ES2250393T3 - Procedimiento para separar celulas viables de insectos o de mamiferos a partir de suspensiones de celulas. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la separación de células viables de mamíferos o de insectos a partir de suspensiones de células, en el que la suspensión de células se introduce de manera continua por medio de una instalación de entrada tangencialmente en el espacio de cilindro de al menos un hidrociclón y se la deja fluir a través del cono del hidrociclón en una trayectoria de recorrido circulante dirigida hacia abajo, en forma de espiral, recolectándose en la instalación de salida de rebalse inferior del hidrociclón, situada en el extremo inferior del cono, una suspensión enriquecida en células, y recolectándose en la instalación de salida del rebalse superior del hidrociclón, dispuesta centralmente en el espacio de cilindro, una suspensión empobrecida en células, y siendo la caída de presión entre la instalación de entrada y la instalación de salida del rebalse superior a lo sumo de 4 bar, presentando el hidrociclón las siguientes características constructivas: sección cilíndrica: longitud 2 a 12 mmdiámetro 5 a 15 mm sección cónica: ángulo de estrechamiento: 5 a 20º instalación de entrada: diámetro 0, 5 a 4 mm instalación de salida de rebalse superior: diámetro 1 a 5 mm profundidad de penetración: 1 a 6 mm instalación de salida del rebalse inferior: diámetro 0, 5 a 7 mm

Description

Procedimiento para separar células viables de insectos o de mamíferos a partir de suspensiones de células.

La invención se refiere a un procedimiento para la separación de células viables de mamíferos y de insectos a partir de suspensiones de células, bajo la utilización de hidrociclones.

En las décadas pasadas la técnica del cultivo de células ha hecho manifiestos progresos y ha contribuido en especial a preparar productos muy valiosos con utilidades terapéuticas, tales como proteínas farmacéuticas de tipo sumamente diverso. En la actualidad nuevos impulsos parten del cultivo de tejidos así como del empleo directo de células y genes para la terapia. En este caso se está a la expectativa de una elevada utilidad comercial (Peshwa, 1999). Sin embargo, en el tratamiento final de cultivos de células se ha demostrado que no se dispone de un método sencillo para la separación o enriquecimiento de células viables.

Muchos reactores biológicos, que se emplean en la industria para la producción de productos farmacéuticos, trabajan en la denominada modalidad de perfusión. En este caso, del reactor se extrae continuamente medio de cultivo libre de células, mientras que al mismo tiempo se reabastece continuamente en medio de cultivo fresco. Mediante esta modalidad operativa se obtienen elevadas concentraciones de células y, por ello, también productividades volumétricas para los productos farmacéuticos deseados, elevadas en comparación con el funcionamiento en tandas o en cargas, o en comparación con los cultivos de alimentación continua (Batch y Fedbatch). (Zeng & Deckwer, 1999).

Para la recolección de un cultivo de células de mamífero, independientemente del tipo de operación en que se lleva a cabo, el primer paso necesario es la separación de las células del medio. Los métodos convencionales para lograr este objetivo son la centrifugación, microfiltración o deposición en el campo gravitatorio terrestre.

Una desventaja del empleo de centrifugadoras son sus elevados costos de adquisición, los elevados costos de funcionamiento y su capacidad relativamente pequeña. Por ello, el empleo de centrifugadoras en el cultivo por perfusión de células de mamíferos conduce a elevados costos de inversión y de funcionamiento, lo que se refleja finalmente en el precio final del producto. Otra desventaja de las centrifugadoras la representa la dificultad de su esterilización y de un funcionamiento aséptico o monoséptico.

Esto rige en especial en el caso de centrifugadoras de disco, que son las que se utilizan con la mayor frecuencia en la separación de células. Además de la esterilización in situ, la generación de calor en el funcionamiento de las centrifugadoras de disco representa otro problema.

Sin embargo, estos problemas pueden resolverse con éxito, como muestra una patente de Zentritech (Yhland, 1992). En este caso se utilizan bolsitas de material plástico que se colocan en el rotor de la centrifugadora y que pueden introducirse en el sistema de fermentación sin juntas de estanqueidad rotativas. Sin embargo, el diseño y funcionamiento de esta instalación de Zentritech es realmente complicado, de una capacidad comparativamente pequeña, y está asociado con elevados costos.

En lo que a la microfiltración se refiere, en este caso el problema principal consiste en el recubrimiento, o como consecuencia del mismo, en el taponamiento de la membrana durante el funcionamiento en el que se extrae filtrado de manera continua. Esto significa que este proceso de separación de células no puede hacerse funcionar establemente durante un intervalo de tiempo prolongado, lo que sin embargo es necesario, con más exactitud a lo largo de varios meses, en el caso de los cultivos por perfusión de células de mamíferos si los mismos se emplean para la producción de proteínas farmacéuticas.

Para evitar el problema del taponamiento de la membrana, se han propuesto filtros de rotación. Una visión de conjunto sobre estos aparatos puede encontrarse en Tokashiki y Yokohama (1997). Sin embargo, estos autores también hacen énfasis en que apenas es posible evitar por completo un ensuciamiento o taponamiento de la membrana.

Otro problema importante en el empleo de técnicas de separación por filtración mediante membranas es su escasa estabilidad mecánica, que puede conducir a su ruptura, en especial en el caso de elevadas presiones transmembranales. En este caso es necesario desconectar la totalidad del proceso y al menos intercambiar la membrana, siendo incluso eventualmente necesario interrumpir la totalidad del proceso a causa de una contaminación microbiana.

El filtro dinámico, que ha sido propuesto por GBF - Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH -y que se ha patentado para la misma, posee un rotor cónico que retiene o hace retroceder la deposición de células en la superficie de la membrana, pero tampoco en este caso es posible evitar a largo plazo un taponamiento y el problema de la ruptura de la membrana (Kroner & Vogel 1998).

En el caso de la sedimentación de células de mamíferos en el campo gravitatorio terrestre se observan solamente, incluso en el caso de células relativamente grandes, velocidades de deposición muy pequeñas. A saber, estas se encuentran sólo en el intervalo de 2 - 10 cm/h, por lo que en este caso la capacidad de separación de las células es tan sólo muy pequeña (Tokashiki & Yokohama, 1997). A causa de la pequeña velocidad de deposición de las células, y a la vista de la escasa superficie de deposición en los reactores usualmente utilizados, es necesario mantener la velocidad de perfusión en un valor bajo. Velocidades de perfusión elevadas sólo pueden realizarse en reactores con superficies de deposición extremadamente grandes. Esto ocasiona grandes dificultades para aumentar la escala de productividad industrial de estos reactores, así como en su esterilización. Por ello, la deposición en el campo gravitatorio terrestre es de escasa importancia para sistemas de perfusión.

Recientemente se publicaron nuevos métodos para la separación de células. En este caso se trata, por una parte, de una sedimentación facilitada por ultrasonidos (Hawkes et al., 1997) y, por otra parte, de la separación dielectroforética (Doscoslis et al., 1997). Sin embargo, estos métodos se encuentran todavía en desarrollo. Además, son relativamente complejos, y desde el punto de vista económico apenas pueden competir con los métodos convencionales, ya descritos, de la separación de células o del enriquecimiento en células.

El documento WO 92/01779 describe un reactor de bandejas, con la capacidad de aumentar su escala de producción industrial, para la realización de fermentaciones con un recipiente longitudinal horizontal de sección transversal vertical esbelta con una abertura de entrada y una abertura de salida, separadas entre sí longitudinalmente. Una corriente de alimentación fluye desde la abertura de salida al interior de un separador, tal como por ejemplo un hidrociclón o un dispositivo de deposición, que reconcentra la biomasa, como, por ejemplo, aguas residuales o levaduras, y otros cuerpos sólidos, y que separa el líquido.

El documento EP-A-0 068 537 se refiere a un proceso para la producción de proteína de células sanguíneas y de hemo por desdoblamiento de hemoglobina mediante ácido y un agente disolvente orgánico. Después de pasos de tratamiento ulteriores a temperaturas de 20º a 50º tiene lugar la separación de la dispersión obtenida en hidrociclones, o en un grupo de hidrociclones, y el agente disolvente orgánico recuperado se vuelve a aportar, al menos en parte, al proceso.

Por ello existe una imperiosa necesidad de un procedimiento para el enriquecimiento de células en cultivos de perfusión, así como, en general, para la recolección de cultivos de células. Idealmente, el dispositivo o aparato que se utiliza para la realización del procedimiento debería ser de construcción sencilla, requerir poco personal en su funcionamiento, tener un tipo de funcionamiento robusto y ser sencillo con vistas a un aumento de la escala
productiva.

La misión de la invención es eliminar los problemas concomitantes con el estado de la técnica, antes descrito, y satisfacer la imperiosa necesidad, resultante de ellos, de un procedimiento alternativo para la separación de células viables de mamíferos o de insectos a partir de suspensiones de células.

Conforme a la invención se pone con ello a disposición conforme a la reivindicación 1 un procedimiento para la separación de células viables de mamíferos y de insectos a partir de suspensiones de células, en el que la suspensión de células se introduce por medio de una instalación de entrada tangencialmente en el espacio de cilindro de al menos un hidrociclón y se la deja fluir a través del cono del hidrociclón siguiendo una trayectoria de recorrido circulante dirigida hacia abajo, en forma de espiral, reuniéndose o recolectándose en la instalación de salida del rebalse inferior del hidrociclón, situada en el extremo inferior del cono, una suspensión enriquecida en células, y reuniéndose en la instalación de salida del rebalse superior, dispuesta centralmente en el espacio de cilindro y que se extiende en éste, una suspensión empobrecida en células, y siendo la caída de presión entre la instalación de entrada y la instalación de salida del rebalse superior a lo sumo de 4 bar, preferiblemente de 2 bar, presentando el hidrociclón las siguientes características constructivas:

Sección cilíndrica:

Longitud: 2 a 12 mm

Diámetro: 5 a 15 mm

Sección cónica:

Angulo de estrechamiento: 5 a 20º

Instalación de entrada:

Diámetro: 0,5 a 4 mm

Instalación de salida del rebalse superior:

Diámetro: 1 a 5 mm

Profundidad de penetración: 1 a 6 mm

Instalación de salida del rebalse inferior:

Diámetro: 0,5 a 7 mm.

Con el procedimiento conforme a la invención es posible lograr en el rebalse inferior del hidrociclón, incluso en el caso de una disposición sencilla, un enriquecimiento de al menos 1,2 veces el número de células en la entrada, sin una influencia digna de mención sobre la viabilidad de las células.

Con esto el procedimiento conforme a la invención es especialmente adecuado para el empleo con cultivos continuos de células con recirculación de células, con lo que es posible lograr elevadas densidades de células y elevadas productividades para proteínas (proteínas farmacéuticas, agentes de diagnóstico, anticuerpos monoclonales). Además, con ello es posible sustituir sistemas de reactores de perfusión más complicados, por ejemplo provistos de tecnología de membrana, por lo que en conjunto el funcionamiento se hace más robusto y la capacidad de esterilización se hace más fiable.

Otras formas de realización ventajosas y/o preferidas de la invención son objeto de las reivindicaciones secundarias.

Por lo tanto, en otra configuración en el procedimiento conforme a la invención se hacen funcionar varios hidrociclones, similares o distintos, en disposición paralela o en serie, en forma discontinua o continua.

En el caso de las células que según el procedimiento conforme a la invención pueden separarse o enriquecerse a partir de suspensiones de células, puede tratarse, por ejemplo, de células de mamíferos, tales como células sanguíneas o de hibridoma, o de células de insectos.

En las Figuras:

la Figura 1 muestra la estructura inicial de un hidrociclón utilizado en el procedimiento conforme a la invención,

la Figura 2 muestra el modo de acción de un hidrociclón utilizado en el procedimiento conforme a la invención;

la Figura 3 muestra la combinación de un hidrociclón utilizado en el procedimiento conforme a la invención con un biorreactor, y

la Figura 4 muestra la combinación de dos hidrociclones utilizados en el procedimiento conforme a la invención, para el funcionamiento en serie.

A continuación se describe de manera más detallada la invención, sin limitación, con ayuda de ejemplos de realización, y haciendo referencia a las Figuras.

Los hidrociclones son en si bien conocidos por la persona experta, y los principios de su funcionamiento se han descrito detalladamente en manuales y libros de enseñanza (Bradley, 1965; Svarosky, 1984; Heiskanen, 1993). Dado que su diseño y construcción son sencillos, sus precios son bajos en comparación con otros aparatos que cumplen la misma misión. En cuanto a sus aplicaciones, los ciclones son extremadamente versátiles. Pueden utilizarse para concentrar suspensiones, clarificar líquidos, clasificar sólidos en función de sus tamaños y densidades, separar líquidos no miscibles, desgasificar líquidos, etc. Hay numerosos fabricantes de hidrociclones, como por ejemplo Dorr-Oliver Inc., Krebs Engs, en los EE.UU., Richard Mozley Ltd en Inglaterra y AKW, Apparate und Verfahren GmbH en Alemania, por mencionar sólo unos pocos.

Como se representa a título de ejemplo en la Figura 1, los hidrociclones consisten en una sección cónica de longitud en si arbitraria y de diámetro arbitrario, seguida por una sección corta en forma de cilindro, que está provista de una instalación de entrada, por ejemplo un tubo correspondiente, para la introducción tangencial del material a separar. El cilindro se cierra mediante una placa en cuya parte central se extiende axialmente la corriente de salida del rebalse superior, por ejemplo por medio de una correspondiente instalación de salida que se extiende en el espacio de cilindro, por ejemplo un tubo cilíndrico o una boca. Esta instalación de salida del rebalse superior, central, también recibe el nombre de visor del vórtice, o de tubo de inmersión. El cono remata en una instalación de salida, por ejemplo un tubo cilíndrico, a través del cual fluye hacia fuera el rebalse inferior. Esta instalación de salida del rebalse inferior puede estar provista de una válvula regulable.

Si bien la primera patente para ciclones ya tiene más de 100 años (Bretnei, 1891), su primera aplicación industrial data sólo de fines de la Segunda Guerra Mundial. El aparato, que inicialmente se había dimensionado para lograr separaciones de sólidos/líquidos, se utiliza actualmente también para separar sólidos/sólidos (Klima & Kim, 1998), líquidos/líquidos (Moraes et al., 1996) y gases/líquidos (Marti et al., 1996).

El modo de acción de un hidrociclón utilizado en el procedimiento conforme a la invención se deduce de la Figura 2. El término "alimentación" se refiere a una suspensión de células que ingresa tangencialmente en el hidrociclón a través del tubo de entrada. La alimentación puede provenir de un reactor biológico o de otra fuente arbitraria de células. La expresión "rebalse inferior" se refiere a la suspensión enriquecida en células que abandona el hidrociclón en el extremo del estrechamiento cónico. La expresión "rebalse superior" se refiere al líquido de suspensión empobrecido en células, que abandona el ciclón hacia arriba a través del tubo concéntrico.

En el procedimiento conforme a la invención también es posible hacer funcionar de manera ventajosa dos o varios hidrociclones de tipos iguales o distintos, dispuestos en serie, como se describe, por ejemplo, en el Capítulo 9 del libro de Svarosky (1984) "(hydrocyclones in series" o "series of hydrocyclones"). Se logra una disposición de dos o varios hidrociclones en serie o en fila disponiendo por ejemplo que el rebalse superior del primer hidrociclón se transforme en la entrada del segundo ciclón, etc. Por supuesto, también es posible interponer una instalación o equipo adicional, como por ejemplo una bomba, en las tuberías de empalme entre los dos hidrociclones correspondientes.

En el procedimiento conforme a la invención también es ventajosa la disposición paralela de dos o varios hidrociclones. Este funcionamiento en paralelo ya se ha implementado muchas veces en la industria y se ha descrito en forma muy concreta, por ejemplo, en el Capitulo 5 del libro arriba mencionado (Svarovsky, 1984) ("hydrocyclones in parallel"). Una disposición de dos hidrociclones paralelos estaría dada, por ejemplo, con una división de la alimentación en dos partes, caso éste en el que cada una de estas partes se aporta directamente a un hidrociclón.

A diferencia de las centrifugadoras, cuyo principio de separación se basa en la sedimentación causada por la fuerza centrifuga que se presenta en los rotores, los hidrociclones no necesitan rotores de este tipo, ya que el movimiento de vórtice se induce por el líquido mismo, como es obvio en la Figura 2.

Debido a la introducción tangencial de la alimentación (por ejemplo, de la suspensión de células a enriquecer en células) en la parte superior de la sección cilíndrica el líquido (por ejemplo, la suspensión de células a enriquecer en células) experimenta un fuerte movimiento de torbellino dirigido hacia abajo, con lo que se genera también un pronunciado campo centrifugo. Debido a este campo centrifugo, las partículas sólidas (por ejemplo, las células) migran radialmente hacia fuera en dirección hacia la pared, se conducen hacia abajo por el estrechamiento cónico y finalmente se descargan por la salida del rebalse inferior. En cambio, el líquido (por ejemplo, la suspensión de células empobrecida en células) invierte su dirección vertical, se mueve hacia arriba con un movimiento de torbellino más fuerte aun, y abandona el hidrociclón por la salida del rebalse superior. Este líquido contiene ahora ya sólo partículas más pequeñas o más livianas.

Finalmente, la diferencia de la presión estática entre los tubos de entrada y de salida determina el movimiento de torbellino, la deposición en el campo centrífugo generado y el enriquecimiento de las partículas (por ejemplo, las células) en el rebalse inferior o su empobrecimiento en el rebalse superior.

El campo de empleo convencional de los hidrociclones es la concentración de suspensiones, en el que las partículas de grano grueso abandonan el aparato en forma de una suspensión concentrada como rebalse inferior, mientras que las partículas finas, que no pueden separarse, salen en forma de una suspensión diluida a través del rebalse superior.

En el pasado se mantuvo la opinión que los hidrociclones no pueden utilizarse de manera efectiva para la concentración de suspensiones cuando la diferencia de densidades entre las partículas y el líquido de suspensión era < 0,5 g/cm^{3}. Thew (1980) fue el primero en refutar esta opinión. Patentó un hidrociclón para la separación de líquido/líquido tal como, por ejemplo, aceite disperso en agua, en el que la diferencia de densidades entre el agua y las gotas de aceite se encuentra en el intervalo de tan solo 0,1 - 0,2 g/cm^{3}.

Las células de mamíferos, células de insectos, células vegetales, y los microorganismos son pequeñas, y su densidad se encuentra cercana a la del agua y típicamente tiene un valor de aproximadamente 1,05 g/cm^{3}. Por esta razón existe en el estado de la técnica la opinión que no es posible separar estas células con ayuda de hidrociclones a partir de suspensiones acuosas de células. En este caso se remite como ejemplo de esta opinión (errónea) a una cita documentada de Naganne et al. (1996) en su patente: "when a solution containing cells is fed to the liquid cyclone, the cells have a diameter smaller than the critical diameter so that there is no difference in concentration between the upstream and the downstream in the liquid cyclon, which makes separation of cells impossible".

Sin embargo, como muestran los siguientes ejemplos para la ilustración de esta invención, esta opinión no es acertada. La invención se basa en el reconocimiento que los hidrociclones pueden utilizarse muy bien, con un elevado grado de acción de separación, para la separación de células a partir de suspensiones acuosas de células, a saber sin afectar la viabilidad en un grado prácticamente relevante.

Otra opinión, frecuentemente expresada, es que las células de mamíferos muestran una elevada sensibilidad frente al cizallamiento. Sin embargo, conforme a la invención se comprobó que las células de mamíferos y células similares soportan muy bien los cizallamientos, en especial los que se presentan en hidrociclones, con la condición que no se sobrepase una determinada diferencia critica de presiones ni una determinada caída critica de la presión (en cada caso, presión medida mediante manómetro) entre la instalación de entrada y la instalación de salida del rebalse superior en la sección cilíndrica del hidrociclón (aproximadamente 4 bar, preferiblemente 2 bar). Es probable que esto dependa, en parte, del hecho que su tiempo de permanencia en el hidrociclón es extremadamente breve.

Según el procedimiento conforme a la invención se aporta una suspensión de células que proviene directamente del biorreactor, bajo presión, por ejemplo de hasta 4 bar, preferiblemente de 2 bar, por encima de la presión atmosférica, hacia uno o varios hidrociclones (es decir, dispuestos en paralelo entre si). Los hidrociclones utilizados pueden ser de tipo constructivo convencional. Son adecuados, por ejemplo, los hidrociclones fabricados comercialmente por la Firma Dorr Oliver Inc., como se han descrito en el Capítulo 10 del libro de Bradley (Bradley, 1965).

Si bien conforme a la invención se utilizan preferiblemente hidrociclones obtenibles en el comercio, por ejemplo los fabricados por los fabricantes antes mencionados, no existe en términos generales limitaciones especiales en cuanto al diseño o tipo. Los hidrociclones adecuados los determina la persona experta en la materia mediante ensayos sencillos y teniendo en cuenta las circunstancias prácticas. Lo único decisivo es que se logre la finalidad pretendida, a saber separar células viables a partir de suspensiones de células. Son adecuados, por ejemplo, hidrociclones con aproximadamente las siguientes características constructivas.

La longitud de la sección cilíndrica es de aproximadamente 2 a 12 mm, y su diámetro es de aproximadamente 5 a 15 mm, preferiblemente 10 mm. El ángulo en el que se estrecha la sección cónica a partir de la sección cilíndrica, se halla en el intervalo de aproximadamente 5 a 20º. Con ello se establece simultáneamente la longitud de la sección cónica. La instalación de entrada (para la suspensión de células) en la parte cilíndrica, por ejemplo un tubo correspondiente, tiene por ejemplo un diámetro en el intervalo de aproximadamente 0,5 a 4 mm, preferiblemente 2 mm. La instalación de salida del rebalse superior, por ejemplo un tubo correspondiente (tubo de inmersión), tiene, por ejemplo, un diámetro de 1 a 5 mm y se extiende, por ejemplo, en aproximadamente 1 a 6 mm en la sección cilíndrica. La instalación de salida de rebalse inferior, por ejemplo un tubo correspondiente, tiene por ejemplo un diámetro de 0,5 a 7 mm.

La alimentación (es decir, la suspensión de células a enriquecer en células), se introduce tangencialmente en la parte cilíndrica del hidrociclón, con lo que se genera una fuerte movimiento de torbellino dirigido hacia abajo y, con ello, un campo centrifugo, en virtud del cual las células son transportadas radialmente hacia fuera, llegan a la pared y abandonan el hidrociclón como rebalse inferior. La tubería del rebalse inferior se ha elegido de manera tal, o contiene una instalación de desconexión, por ejemplo una válvula regulable, con la que es posible regular el rebalse inferior de modo que una parte de la corriente de líquido invierte su dirección vertical y se transporta hacia arriba, formándose un torbellino aún más fuerte, a través de la tubería central del rebalse superior, sin arrastrar consigo ni descargar partículas ni fragmentos de célula menores.

Por supuesto, el procedimiento conforme a la invención para la separación de células a partir de suspensiones de células no solamente se puede emplear en unión con cultivos de células por perfusión y para la recolección de células, sino que es adecuado en términos generales para problemas de separación arbitrarios para los que se ofrece la utilización de un hidrociclón. Los hidrociclones utilizados pueden hacerse funcionar de manera continua, pero también con interrupción, es decir de manera discontinua. La elección exacta del tamaño del hidrociclón es importante para lograr un elevado efecto de separación (en lo que precede se han indicado a título de ejemplo características constructivas de las partes individuales del hidrociclón). En términos generales, la viabilidad de las células no se ve afectada, con la condición que no se exceda la caída crítica de presión antes indicada.

En el procedimiento conforme a la invención son también utilizables varios hidrociclones que pueden estar dispuestos o interconectados en serie o en paralelo. Puede utilizarse la conexión en serie para elevar el grado de acción de separación o el efecto de separación, es decir para lograr una concentración más fuerte de células en el rebalse inferior.

La separación conforme a la invención de células a partir de suspensiones de células con ayuda de hidrociclones tiene claras ventajas en comparación con la separación con centrifugadoras. Los hidrociclones son de producción sencilla y, por lo tanto, obtenibles a bajos precios.

La instalación de los hidrociclones es sencilla y barata, por cuanto no se requiere ninguna medida constructiva especial y sólo se necesita una superficie de instalación sumamente pequeña. El mantenimiento del estado de funcionamiento de los hidrociclones es sencillo, ya que no contienen partes en movimiento.

La velocidad de la corriente es varias veces más elevada en comparación con su tamaño, y el tiempo de permanencia de las células es correspondientemente breve. Por ello, puede esperarse que mediante el empleo de hidrociclones para la recolección de cultivos de células caigan tanto los costos de inversión como también los costos de funcionamiento, lo que también repercute en un reducido precio del producto.

Estas ventajas también surten efecto cuando para fines de comparación se recurre a filtros de membrana y a decantadores. En comparación con filtros de membrana, los hidrociclones tienen la ventaja adicional que es posible regular o ajustar de manera sencilla una velocidad o caudal constante de la corriente o del flujo para una caída de presión dada, y que es posible su funcionamiento durante meses, eventualmente incluso años, sin interrupción.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención, sin delimitarla.

Ejemplo 1

En la disposición mostrada en la Figura 3 se utilizó el biorreactor (1) para cultivar células HeLa. 95,4% de las células en la suspensión eran viables, y la suspensión de células se introdujo de manera continua en un hidrociclón Doxie (2), producido por Dorr-Oliver Inc. La caída de presión elegida dio como resultado un caudal de corriente de 36,7 cm^{3}/s, y en el rebalse inferior (3) pudo separarse el 80 % de las células, de las cuales el 95,2% eran viables. La concentración inicial de las células era del 0,43% en volumen, la concentración final alcanzada de las células en el rebalse inferior era de 0,7% en volumen, y la concentración de células en el rebalse superior (4) era de sólo 0,19% en volumen, siendo viable el 96,7% de las células.

La realización del mismo experimento con un hidrociclón de igual tamaño que el del hidrociclón Doxie, pero con distintas dimensiones geométricas, fabricado por Richard Mozley Ltd., permitió obtener una velocidad de flujo o caudal más elevada, a saber, 50 cm^{3}/s, pero con una menor retención de células en el rebalse inferior, a saber, de solo 40%. Esto significa que no sólo el tamaño del hidrociclón es importante para una buena separación, sino también sus dimensiones geométricas.

Ejemplo 2

Los hidrociclones, por ejemplo hidrociclones Doxie, también pueden utilizarse en una disposición en serie, como se representa en la Figura 4. Una suspensión de células HeLa, de las cuales el 87,2% era viable, se aportó de manera continua al primer hidrociclón (1), cuyo rebalse superior se aportó de manera continua como alimentación hacia el segundo hidrociclón Doxie, (2). En el caso de la caída de presión elegida fue posible enriquecer globalmente al 94% las células en el rebalse inferior del primer y del segundo hidrociclón, y la tasa de

\hbox{supervivencia era
de aproximadamente 89%.}

En resumen, con ello la invención se refiere a un nuevo procedimiento para la separación de células viables a partir de suspensiones de células, por ejemplo a partir de medios de cultivo biológicos, con ayuda de hidrociclones. En el caso de las células se trata preferiblemente de células (de organismos) superiores, es decir, de células de mamíferos, por ejemplo hibridomas, etc., o de células de insectos que mediante el procedimiento conforme a la invención pueden separarse o enriquecerse (empobrecerse) con una elevada acción de separación o de enriquecimiento, conservándose ampliamente la viabilidad. En comparación con otros equipos o aparatos, como centrifugadoras y filtros de membrana especiales, en funcionamiento de corrientes cruzadas, que pueden cumplir las mismas tareas, en el caso de los hidrociclones se trata de equipos sencillos, baratos, fiables y robustos. El reemplazo de sistemas conocidos para la separación y retención de células por hidrociclones reduce el capital a invertir y los costos de funcionamiento. En especial, también es posible utilizar el procedimiento conforme a la invención bajo utilización de hidrociclones, para la retención de células en cultivos de perfusión.

Citas bibliográficas

Bradley, D. (1965) The Hydrocyclone. Pergamon Press, Oxford.

Bretnei, E., patente de EE.UU. nº 453.105 (1891).

Colman, D.A. y Thew, M.T. (1980), Cyclone separator, patente de EE.UU. nº 4.237.006.

Doscolis, A., Kalogerakis, N., Behrie, L.A. y Kaler, K.V.I.S. (1997), Filter for perfusion cultures of animal cells and the like. Patente de EE.UU. nº 5.626.734.

Hawkes, J.J., Limaye, M.S. y Coakley, W.T. (1997), Filtration of bacteria and Yeast by ultrasound-enhanced sedimentation. Journal of Applied Microbiology, 82 (1), 39-47

Heiskanen K (1993) Particle Classification. Chapman & Hall, Londres.

Klima MS & Kim BH (1998) Dense-medium separation of heavy-metal particles from soil using a wide-angle hydrocyclone. Journal of Environmental Science and Health, Parte A. 33: 1325- 1340.

Kroner, K.-H. y Vogel, J. (1998). Patente Europea nº 0 815 927 A2.

Marti S, Erdal FM, Shoham O, Shirazi S & Kouba GE (1996) Analysis of gas carry-under in gas-liquid cylindrical cyclones. En: Claxton D, Svarovsky L & Thew M (eds.) Hydrocyclones'96 (páginas 399-421) Mechanical Engineering Publications, London & Bury Saint Edmunds.

Moraes CAC, Hackenberg CM, Russo C & Medronho RA (1996) Theoretical analysis of oily water hydrocyclones. En: Claxton D, Svarovsky L & Thew M (eds.) Hydrocyclones'96 (páginas 383-398) Mechanical Engineering Publications, London & Bury Saint Edmunds.

Naganu,Y., Suganuma,T, Satoh, K. y Iteda, M.(1996), Method for purification of amino acids, nucleic acids using a hydrocyclone. Patente de EE.UU. nº 5.547.858.

Peshwa, M.V. (1999), Mammalian Cell Culture. En: Demain, A.L. y Davies, J. E. (eds.) Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2ª Ed., ASM Press, Washington.

Svarovsky L (1984) Hydrocyclones. Holt, Rinehart y Wínston, Londres.

Tokashiki, M. y Yokoyarna, S. (1997), Bioreactors designed for animal cells. En: Hauser, H. y Wagner, R. (eds.), Mammalian Cell Biotechnology in Protein Production, Walter de Gruyter, Berlín.

Yhland, C.(1992), Centrifugal Separator. Patente de EE.UU. nº 5.160.310.

Zeng, A.-P. y Deckwer, W- D. (1999), Model Simulation and analysis of perfusion culture of mammalian cells at high cell density. Biotechnology Progress, 15, 373-382.

Claims (5)

1. Procedimiento para la separación de células viables de mamíferos o de insectos a partir de suspensiones de células, en el que la suspensión de células se introduce de manera continua por medio de una instalación de entrada tangencialmente en el espacio de cilindro de al menos un hidrociclón y se la deja fluir a través del cono del hidrociclón en una trayectoria de recorrido circulante dirigida hacia abajo, en forma de espiral, recolectándose en la instalación de salida de rebalse inferior del hidrociclón, situada en el extremo inferior del cono, una suspensión enriquecida en células, y recolectándose en la instalación de salida del rebalse superior del hidrociclón, dispuesta centralmente en el espacio de cilindro, una suspensión empobrecida en células, y siendo la caída de presión entre la instalación de entrada y la instalación de salida del rebalse superior a lo sumo de 4 bar, presentando el hidrociclón las siguientes característica constructivas:

sección cilíndrica:

longitud: 2 a 12 mm

diámetro: 5 a 15 mm

sección cónica:

ángulo de estrechamiento: 5 a 20º

instalación de entrada:

diámetro: 0,5 a 4 mm

instalación de salida de rebalse superior:

diámetro: 1 a 5 mm

profundidad de penetración: 1 a 6 mm

instalación de salida del rebalse inferior:

diámetro: 0,5 a 7 mm

2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que la caída de presión entre la instalación de entrada y la instalación de salida del rebalse superior es de 2 bar.

3. Procedimiento conforme a la reivindicación 2, en el que el hidrociclón presenta las características constructivas siguientes:

sección cilíndrica:

longitud: 2 a 12 mm

diámetro: 10 mm

sección cónica:

ángulo de estrechamiento: 5 a 20º

instalación de entrada:

diámetro: 2 mm

instalación de salida del rebalse superior:

diámetro: 1 a 5 mm

profundidad de penetración: 1 a 6 mm

instalación de salida del rebalse inferior:

diámetro: 0,5 a 7 mm.

\newpage

4. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones precedentes, en el que se hacen funcionar varios hidrociclones, del mismo tipo o de tipos distintos, en disposición paralela o en serie, de manera discontinua o continua.

5. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones precedentes, en el que en el caso de las células de mamíferos se trata de células sanguíneas o de hibridomas.