JPH02501890A - 血球の分離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血球の分離 重力における沈降による白血球および赤血球の分離に関する。

より詳しくは、本発明は、赤血球を完全な状態にしておきながら、もとの白血球 の約８０％を回収する方法に関する。その白血球はインターフェロンの生産にお いて利用できる。

発明の背景 ヒドロキシエチルデンプンは日頃沈降剤として利用されている［：Ｌｉｏｎｅｔ ｔｉ、米国特許第４．００４．９７５号；　Ｐｅ５ｔｋａ、米国特許！　４，１ １１．１９９号；　Ｃｈａｄｈａ、米国特許第４．４８５．０３８号：およびＶ ａｎ　Ｏｓｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｃｏｍｍｏｎ、、１０（６）、Ｐｐ、５４９ −５５（１９８１））。

ヒドロキシエチルデンプン（“ＨＥＳ”）での処理は、もとのプールの約６８％ の白血球（“ＷＢＣ”）の回収に終わる。塩化アンモニウム溶解は、９０％の白 血球をもたらすが、赤血球（“ＲＢＣ層）の無駄な破壊のために望ましくない。

沈降剤として使用されている他の試薬は、デキストラン（グルコース重合体）、 フィコール（ショ糖重合体）　、ＰＶＰ１コロハ種子抽出物、および植物性血球 凝集素である［Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ、米国特許第３．７０９．７９１号； 　Ｃｈａｎｙ、米国特許第３．５６０．６１１号；　Ｆｅｒｒａｎｔｅ、米国特 許第４．２５５．２５６号；Ｇｕｉｒｇｉｓ、米国特許第４．１５２．２０８号 ；　Ｆｕｒｕｔａ、米国特許第４、４０９．１０６号；　Ｇｏｏｒｅ、米国特許 第３．８００．０３５号；　５ｈｅｐｈｅｒｄ。

米国特許第３．５９４．２７６号；　Ｋｉｒｋｈａｍ、米国特許第３．６３５． ７９８号；Ｗｉｄｍａｒｋ、米国特許第３．７００．５５５号〕。

１（ａｎｔｅｒ、米国特許第４．４８７．７００号は、赤血球および貧食された 白血球からリンパ球を分離するための中間密度の揺変性遮断材に関する。Ｍｅｙ ｓｔ、米国特許第４，２８３，２８９号は、白血球フィルターに関する。大部分 の白血球を完全な状態にしたままでＲＢＣを溶解するためのＮＨ，Ｃｊ２の利用 もまた知られている。

ヒドロキシアルキルセルロース、特にヒドロキシエチルセルロースは、医薬およ び他の組成物において増粘剤および安定剤として使われている。しかしながら、 それらが赤血球から白血球を分離するための沈降剤として使用されたことはまだ ない。

発明の要約 この発明は、血球の分離における沈降剤としてのヒドロキシアルキルセルロース 、特にヒドロキシメチルセルロース（ＨＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ ＮＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＲＰＣ）、およびヒドロキシブチル メチルセルロース（ＨＢＭＣ）の使用に関する。本発明によれば、白血球のもと の数から約８０％の完全な白血球が回収され、そしてそれらの９５％以上が生存 状態のままである。さらに、下層中に分離される赤血球もまた完全なままである 。

従来の分離方法における３％ＨＥＳに比較すると、混合物中のＨＥＣの最終濃度 は０．０５％である。それ故、捕獲された細胞にほとんどＨＥＣが結合しておら ず、そして容易に洗い落とされ得る。

ＮＨ，（／！溶解とは異なり、ＨＥＣ技術は顆粒球（＠粒状白血球）または赤血 球を破壊しない。さらにこの技術により回収されたＷＢＣは、誘導因子（インデ ューサー）に暴露された後インターフェロン産生の損傷なしに少なくとも１日間 保存され得る。

発明の詳細な説明 本発明は、血液試料中に存在する赤血球を破壊することなく完全な白血球を沈降 させるための特に有効な試薬を提供する。この発明がより十分に理解され得るよ うに、次の例を以下に示した。これらの例は例示を目的としたものであり、決し てこの発明を限定するものと解釈してはならない。

例Ｉ バフィコート（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｒｅｄ　Ｃｒｏｓｓ）をプールし、混合しそ してサンプリングし、そしてＣｅ１ｌ　Ｄｙｎ　４００血球計数器（Ｓｅｑｕｏ ｉａ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使って最初のＲＢＣおよびＷＢＣ総数を 測定した。脱イオン水中０．Ｉ’＄＜ｗ／ｖ）　ＨＥ　Ｃおよび０．９％（ｗ／ ｖ）　ＮａＣ１の溶液を作製し、ＨＥＣが溶液になるまで少なくとも１．５時間 撹拌することにより沈降剤を調製した。

その沈降剤をバフィコートプールと少なくとも１分間ゆっくりと混合し、分液漏 斗または他の適当な容器に注ぎ、そして室温でまたは冷却して１時間半から３時 間（１，５−３時間）鎮静させる。混合物中のＨＥＣの最終濃度は、好ましくは ０．０５％（Ｗ／Ｖ）である。しかしながら、ＮＥＣは０．０２５％〜０．５％ の最終濃度で存在してもよい。

分離が完了した後、下のＲＢＣ層を流出させるかまたは上のＨＥＣ層を吸引した 。次いで、新鮮な沈降剤を使って前述したように下層を再沈降させ、より多くの ＷＢＣを獲得することができた。

ＲＢＣ数、ＷＢＣ数、ＷＢＣ／ＲＢＣ、およびＷＢＣの生存度（トリパン青排除 試験による）について回収層を分析した。

結果を下表に示す。

実験　１４７６−１９ （０，１％　）ＩＥＣｌｏ、９％ＮａＣ１原液）試料Ｖｏ１．ＲＢＣＸ　１０” 　ＷＢＣＸ　１０Ｉ０ＷＢＣ／ＲＢＣ収率ブール　６００ＷＬ１３．２５　４． ００　０．０１　１００％上層７２０ｍ１Ｏ，２０３，３７０，１７８４％下層 ５００ｒｎ１２．７３　０．３４　０．００１　９％実験　１４７６−７ （０，１％　ＨＥ１１．９％ＮａＣｆ　原液）試料Ｖｏ１．　ＲＢＣＸＩＯ１２ ＷＢＣＸＩＯ”　ＷＢＣ／ＲＢＣ収率ブール　１０００ｒｎ１５．８８　４．６ ６　０．０１　１００％上層８３０ｍｆ　Ｏ，１１３，７２０，３４８０％下層 １１９０ｍｆ　５．Ｌ！、！ｉ　１．０９　０．００２　２３％遠心を使って、 獲得した細胞を洗浄した。代わりに、タンゲンシャル・フローフィルタレ−ジョ ン（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）または他の便利な 方法を使うことにより、該細胞を浄化してもよい。

ＷＢＣ層を１１００Ｘで７分間回転した。上清を捨て、ペレットを白血球培地中 に３７℃で再懸濁し、そしてＷＢＣを計測した。２１０体積のＭＥＭ培地、ヒト 血清、およびα−インターフェロンブライマーにＩ　Ｘ　１０’ＷＢＣ／−の濃 度でＷＢＣを加えた。誘導は３７℃の湯浴中に保持された６１の丸底フヂスコ中 で実施した。

３時間の最初のインキュベーションの後、α−インターフェロン産生を誘導する ためにセンダイウィルスを該フラスコに添加した。誘導時間は典型的には１８時 間であった。次いで、４．０００ｇでの２０分間の遠心によりα−インターフェ ロンを収集した。その上清試料はＣＰＥ　（細胞変性効果）アッセイにかけられ た。

ＣＰＥアッセイは、ある種のウィルスに対しである種の細胞を保護するα−イン ターフェロンの産生能に基づく。使用される該アッセイにおいては、Ｈｅｐ　２ 細胞を９６ウエルのミクロプレート中でコンフルエンスまで増殖させる。α−イ ンターフェロンの逐次希釈液を試料ウェルに添加し、そして該細胞とともに約２ ０時間インキュベート　（３７℃、５％Ｃ０２）　した。

次に、ＶＳＶウィルスを該ウェルに加えて保護されない細胞を感染させた。対照 ウェル（即ち、これらのウェルには細胞とウィルスのみが存在する）中で１００ ％の細胞壊死を達成するのに十分なインキュベーション時間の後、全ウェルをゲ ンチアナ染色で染色した。完全な細胞は、その膜が色素をとり込むために紫色に 見える。細胞の５０％が保護されているウェルの番号（即ちその希釈度）を終点 と称する。終点は、試料の力価（インターフェロン単位／ｍ１．における）をＮ ＩＨからの標準試料に対して関係づけるために使われた。

０．０５％ＨＥＣの原液を細胞分離に使用した時は、非常に遅い分離が生じた。

即ち、０．１％および０．２％のＨＥＣ原液を使った分離に比べると、０．０５ ％ＨＥＣの分離は同じ時点において後の二者はど速くは進行していなかった。ま た０、０５％の分離は、中間層に多くのＲＢＣ混入があるように見える（他の分 離の各々において現れる白色のバンドよりも幾分ピンク色のバンドにより証明さ れる）。

０．５％ＨＥＣの原液は良好な分離を与えなか９も一２層だけが形成されそして より多くのＷＢＣが上層よりも下層から回収された。また、上層の“純度”は、 ＷＢＣ／ＲＢＣによって表示されるように、０．１％ＨＥＣの分離の合わせた２ つの上層に見られるものの１７２よりも小さかった（即ち、０．３０に比較して ０．１４）。０．７％および１．０％ＨＥＣの濃度はほとんど有効でなかった。

一連の実験にわたって、本発明者らは２０−５０．０００単位／−の範囲のα− インターフェロン力価を得た。

ＨＥＣで収集されたＷＢＣの細胞下降のスミアを作製した。

細胞をメイーグリュンヴアルドーギムザ染色液で処理し、そしてその細胞を顕微 鏡で検査した。細胞分画の研究は、白血球の細区分（ｓｕｂｐｏｐｕ　ｌａｔ　 １ｏｎ）がもとの血液プールにおけるものと本質的に同じ分布であることを示し た。白血球の形態は正常であった。

例■ 上記の例ＩでＨＥＣについて記載したようにして、ヒドロキシプロピルセルロー ス（分子量３００，０００　；　Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の０．１ ％溶液を調製した。０．１％ＨＰＣ１０，９％ＮａＣ１溶液を同容量のバフィコ ートブールと混合した。２つの分離実験において、ＷＢＣとＲＢＣとの間の良好 な分離が観察された。

しかし、どちらの分離も分液漏斗中で行わなかったため、下層からのＲＢＣで汚 染されることなしに上層を効率的に回収することは困難であった。

ヒドロキシブチルメチルセルロース（ＨＢＭＣ）を使って同タイプの実験を行っ た。０．９％ＮａＣｊ２と共に同じ０．１％のポリマー濃度を使った時、分離は 同時に実施されたＨＥＣの分離よりも速く起こるように思われ且つ良好であるよ うに見えた。

この発明の多数の実施態様を上に示したが、基本的な方法が本発明の方法を利用 する他の実施態様を提供するために変更され得るということは明らかである。例 えば、ＷＢＣの収率は種々の手段により増加されるかもしれない。第一に、ＲＢ Ｃ／ＷＢＣの分離を容易にする装置において沈降が実施されてもよい。これは、 ＲＢＣ’／ＷＢＣの界面の所望の位置で圧縮をする装置、または界面のゆらぎを 最少にするように設計された流出もしくは吸引手段を有する装置を包含するだろ う。第二に、揺変性試薬を添加してもよい。そのような試薬は、ＲＢＣおよびＷ ＢＣ層を分離している遮断構造の中へ該試薬を収集させるようにその比重が選択 されるべきである。第三に、所望沈降剤として他のヒドロキシアルキルセルロー スがＨＥＣと置き換えられ得る。

単位重力の沈降に加えて、遠心によるＲＢＣ／ＷＢＣ分離においてＨＥＣを使用 してもよい。ＨＥＣを細胞破壊片から細胞を分離することにおいて使用してもよ い。最後に、本技術により提供されるＷＢＣおよびＲＢＣは、ＷＢＣもしくはＲ ＢＣのサブタイプに分離されてもよく、または種々のＷＢＣもしくはＲＢＣ組成 を生じるように分画されてもよい。

この発明の範囲は、例により上に示された特定の態様よりもむしろ添付された請 求の範囲により定義されるものである。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．白血球および赤血球を含有する血液または血液画分を、白血球に富む第一画 分と赤血球に富む第二面分とに分離する方法であって、血液または血液画分を、 ヒドロキシアルキルセルロースを含んで成る沈降剤と混合し、その混合物を鎮静 させ、そしてその混合物を前記第一画分と前記第二画分とに分離することを含ん で成る方法。 ２．前記鎮静が単位重力にて生じる、請求項１に記載の方法。 ３．前記混合物中のヒドロキシアルキルセルロースの最終濃度が０．０２５％〜 ０．５％である、請求項１に記載の方法。 ４．前記ヒドロキシアルキルセルロースがヒドロキシエチルセルロースである、 請求項１に記載の方法。 ５．前記ヒドロキシアルキルセルロースがヒドロキシプロピルセルロースである 、請求項１に記載の方法。 ６．もとの白血球の８０％以上が白血球に富む画分中に回収される、請求項１に 記載の方法。 ７．前記第一画分および第二画分を分離するために揺変性の遮断材の利用をさら に含んで成る、請求項１に記載の方法。 ８．前記赤血球および白血球を破壊するような条件に細胞を暴露しないことを含 んで成る、請求項１に記載の方法。 ９．前記ヒドロキシアルキルセルロースがヒドロキシメチルセルロースである、 請求項１に記載の方法。 １０．前記ヒドロキシアルキルセルロースがヒドロキシブチルメチルセルロース である、請求項１に記載の方法。 １１．インターフェロンの誘導に適する白血球を得る方法であって、血液または 血液の白血球含有画分を用意し、上層を白血球に富んだ状態にするように、ヒド ロキシアルキルセルロースを含む沈降剤と血液とを混合し、そして前記上層から インターフェロンの誘導に適する白血球を回収することを含んで成る方法。 １２．前記白血球が保存１日後でさえもインターフェロンの誘導に適している、 請求項１１に記載の方法。 １３．前記ヒドロキシアルキルセルロースが、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエ チル、ヒドロキシプロピルおよびヒドロキシブチルメチルセルロースから成る群 から選択される、請求項１１に記載の方法。