SE521954C2 - Process för kontinuerlig rening och koncentrering av leukocyter från humant blod - Google Patents

Description

25 30 521 954 2 (Cantell, K., Hirvonen, S, Kauppinen, H-L. and Myllyla, G., Production of interferon in human leukocytes from normal donors with the use of Sendai virus, in Methods in Enzymology, vol 78, p.

S. and Koistinen, V., 29-38, och Cantell, K., Hirvonen, Partial purification of human leucocyte interferon on a large scale, in Methods in Enzymology, vol 78, p- 499-505). Processen som beskrivs av Cantell kan sammanfattas som följer: poolade buffy coats fràn friska blodgivare suspenderas i kall 0.83% NH4Cl och centrifugeras. Vid detta steg renas leuko- cyterna och separeras från andra blodceller. Ungefär 30% av leukocyterna försvinner. Leukocyterna samlas upp och inkuberas i modifierat "Eagle's minimum essential medium" (MEM). Suspensionen är sedan förbehandlad med en mindre mängd interferon ( priming ) och sen inokulerad med Sendai virus i syfte att initiera produktionen av interferon. Det skördade ràa interferonet poolas sedan och interferonet fälls ut och renas vidare.

Uppbearbetningsstegen av leukocyterna utförs i de flesta fall satsvis med användning av glaskolvar och andra lämpliga manuella utrustningar. Uppskalning har tills nu uppnåtts genom att använda fler kolvar och cen- trifuger och naturligtvis mer personal för att handha dessa kolvar. Produktionen av interferon enligt teknikens ståndpunkt lider således av nackdelar som är typiska för arbetsintensiva processer; hög personalkostnad, låg re- producerbarhet, variationer i utbyte osv. Förbättringen av dagens processer har således mest fokuserats på hur man bäst utnyttjar tillgänglig laborationsutrustning och metodologi. Följande uppfinning hjälper till att över- brygga dessa nackdelar och att möjliggöra högre utbyte, bättre reproducerbarhet och lägre personalkostnad. Dess- utom möjliggör uppfinningen enklare uppskalning och en 10 15 20 25 30 521 954 3 process som är mer anpassad till "Good Manufacturing Practice" (GMP).

Sammanfattning av uppfinningen Föreliggande uppfinning erbjuder en lösning till det ovan nämnda problemen och nackdelarna av en konventionell process genom att introducera en process enligt de bifo- gade kraven. Den uppfunna processen har bl a fördelarna med att vara lämplig för automation som i sin tur ger bättre reproducerbarhet, minskning av personalkostnad.

Vidare så är processen enligt uppfinningen lätt att skala upp och att anpassa till stora produktionsvolymer.

Kort beskrivning av ritningar Uppfinningen kommer nu att beskrivas i mer detalj nedan med referens till bifogade ritningar av vilka -Fig 1 visar ett blockdiagram som i sin tur visar de oli- ka processtegen enligt föreliggande uppfinning.

-Pig. 2 visar schematiskt ett exempel av en automatiserad leukocytreningsprocess enligt föreliggande uppfinning.

Beskrivning av uppfinningen Uppfinnaren till föreliggande uppfinning har överras- kande visat att en kontinuerlig och automatiserad process kan användas vid rening och koncentrering av leukocyter.

Nämnda process omfattar följande steg: - Plasma avlägsnas från leukocytsuspensionen genom filtrering - NH4Cl tillsätts till det filtrerade leukocyt- koncentratet - Blandningen av leukocytkoncentrat och EEMCI leds genom en statisk mixer 10 15 20 25 30 521 954 4 - Blandningen av leukocytkoncentrat och NH¿Cl leds genom ett retentionskärl - Blandningen av leukocytkoncentrat och NH¿Cl leds genom en centrifug - De skördade cellerna samlas upp och processas vidare Enligt en utföringsform av uppfinningen, utförs filtre- ringssteget för separation av plasma och leukocyter med hjälp av "hollow fibres" (hàlfibrer), som är lämpliga för användning i processen enligt uppfinningen och som en del i apparaten eller systemet enligt uppfinningen. Filtre- ringsparametrarna är balanserade för att producera à ena sidan en tät koncentrerad leukocytfraktion och à den an- dra sidan en ren plasmafraktion med så lite missfärgning som möjligt. Plasmafraktionen kan användas som start- material i andra processer eftersom den är ren och den innehåller inga tillsatser.

I syfte att uppnå lysering av de röda blodkropparna i leukocytsuspensionen så blandas den koncentrerade suspensionen med ammoniumkloridlösning (O.8 % w/v).

Flödet av ammoniumklorid är företrädesvis tvà gånger flödet av leukocyter. Blandningen av leukocytkoncentrat och ammoniumkloridlösning leds genom en statisk mixer i syfte att få en effektiv blandning och därefter genom ett retentionskärl. Retentionskärlet är utformat så att en retentionstid pà ca 10 minuter uppnås (beroende av flöde/ volymförhållande) och så att lösningen är homogen i hela kärlet.

Därefter leds blandningen av leukocytkoncentrat och ammoniumkloridlösning till en kontinuerlig centrifug.

Centrifugen kan vara en kontinuerlig eller semikonti- nuerlig centrifug i sanitärt utförande och företrädesvis en centrifug anpassad för sanitärisering utan demonte- 10 15 20 25 30 521 954 5 ring, "Sanitation-In-Place (SIP)" och dessutom så kallad "Clean-In-Place (CIP)".

Efterföljande processteg kan inkludera ett andra ly- seringssteg av röda blodkroppar. Slutligen överförs de renade och koncentrerade leukocyterna till ett inkuba- tionskärl, där interferon produktionen induceras genom tillsats av Sendai virus. Interferonproduktionen äger företrädesvis rum i en bioreaktor. Fördelarna med att använda en bioreaktor som inkubationskärl är möjligheten att uppnå bättre kontroll av inkubationssteget, enklare uppskalning och förenklad SIP och CIP. Tillsammans med de andra processstegen som beskrivits tidigare i denna text är detta en mer komplex process som är bättre anpassad till industriell tillverkning av interferon.

Exempel Exempel 1. Test med Doolade humana buffv coats i pilotskala.

Buffy coats tog ut fràn en ordinarie produktionssats (poolade buffy coats fràn humana donatorer) och tömdes separat. Hälften av mängden blod processades genom den uppfunna experimentella processen och den andra halvan enligt ordinarie produktions process. I den experimen- tella processen separerades plasmat genom filtrering med "hollow fibres". Den filtrerade plasman fraktionerades och fraktionerna med högst absorbans vid 280 nm (A280) lagras för att funktionstestas senare.

Efter separation av plasma pumpas blodfraktionen direkt in i ett omblandningsrum, en statisk mixer, tillsammans med ett flöde av en vattenhaltig ammonium- kloridlösning (0.8 % w/v). Flödet av ammoniumklorid är företrädesvis tvà gånger blodflödet, men det kan variera 10 15 20 25 30 521 954 6 inom området från 1,5 till 5 gånger nämnda flöde. Den blandade lösningen rinner sedan kontinuerligt genom retentionskärlet. Retentionskärlet är utformat med hänsyn till flödes/volym förhållanden på så vis att retentions- tiden blir ca 10 minuter och säkerställer att innehållet i kärlet blir blandat till homogenitet. Detta är den tid som är nödvändig för lysering enligt ordinarie produk- tion. Lysatet som kommer ut från retentionskärlet leds direkt in i den semikontinuerliga centrifugen. Centri- fugen skördas sedan intermittent. De skördade cellerna lyseras sedan en gång till och suspenderas sedan i kon- ventionellt medium för att bilda en cellsuspension med en hög cellkoncentration. Cellsuspensionen överförs sedan till en bioreaktor som innehåller ett lämpligt medium och inkuberas sedan i ca. 17 timmar.

Efter ca. en och en halv timme av de 17 timmarna, tillsätts Sendai virus till bioreaktorn och cellerna induceras att producera interferon-alfa. Interferon-alfa som utsöndras ut i mediet tas tillvara efter inkuba- tionen.

I exempel 1 tillsätts därefter cellsuspensionerna till 100 ml inkubationsflaskor eller till 3 liters labo- ratorie-bioreaktorer i syfte att jämföra celler från den ordinarie produktions processen med celler från den expe- rimentella processen. Interferonet från bioreaktorerna och 100 ml flaskorna analyseras sedan med avseende på interferoninnehàll med hjälp av en ELISA metod som är specifik för kvantitativa mätningar av leukocyt interferon-alfa. 521 954 7 Tabell 1. Utbyten av interferon från experimenten Mängd Cell- ELISA Utbyte Ut- Utbyte Tot. till- konc. /cell byte /cell ut- satt byte (x 107 (IU/ (10-3 ( ml ) st/ml) ml) IU/ ( % ) ( % ) cell) 961009 Exp.- 1,5 0,8 32000 4 100 100 100% celler Ref.- 1,5 0,8 32000 4 celler 961023 Exp.- 1,1 1 41000 4,1 celler Exp.- 1,1 1 47000 4,7 85 90 155% celler Ref.- 2 1 52000 5,2 celler Ref.- 2 1,1 51000 4,6 celler 961030 Exp.- 1 0,8 42000 5,3 celler Exp.- 1 0,8 43000 5,4 celler Ref.- 1 0,8 46000 5,8 celler Ref.- 1 0,8 46000 5,8 celler Exp.- celler Exp.- celler Ref.- celler Ref.- celler 961114 Exp.- celler Exp.- celler Exp.- celler Exp.- celler Ref.- celler Ref.- celler Ref.- celler Ref.- celler 521 954 61000 54000 65000 64000 38000 37000 56000 56000 42000 46000 70000 64000 5,8 91 84 91 82 91 84 521 954 9 ( Tabell 1 forts. ) Mängd Cell- ELISA Utbyte Ut- Utbyte Tot. till- konc. /cell byte /cell ut- satt byte ( x 107 (IU/ (10-3 ( ml ) st/ml ) ml) IU/ ( % ) ( % ) cell) 961121 Exp.- 1,5 1,1 58000 5,3 celler EXp.- 1,5 l,l 53000 4,8 celler EXp.- 2 1,5 73000 4,9 celler Exp.- 2 1,5 66000 4,4 139 94 196% celler Ref.- 2 0,7 29000 4,1 celler Ref.- 2 0,7 46000 6,9 celler Ref.- 3 l,l 56000 5,1 celler Ref.- 3 l,l 51000 4,6 celler 961127 Exp.- 1,1 l,l 41000 3,7 celler Exp.- 1,1 1,1 47000 4,3 celler EXp.- 1,5 1,7 69000 4,1 celler Exp.- celler Ref.- celler Ref.- celler Ref.- celler Ref.- celler Labferm .Exp Labferm .Ref 961204 Exp.- celler Exp.- celler Exp.- celler Exp.- celler Ref.- celler Ref.- celler Ref.- celler Ref.- celler Labferm 45 84 65 521 954 10 69000 32000 36000 53000 56000 46000 40000 30000 31000 48000 50000 37000 35000 53000 56000 50000 4,1 128 87 92 96 193% 87% 521 954 ll .Exp Labferm 65 1,1 55000 5 .Ref 961206 Exp.- 1,5 1 51000 5,1 celler Exp.- 1,5 1 48000 4,8 celler Exp.- 2,25 1,5 83000 5,5 celler Exp.- 2,25 1,5 79000 5,3 116 116 78% celler Ref.- 1 l 40000 4 celler Ref.- 1 l 50000 5 celler Ref.- 1,5 1,5 70000 4,7 celler Ref.- 1,5 1,5 62000 4,1 celler ( Tabell 1 forts. ) Mängd Cell- ELISA Utbyte Ut- Utbyte Tot. till- konc. /cell byte /cell ut- satt byte ( ml ) ( X 107 (IU/ (10-3 st/ml ) ml) IU/ ( % ) ( % ) cell) 961211 Exp.- 1,5 1,1 66000 6 celler Exp.- celler Exp.- celler Exp.- celler Ref.- celler Ref.- celler Ref.- celler Ref.- celler Labferm .Exp Labferm .Ref 521 954 12 61000 88000 86000 61000 67000 79000 74000 68000 64000 5,5 6,1 106 89 6,8 7,4 6,2 106% MEDELVÅ RDE 104 94 121 STAND.

AVVIKEL SE. 20 10 47 REL.

STAND.

AVVIKEL SE. 19% 10% ANTAL.

Resultaten visar ett bättre utbyte med den uppfunna experimentella linjen. Det är möjligt att få ut mera 10 521 954 13 celler från experimentella linjen i jämförelse med den konventionella produktions linjen och således ett högre totalt utbyte av interferon eftersom utbytet per cell är ungefär lika.

Funktionstesterna av plasman separerade med hjälp av "hollow fibres" utfördes genom att tillsätta denna plasma istället för ordinarie plasma till mediet vid inkubering av leukocyter i liten skala, 100 ml flaskor. Interferonet som producerades i dessa flaskor analyserades med en ELISA metod och jämfördes med ELISA resultat från flaskor som inkuberats med ordinarie plasma. 521 954 14 Tabell 2. Experimentella utbyten plasma kvalitet.

Plasma A 280 Mängd Media Cell- ELISA Ut- Ut- Ut- prep. till- till- konc. byte byte byte satt. satt. /cell /cell (ml) (ml) (X (IU/ (10-3 (%) (%) 107st ml) IU/ / cell) ml) M-5296, 25,6 1,6 40 1,2 63000 5,3 100 100 Ref.

M-5296, 25,6 1,6 40 1,2 62000 5,2 100 100 Ref. 961014 18,4 2,23 39,4 1,2 71000 5,9 ll5 ll5 961014 18,4 2,23 39,4 1,2 73000 6,1 961028 17,3 2,38 39,2 1,2 64000 5,3 109 109 961028 17,3 2,38 39,2 l,2 72000 6,0 961030 18,8 2,25 39,4 1,2 65000 5,4 102 102 961030 18,8 2,25 39,4 1,2 62000 5,2 961114 14,6 2,81 38,8 1,2 66000 5,5 102 102 961114 14,6 2,81 38,8 1,2 62000 5,2 961202 12,3 3,28 38,3 1,2 64000 5,3 106 106 961202 12,3 3,28 38,3 1,2 68000 5,7 MEDEL- 107 107 VÃRDE 521 954 15 STAND. 6 AV- VIKELSE.

REL. 5% STAND.

AV- VIKELSE.

ANTAL. 5 10 15 20 25 521 954 16 Exempel 2. Sanitáriserinqsförsök för att bestämma resultatet av CIP.

Sanitärisering av den experimentella process linjen omfattande centrifugen, plasma filter, statisk mixer och retentionskärl utfördes genom att pumpa NH4C1 genom sys- temet direkt efter blodet, förutom genom plasma filtret vilket fylls med PBS (fosfatbuffrad saltlösning). Flödes- riktningen av PBS var den omvända i plasmafiltret. Hela systemet dränerades sedan och därefter pumpades PBS in.

Systemet blev återigen dränerat och fylldes sedan med 0.5 M NaOH. Systemet fick stà i 0.5 M NaOH i ca. en timme och därefter dränerades det och äterfylldes med lagrings- lösning 0.1 M NaOH. När systemet tas i bruk igen dräneras det och tvättas med PBS.

Systemet demonterades och inspekterades visuellt pà kritiska punkter för att se att inga celler eller cell- fragment etc var kvar inne i systemet. Prov togs ut fràn sköljlösningen före varje experiment på sköljlösningen som hade passerat hela systemet eller som det visas i tabell 3. Proven analyserades med avseende pà bakterie- innehåll (enligt European Pharmacopeia, 2nd Edition) och endotoxin innehåll (enligt European Pharmacopeia, 2nd Edition).

Tabell 3. Experimentella resultat: sanitär status Bakt. Endotox. ( cfu/ml ) ( EU/ml ) 961009 Sköljlösning: PBS < 0.5 < 0.2 961023 521 954 17 Sköljlösning: vatten 0,5 < 0.2 961030 Sköljlösning: vatten < 0,5 < 0,2 961114 Sköljlösningz vatten, < 0,5 < 0,2 efter hollowfibre Sköljlösning: vatten, 1 efter retentionskärl 961121 Sköljlösning: vatten, < 0,5 ND filtrat Sköljlösning: vatten, < 0,5 efter retentionskärl 961127 Sköljlösning: vatten < 0.5 < 0,2 ( Tabell 3. Forts. ) Bakt. Endotox. ( cfu/ml ) ( EU/ml ) 961204 Sköljlösning: vatten < 0,5 ND 961206 Sköljlösning: vatten < 0,5 ND 961211 Sköljlösning: vatten < 0,5 ND 10 521 954 18 Inga celler eller cellfragment kunde ses inne i systemet. Tabell 3 visar att det uppfunna systemet kan köras under aseptiska förhållanden och är lämpligt för CIP.

Uppfinningen har beskrivits med hänsyn till före- dragna utföringsformer, vilka utgör det bästa sättet att utföra uppfinningen för närvarande enligt uppfinnarna.

Naturligtvis kan vissa ändringar och modifieringar göras vilka är självklara för fackmannen inom området utan att avvika från uppfinningens innehåll, vilket beskrivs i de bifogade patentkraven.

Claims (7)

fl _ “v 10 15 20 25 30 521 954É?“fš¶§f 19 PATENTKRAV

1. l.Process för kontinuerlig rening och koncentrering av leukocyter fràn humant blod, k ä n n e t e c k n a d a v att nämnda process innefattar följande steg: (a) plasma separeras fràn buffy coats från blod genom filtrering för att erhålla ett leukocytkoncentrat; (b) ammoniumklorid tillsätts till det filtrerade leukocytkoncentratet fràn steg (a) i form av en vattenhaltig ammoniumkloridlösning, för att erhålla lysering av röda blodkroppar; (c) blandning av leukocytkoncentrat och ammonium- kloridlösning från steg (b) i en blandningsanordning; (d) blandningen från steg (c) leds genom ett retentionskärl; (e) blandningen från steg (d) leds genom en centrifug för att separera leukocyterna; (f) de separerade och skördade leukocyterna uppsamlas och vidareprocessas.

2.Process enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d a v att filtreringen utförs genom att leda buffy coat genom ett membranfilter med en porstorlek inom intervallet av 0,1-1,0 pm.

3.Process enligt krav 1, k å n n e t e c k n a d a v att retentionskärlet är utformat pà ett sätt sà att re- tentionstiden för blandningen av leukocytkoncentrat och ammoniumklorid blir ca. 10 minuter.

4.Process enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d a v att plasman som separeras i steg (a) àteranvänds.

5.Process enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d a v att processen är automatisk och anpassad för CIP ("Clean- In-Place") rengöring och sanitärisering. fc n: 1 v H .... , ' = -^ f- i, 'f = =' 20

6.Process enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d a v att de skördade leukocyterna utsätts för en andra lysering.

7.Process enligt krav 1, k ä n n e t e clk n a d a v att de skördade leukocyterna år inkuberade i en bioreaktor.