizan en la
producción de interferón.
Los interferones constituyen un grupo de
proteínas pequeñas inmunológicamente activo y producido
endógenamente, que actúan como una defensa natural frente a las
infecciones víricas. Las células de los vertebrados las sintetizan y
las secretan después de una infección vírica. Los interferones se
unen a la membrana plasmática de otras células del organismo y
provocan un estado antivírico en ellas mediante el aumento de la
producción de tres enzimas: una
oligonucleótido-sintetasa, una endonucleasa y una
cinasa. En la medicina moderna, las composiciones farmacéuticas que
contienen interferones se administran como tratamiento contra las
infecciones, especialmente las infecciones víricas, pero también
para reforzar de manera generalizada los sistemas de defensa
inmunológica del paciente.
Actualmente, los interferones se fabrican a
través de tres vías diferentes: recombinante, extraídos de estirpes
celulares y extraídos de leucocitos humanos. Los productos de
interferones extraídos de leucocitos humanos se pueden dividir a su
vez en productos parcialmente purificados y en productos muy
purificados. La presente solicitud se refiere en concreto al
interferón de leucocito humano muy purificado.
La producción a gran escala de interferón
extraído a partir de leucocitos humanos generalmente se realiza de
acuerdo con el procedimiento esbozado por Kari Cantell et
al. 1981 (Cantell, K., Hirvonen, S., Kauppinen,
H-L. y Myllyla, G., Production of interferon in
human leukocytes from normal donors with the use of Sendai virus,
en Methods in Enzymology, vol 78, pp. 29-38,
y Cantell, K., Hirvonen, S. y Koistinen, V., Partial purification
of human leucocyte interferon on a large scale, en Methods in
Enzymology, vol 78, pp. 499-505). El
procedimiento de acuerdo con Cantell se puede resumir como sigue:
el conjunto de capas leucocíticas de donantes sanos se suspenden en
NH_{4}Cl frío al 0,83% y se centrifugan. En esta etapa, los
leucocitos se purifican y se separan de otras células sanguíneas. Se
pierden aproximadamente el 30% de los leucocitos. Los leucocitos se
recogen y se incuban en un medio mínimo esencial (MEM) de Eagle
modificado. Luego, la suspensión se sensibiliza con interferón
sensibilizador y a continuación se inocula con el virus Sendai para
iniciar la producción del interferón. A continuación se junta todo
el interferón bruto recogido y luego se precipita y se
purifica.
Cuando se produce con sangre, se puede añadir un
anticoagulante a la sangre para prevenir la formación de coágulos,
manteniendo de ese modo la sangre en un estado líquido. Cuando no
se toca la sangre tratada de esta manera, las células se asientan
de manera gradual al ser más densas que el plasma; los eritrocitos
van al fondo, los leucocitos y los trombocitos forman una capa
blanca delgada (capa leucocítica) que recubre los eritrocitos y el
plasma aparece en la parte superior del recipiente.
Las etapas de preparación de los leucocitos
todavía se llevan a cabo la mayoría de las veces por lotes,
utilizando matraces de laboratorio que se manejan manualmente y el
equipo adecuado. Hasta ahora, la ampliación se había conseguido
añadiendo más matraces y centrifugadoras y, naturalmente, más
personal para manejar estos matraces. De este modo, la producción
de interferón de acuerdo con el estado de la técnica está plagado
de inconvenientes, característicos de los procedimientos con
intensiva manipulación: altos costes de producción, baja
reproducibilidad, variaciones en el rendimiento, etc. Sin embargo,
la mayoría de los procedimientos actuales se han centrado en cómo
utilizar mejor el equipo de laboratorio y la metodología
disponibles.
La presente invención tiene por objeto solventar
estos problemas y permitir un mayor rendimiento, una mejor
reproducibilidad y unos costes de producción menores.
Adicionalmente, la invención tiene por objeto permitir una
ampliación más fácil y la verificabilidad con GMP del
procedimiento.
La presente invención ofrece una solución a los
problemas mencionados arriba y a las deficiencias de los
procedimientos convencionales mediante la introducción de un
procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas. El
procedimiento de la invención presenta, p. ej., las ventajas de ser
adecuado para la automatización, mejorando así la reproducibilidad,
reduciendo el aporte necesario del operario y los costes de
producción. Además, el procedimiento de la invención se puede
ampliar fácilmente y adaptar a volúmenes de producción mayores.
A continuación, la invención se describirá con
más detalle haciendo referencia a los dibujos acompañantes en los
que
La figura 1 muestra un diagrama de bloques que
ilustra los principios de un procedimiento de acuerdo con la
presente invención;
La figura 2 muestra un ejemplo esquemático de un
procedimiento automatizado de purificación de leucocitos de acuerdo
con la presente invención.
El presente inventor ha demostrado
sorprendentemente que se puede utilizar un procedimiento continuo y
automático en la purificación y en la concentración de leucocitos.
De acuerdo con la invención, se proporciona un procedimiento para la
purificación continua y la concentración de leucocitos de la sangre.
El procedimiento comprende las siguiente etapas:
(a) separar plasma de la sangre por filtración
para producir una fracción de capa leucocítica filtrada;
(b) añadir a la fracción de capa leucocítica de
la etapa (a) una disolución acuosa, que es hipotónica en relación
con el plasma, para lograr la lisis de los eritrocitos contenidos
en la fracción de capa leucocítica;
(c) mezclar la fracción de capa leucocítica y la
disolución acuosa hipotónica de la etapa (b) en un dispositivo
mezclador.
(d) hacer pasar la mezcla de la etapa (c) a
través de un recipiente de retención.
(e) hacer pasar la mezcla de la etapa (d) a
través de una centrifugadora para separar los leucocitos;
(f) recoger los leucocitos separados de la etapa
(e).
De acuerdo con un aspecto más de la invención, se
proporciona un aparato para la purificación continua y la
concentración de leucocitos a partir de sangre. El aparato incluye
los siguientes elementos:
(i) un elemento filtrador de membrana para
separar el plasma de la sangre por filtración para lograr una
fracción filtrada de capa leucocítica;
(ii) un elemento mezclador estático para mezclar
la fracción de capa leucocítica y una disolución acuosa hipotónica
para lograr la lisis de los eritrocitos contenidos en la fracción
de capa leucocítica;
(iii) un elemento de recipiente de retención;
y
(iv) un elemento centrifugador para separar los
leucocitos.
En relación al diagrama de bloques en la figura
1, la primera etapa en el procedimiento presente es una etapa de
separación del plasma a partir de sangre por medio de filtración.
De acuerdo con los procedimientos conocidos, el plasma se separa
normalmente de la sangre por centrifugación, lo que puede dar lugar
a una fracción de plasma contaminada con eritrocitos lisados,
fracción de plasma que no se puede usar más. Véase, p. ej., la
patente de los EE.UU número 4.294.824. La utilización de la
centrifugación en lugar de la filtración implica una mayor
inversión, más servicio y mayores demandas de higienización y de
limpieza. En la presente invención, el plasma se separa de la sangre
por filtración y luego los eritrocitos contenidos en la capa
leucocítica obtenida por la separación se lisan. De acuerdo con una
realización preferida de la invención, el procedimiento comienza
con una fracción de capa leucocítica disponible comercialmente que
se obtiene de un banco de sangre. Esta fracción de capa leucocítica
se separa del plasma contenido en ella por filtración. El plasma
obtenido es puro y se puede utilizar posteriormente. En la presente
invención, sorprendentemente se encontró que al separar el plasma
por filtración se podía obtener un procedimiento continuo que se
podía escalar para una producción a gran escala. Con la separación
por centrifugación convencional en esta etapa no se pudo escalar el
procedimiento. Cuando se amplió, la etapa de centrifugación tendía
a aplastar los eritrocitos por lo que se contaminaba la capa
leucocítica y el plasma. En la filtración a gran escala, los
eritrocitos permanecieron inalterados en la capa leucocítica y el
plasma separado se pudo usar posteriormente.
Los parámetros de filtración en el procedimiento
se equilibran para producir, por una parte, una fracción de capa
leucocítica densa y concentrada que contiene los leucocitos y, por
otra parte, una fracción de plasma puro, con tan poca decoloración
como es posible. La fracción de plasma se puede utilizar como
sustancia de partida en otros procedimientos ya que es puro y no
contiene aditivos. De acuerdo con una realización de la invención,
la etapa de filtración para separar el plasma y los leucocitos se
realiza con la ayuda de un filtro de membrana. Los filtros
adecuados presentan tamaños de poro dentro del intervalo de 0,1 a
1,0 \mum, preferiblemente dentro del intervalo de 0,4 a 0,6
\mum. De acuerdo con otra realización, la filtración se realiza a
través de fibras huecas, adecuadas para utilizarse en el
procedimiento de la invención y como una parte del aparato o
sistema de la invención.
Para lograr la lisis de los eritrocitos en la
fracción de capa leucocítica, esta fracción se mezcla con una
disolución hipotónica en relación con el plasma, p. ej., disolución
acuosa de cloruro de amonio (p. ej., del 0,8 al 0% p/v) o,
preferiblemente, al 0,8%, pero cuando se usan concentraciones más
bajas, el tiempo de lisis se tiene que reducir. El flujo de la
disolución hipotónica es preferiblemente el doble del flujo de la
fracción de la capa leucocítica. Para asegurar una mezcla eficaz,
la mezcla de la fracción de capa leucocítica y, p. ej., la
disolución de NH_{4}Cl se hacen pasar a través de un mezclador
estático y luego a un recipiente de retención. El recipiente de
retención se diseña de manera que, teniendo en cuenta la relación
entre el flujo y el volumen, se produzca un tiempo de retención de
entre 0,5 a 10 minutos, según la clase de disolución hipotónica y
de la temperatura utilizadas, y que la disolución se convierta en
homogénea en todo el recipiente. El recipiente de retención se
diseña de manera que, cuando se utilice una disolución de amonio de
cloruro, se produzca un tiempo de retención preferiblemente de 5 a
10 minutos, más preferiblemente de 10 minutos, si se utiliza una
disolución de cloruro de amonio frío al 0,8%.
Ulteriormente, la mezcla de la fracción de la
capa leucocítica y de la disolución de NH_{4}Cl se suministra a
la centrifugadora continua para separar los leucocitos. La
centrifugadora puede ser una centrifugadora continua o
semi-continua de diseño higiénico y,
preferiblemente, una centrifugadora adaptada para la higienización
sin necesidad de desmontarla, higienización in situ (SIP) y
también limpieza in situ (CIP). En esta etapa no hay ningún
problema por utilizar una centrifugadora para la separación, en un
procedimiento a gran escala, ya que los eritrocitos se han retirado
mediante lisis.
Un procesamiento posterior puede incluir una
segunda etapa de lisis de eritrocitos. Por último, los leucocitos
purificados y concentrados, también denominado "suspensión
celular", se transfieren a un recipiente de incubación, donde la
producción del interferón se induce por la adición del virus Sendai.
Preferiblemente, la producción del interferón se lleva a cabo en un
biorreactor. Las ventajas de usar un biorreactor como el recipiente
de incubación es la posibilidad de lograr un mejor control de la
etapa de incubación, una escalabilidad más fácil y una
higienización in situ y una limpieza in situ
facilitadas. Junto con las otras etapas descritas anteriormente en
el texto, ésta constituirá un procedimiento más complejo y mejor
adaptado a la producción industrial de interferón.
De acuerdo con una realización preferida, la
sangre que se utiliza en la presente invención es sangre
humana.
Las bolsas de plástico que contienen la fracción
de capa leucocítica se sacan del lote de producción habitual y se
vacían por separado. La mitad de la cantidad de esta fracción se
vació en un recipiente separado (figura 2, a) y se procesó por
medio del procedimiento experimental de acuerdo con la figura 2 y la
otra mitad de acuerdo con el procedimiento de producción habitual.
En el procedimiento experimental, el plasma se separa por
filtración a través de fibras huecas con el diámetro de fibra y el
tamaño de poro adecuados (b). Se fracciona el plasma filtrado y las
fracciones con la mayor absorbencia a 280 nm (A_{280}) se
almacenan para pruebas funcionales posteriores (resultados
mostrados en la tabla 2). La recogida de plasma con la mayor
absorbencia se lleva a cabo midiendo la absorbencia a 280 nm en
línea por medio de un espectrofotómetro (c) y cuando la absorbencia
ha alcanzado un valor predeterminado, la válvula (d) se abre
automáticamente en dirección al recipiente del plasma (e). El
espectrofotómetro (c) también se utiliza para medir la cantidad de
eritrocitos destruidos en el plasma. Cuando los eritrocitos se
destruyen mediante, p. ej., fuerzas mecánicas, se lisan y el plasma
toma un color rojizo debido a la hemoglobina libre. Si por alguna
razón el plasma filtrado toma un color rojizo, se desecha al poner
un segundo criterio para el espectrofotómetro (c) a unos 410 nm.
Cuando la absorbencia ha alcanzado un valor predeterminado a 410
nm, la válvula (d) se abre automáticamente en dirección al material
de desecho.
Las fuerzas mecánicas pueden, como se mencionó
anteriormente, destruir los eritrocitos. Un modo de destruir los
eritrocitos es mantener una presión alta de alimentación en las
fibras huecas. Por lo tanto, la presión de alimentación se regula
automáticamente midiendo la presión de alimentación con un sensor de
presión (g) y ajustando automáticamente la velocidad de la bomba
(h) con respecto a la presión de alimentación para mantener la
presión de alimentación constante a unos 0,4 bares.
Después de separar el plasma, la fracción
leucocítica fluye directamente a la cámara de mezcla, un mezclador
estático, junto con cloruro de amonio. El flujo de la fracción
leucocítica se mide con un primer medidor de flujos (i). El flujo
de la fracción de cloruro de amonio al 0,8% (p/v) se mide con un
segundo medidor de flujo (j). Debido a que el flujo de la fracción
leucocítica puede cambiar durante la etapa de filtración, el flujo
de la fracción de cloruro de amonio al 0,8% (p/v) se regula
automáticamente con respecto al flujo de la fracción leucocítica.
El flujo de cloruro de amonio es el doble del flujo de la fracción
leucocítica. A continuación, la disolución parcialmente mezclada se
introduce en el mezclador estático (k) para obtener una mezcla
completa de las dos disoluciones. La disolución mezclada fluye
entonces continuamente al recipiente de retención (l). El tiempo de
retención en el recipiente de retención es de diez minutos, que es
el tiempo para la lisis de acuerdo con el registro habitual de los
lotes. El lisado, que emerge del recipiente de retención, fluye
directamente a la centrifugadora semi-continua (m),
que se hizo funcionar a 3000 rpm. A continuación, la centrifugadora
se recolecta intermitentemente. Las células recolectadas se lisan
una vez más y se suspenden con algo de medio para formar la
suspensión celular.
Ciertas cantidades de la suspensión celular se
añaden a los matraces de incubación de 100 ml o a los fermentadores
de laboratorio de 3 litros para comparar las células del
procedimiento de producción habitual y las células del
procedimiento experimental. El interferón de los fermentadores de
laboratorio y de los matraces de 100 ml se analiza a continuación
mediante un método de ELISA.
En el procedimiento habitual, el fraccionamiento
del plasma se consigue centrifugando la fracción de capa
leucocítica. La centrifugación se lleva a cabo en botellas de
plástico de un litro. La lisis se produce en un recipiente, donde
se mezclan la fracción leucocítica y la disolución de cloruro de
amonio al 0,8% (p/v) y se dejan reposar durante 10 minutos. La
siguiente etapa de centrifugación también se lleva a cabo en
botellas de plástico de un litro.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla
1
La tabla muestra el resultado de los ensayos
funcionales de las células del procedimiento de acuerdo con la
invención comparadas con las células de un lote habitual.
"Céls-exp." se refiere a las células obtenidas
por el procedimiento de acuerdo con la invención.
"Céls-ref." se refiere a las células de un lote
habitual preparado a partir de capas leucocíticas del mismo centro
de sangre y en el mismo día. "FermLabExp" se refiere a las
células obtenidas por el procedimiento de acuerdo con la invención
pero el ensayo se realiza a mayor escala (3 litros) que las
Céls-exp. "FermLabRef" se refiere a las células
de un lote habitual preparadas a partir de capas leucocíticas del
mismo centro de sangre y del mismo día pero el ensayo se realiza a
mayor escala (3 litros) que las Céls-ref.
"Cantid. añad." se refiere a que se han añadido diferentes
cantidades de suspensión celular para producir concentraciones de
células diferentes para el ensayo funcional. "Conc. células"
es la concentración de células medida después de añadir la cantidad
de células. "ELISA" es el resultado que expresa la cantidad de
interferón-alfa producido por las diferentes
células por mililitro. "Rendimiento/célula" es el resultado que
expresa la cantidad de interferón-alfa producido
por las diferentes células por célula. "Rendim." es el
resultado medio en porcentaje que expresa la cantidad de
interferón-alfa producido por mililitro por
Céls-exp./FermLabExp en comparación con
Céls-ref./FermLabRef. "Rendim./cél." es el
resultado medio en porcentaje que expresa la cantidad de
interferón-alfa producido por célula por las
Céls-exp./FermLabExp. en comparación con las
Céls-ref./FermLabRef. "Rendimiento total" es
la cantidad media total de interferón-alfa producido
por las Céls-exp./FermLabExp., si se ha añadido la
misma cantidad de células, en porcentaje, en comparación con las
Céls-ref./FermLabRef.
Los resultados de la tabla 1 muestran de media un
mejor rendimiento total con las Céls-exp. de la
invención en comparación con las Céls-ref. Ya que
los dos procedimientos, Céls-exp. y
Céls-ref., comenzaron con la misma cantidad de
células y el volumen de la suspensión celular final de leucocitos
concentrados es la misma en ambos procedimientos, es posible
calcular la recuperación de células de cada procedimiento. Al
comparar la concentración celular en las pruebas realizadas 961121
y 961127 cuando se añade la misma cantidad de suspensión celular,
resulta obvio que el procedimiento de la invención da lugar a una
mayor recuperación de células. Por lo tanto, también es posible
producir más interferón del procedimiento de la invención ya que el
rendimiento y el rendimiento por célula son casi el mismo.
El plasma recuperado de la etapa de filtración se
utiliza como un componente en el medio de incubación (EMEM). Antes
de añadir el plasma al medio de incubación, la fracción de
inmunoglobulina se precipita mediante la adición de una disolución
de polietilenglicol (Macrogol 6000) al 25% (p/p). La disolución de
polietilenglicol se prepara disolviendo 430 g en un litro de agua
destilada.
En el procedimiento habitual, se ha llevado a
cabo una etapa extra de centrifugación (1600 rpm) de la fracción
de plasma para retirar las células restantes.
Los ensayos funcionales para el plasma separado
mediante fibras huecas se llevaron a cabo añadiendo este plasma en
lugar del plasma habitual al medio cuando se incuban los
leucocitos en matraces de 100 ml a pequeña escala. El plasma se
añadió al medio de incubación en cantidades iguales en relación con
el contenido proteico, valor de A_{280}. El interferón producido
en estos matraces se analizó mediante el método de ELISA y se
comparó con los resultados del ELISA de los matraces que funcionan
con plasma habitual.
Tabla
2
La tabla 2 muestra el resultado de los ensayos
funcionales de plasmas del procedimiento de acuerdo con la
invención en comparación con el plasma de un lote habitual, ref.
M-5296. Las cifras 961014, 961028, 961030, 961104 y
961202 son las fechas en las que se preparó el plasma filtrado.
"A_{280}" es la absorbencia a 280 nm. "Cantidad añad."
se refiere a que se han añadido cantidades diferentes de plasma para
producir el mismo contenido proteico en el medio de incubación.
"Medio añad." se refiere a la cantidad de medio de incubación
utilizado. "Conc.células" es la concentración celular medida
después de añadir células de la misma suspensión celular.
"ELISA" es el resultado que expresa la cantidad de
interferón-alfa producido por mililitro.
"Rendim./cél." es el resultado que expresa la cantidad de
interferón-alfa por célula. "Rendimiento" es el
resultado medio en porcentaje que expresa la cantidad de
interferón-alfa producido por mililitro por las
células incubadas con plasma diferente preparado de acuerdo con el
procedimiento de la invención en comparación con el plasma de un
lote habitual, M-5296. "Rendimiento/cél." es el
resultado medio en porcentaje que expresa la cantidad de
interferón-alfa producido por célula por las
preparaciones de plasma diferentes en comparación con la ref.
M-5296. "Rendimiento" es la cantidad media
total de interferón-alfa producido por las células
incubadas con preparaciones de plasma diferentes, en porcentaje, en
comparación con la
ref. M-5296.
ref. M-5296.
La higienización del sistema del procedimiento de
la invención se llevó a cabo automáticamente por etapas:
Hacer pasar tampón fosfato salino (PBS) del
recipiente (n) por el recipiente de la capa leucocítica (a) y los
filtros (b).
Invertir la dirección de flujo del PBS en el
filtro del plasma.
Hacer pasar NH_{4}Cl del recipiente (o) por el
mezclador estático (k), el recipiente de retención (l) y la
centrifugadora (m).
Drenaje de todo el sistema.
Limpiar todo el sistema con 0,5 M de NaOH del
recipiente (p) durante al menos media hora.
Drenaje de todo el sistema.
A continuación, el sistema se llena con una
disolución de almacenamiento de etanol al 25% (v/v) desde el
recipiente (q).
Antes de utilizarlo, el sistema se drena y se
limpia con agua destilada y PBS estéril.
Después de la higienización, se desmontó el
sistema en los puntos críticos y se inspeccionó visualmente para
comprobar que no hubiera células, fragmentos de células, etc.
retenidos dentro del sistema. Se sacaron muestras en PBS estéril o
en agua estéril antes de cada ensayo cuando la disolución había
pasado todo el sistema o tal como se indica en la tabla 3. Las
muestras se analizaron para el recuento de bacterias (de acuerdo
con la Farmacopea Europea, 2ª edición) y la determinación de
endotoxinas (de acuerdo con la Farmacopea Europea, 2ª edición).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
No se encontraron células, fragmentos de células,
etc., dentro del sistema. La tabla 3 muestra que el sistema de la
invención puede funcionar en condiciones asépticas y es adecuado
para la CIP, esto es, se limpia in situ.
Aunque la invención se ha descrito en referencia
a sus realizaciones preferidas, que constituyen el mejor modo
conocido hasta ahora por los inventores, debe entenderse que pueden
realizarse varios cambios y modificaciones, como resultaría obvio
para cualquier experto en la presente técnica, sin apartarse del
alcance de la invención que se expone en las reivindicaciones
adjuntas en la presente invención.
Claims (11)
1. Un procedimiento para la purificación y
concentración continuas de leucocitos a partir de sangre,
caracterizado porque dicho procedimiento comprende las
etapas siguientes:
(a) separar el plasma de la sangre por filtración
para obtener una fracción de capa leucocítica filtrada;
(b) añadir una disolución acuosa, que es
hipotónica en relación con el plasma, a la fracción de la capa
leucocítica de la etapa (a) para producir la lisis de los
eritrocitos contenidos en la fracción de la capa leucocítica;
(c) mezclar la fracción de la capa leucocítica y
la disolución acuosa hipotónica de la etapa (b) en un aparato
mezclador;
(d) hacer pasar la mezcla de la etapa (c) a
través de un recipiente de retención;
(e) hacer pasar la mezcla de la etapa (d) a
través de una centrifugadora para separar los leucocitos;
(f) recoger los leucocitos separados de la etapa
(e).
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque se utiliza una
fracción de capa leucocítica, obtenida de la sangre, en lugar de
sangre en la etapa (a) y se retira el plasma de esta fracción de
capa leucocítica por filtración.
3. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque en la etapa (b)
la disolución acuosa hipotónica es cloruro de amonio.
4. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la
filtración se realiza haciendo pasar la sangre a través de un
filtro de membrana con un tamaño de poro en el intervalo de 0,1
\mum a 1,0 \mum.
5. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, caracterizado porque la filtración se
realiza haciendo pasar la sangre a través de un filtro de membrana
con un tamaño de poro en el intervalo de 0,4 \mum a 0,6
\mum.
6. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
la reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el
recipiente de retención se diseña de manera que da lugar a un
tiempo de retención para la mezcla en la etapa (d) de 0,5 a 10
minutos.
7. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque los
leucocitos recogidos en la etapa (f) se someten a una segunda etapa
de lisis de eritrocitos.
8. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque los
leucocitos recogidos en la etapa (f) se incuban en un biorreactor
para la producción de interferón.
9. Un procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el plasma
separado en la etapa (a) se recupera.
10. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el
procedimiento funciona automáticamente y está adaptado para la
limpieza in situ (CIP) y la higienización in situ
(SIP).
11. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la
sangre es sangre humana.
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