JP2000515122A - 保存安定性に優れた胸腺抽出物を含む薬学的組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、免疫調節特性および抗炎症特性を示し、かつ保存に際して安定である胸腺因子の薬学的組成物を調製する方法に関する。当該方法は、ホモジナイズされた胸腺組織の抽出、およびその後の３０ｋＤの排除体積を有するフィルタ膜による反復限外濾過を含む。得られた第一の限外濾液を、その後、３ｋＤの排除体積を有する膜で第二の限外濾過処理を行い、その残留物を使用した。このようにして調製された組成物は、得られた第一の限外濾過物と比較して、植物性赤血球凝集素により刺激した白血球培養物に対して、抗炎症性ＩＬ-１０の産生の著しい増加を示し、炎症促進性ＩＬ-２およびＩＦＮ-γの生成の減少を示した。

Description

【発明の詳細な説明】 保存安定性に優れた胸腺抽出物を含む薬学的組成物 説明 本発明は、胸腺抽出物から得ることができ且つ保存安定性に優れた、免疫調節 特性および炎症抑制特性を有する薬学的組成物に関する。 胸腺からの薬学的製剤の製造は公知で、文献において多くの側面から記載され ている。このような抽出物はいわゆる胸腺因子を含有し、これは胸腺から産生さ れたペプチドを含んでいる。多くの事例において、これらの構造および機能はま だ完全には明らかにされていない。しかし、胸腺因子はＴリンパ球の成熟、並び にリンパ組織によるＴリンパ球の増殖を引き起こすことが知られている。加えて 、胸腺因子は移植された組織の拒絶反応、並びに自己免疫疾患に基本的な役割を 果たすことも知られている。従って、胸腺因子が本発明の主題である。 胸腺因子またはペプチドは、一般的にサイモシンと呼ばれ、この中で、サイモ スティムリンおよびサイモポイエチン、サイモシン-α-１、サイモイシン-β-４ がおそらく最もよく研究されている。例えば、サイモシン-α-１およびサイモイ シン-β-４は、マクロファージに対する抗原提示作用を増強することが知られて いる。この理由により、これらは自己免疫疾患の治療に使用され、また他の用途 、特に免疫機構の欠陥（例えば癌およびアレルギー）の治療のためにも使用され る。 胸腺ペプチドの調製および抽出は公知であり、例えば、T.L.K.Low and A.L.Go ldsteinによる「酵素学における方法」、Vol.116、p.213（1985）に記載されて いる。更に、これら「生成物」は、sanorell pharma GmbH and Co.、Rechtmurgs tr.27、D-72270 Baiersbronnから、例えば、名称Thymosand（登録商標）で入手 することができる。 しかし、抽出により得られた水性の胸腺抽出物の保存は制限される。従って、 薬学的に活性な部分ペプチド、例えば、サイモポイエチンのアミノ酸３２〜３６ のペンタペプチド、並びにその類縁体を合成により製造しようとする試み もなされている（Justus Liebigs Ann．Chem．1990,245-247）。 従って、本発明は、保存に際して安定で、かつ顕著な抗炎症効果、並びに免疫 調節作用を備えた、胸腺因子の薬学的に使用可能な混合物を入手する目的を有す る。 本発明によれば、この目的は、それ自体公知の方法でホモジナイズした胸腺組 織を水溶液により抽出し、固形の構成成分を該抽出物から分離し、この抽出物を ３０ｋＤの排除体積を有する限外濾過膜により濾過することにより達成される。 本発明による方法は、更に、得られた３０ｋＤの限外濾過物を、３ｋＤの排除体 積を有する限外濾過器により少なくとももう一回濾過を行い、その残留物を使用 するという事実を特徴とする。 驚くべきことに、3000ダルトンの排除体積を有する膜による限外濾過によって 、明らかに不安定化因子をもたず、かつその免疫調節特性を有し、さらに顕著な 抗炎症特性または炎症抑制特性を示す残留物が得られろことが示された。 本発明の方法に必要な胸腺細胞は仔ウシから採取され、除去後速やかにさらに 処理される。ホモジナイズされた組織の調製品は当業者に知られており、例えば 、商業的に入手可能なホモジナイザーおよび／または超音波処理により製造する ことができる。該ホモジネートは少なくとも１０時間、適切には少なくとも２０ 時間、２-６℃で、通常３-５℃で自己消化を施すのが好ましい。このホモジネー トの抽出は水または水溶液により行うが、該溶液は、必要に応じて中性もしくは 生物学的に普通のｐＨ範囲にｐＨ緩衝することができる。このように得られた抽 出物は、未だ固形の構成成分を含んでおり、例えば遠心または適切には大きな孔 （２．０μｍ、０．８μｍ、０．２μｍ）を有するフィルタで濾過することによ り、この固形成分を分離する。必要ならば、硫酸アンモニウムを用いて追加の分 離または精製工程を行うことができ、さらに例えばフェノールを用いた他の処理 を（これら処理が必要な限り）行うこともできる。 次に、固形の構成成分を含まない抽出物を、排除体積３０ｋＤの膜による第一 の限外濾過にかける。これには、好ましくは親水性膜、例えばセルロース膜およ びポリスルホン膜、特にらせん膜を横断流(transverse flow)で使用する。この ような膜は公知で、例えばAmicon社により「Ｓ１Ｙ３０」の商品名で販 売されている。好ましくは、本発明による方法に従って、この第一の限外濾過の 工程を数回、詳細には少なくとも３回、適切には少なくとも５回行う。本発明に よれば、ＷＯ ９１/１２，０２７に記載された方法に従ってここで使用した濾過 膜の有効性を実証し、またＷＯ ９３/０２，７１４に従って濾過膜の完全性を調 べることが適切であることが証明された。このようにして、医療目的および生物 学的目的にとって有効な、胸腺因子を含む第一の限外濾液が得られた。 この限外濾液について、３ｋＤの排除体積を有する膜を用いた第二の限外濾過 が、好ましくは更に数回行われ、詳細には少なくとも３回、好ましくは少なくと も５回行われた。この第二の濾過工程に好ましい限外濾過膜は、例えば、Amicon 社からＳ１Ｙ３の商品名で商業的に入手可能である。更に、この後者の限外濾過 の工程を、いわゆる透析濾過（diafiltration）として、即ち反復濾過として行 うのが適切であることが証明された。これにより、透析と類似の方法で、フィル タに濾液を繰り返し通過させながら、望ましくない構成成分が洗い出される。こ のようにして、さらに何もすることなく、抽出溶液に混入した物質（例えば緩衝 液の塩）を分離し、また他の添加物で置換することが可能である。本発明によれ ば、３ｋＤの膜を用いた第二の限外濾過によりフィルタ上に濃縮された残留物を マンニトール溶液で稀釈すること、およびこの濾過を繰り返すことが好ましい。 このようにして、抽出溶液は単純な方法で再度緩衝能を得ることができる。この ようにして本発明に従って得られた残留物は、さらに何もすることなく、その生 物学的活性を保持したまま凍結乾燥することができる。 本発明は更に、上記方法により得られた薬学的組成物、並びに免疫調節および 抗炎症作用を備え且つ保存安定性に優れた薬剤の製造のための当該組成物の使用 に関する。 次に、以下の例に基づいて本発明をより詳細に説明する。 例１ 以下では、sanorell pharma GmbH ＆ Co.、Rechtmurgstrasse 27、Balersb ronn（ドイツ）からThymosand（登録商標）の商品名で商業的に入手可能な胸腺 抽出物（ＵＦ５）を使用した。この胸腺抽出物は、ＷＯ ９１/１２，０２７に記 載された有効な膜を用いて固形物を除去した後、製造業者により既に５回限外濾 過され、または精製されたものである（ＵＦ５）。この商業的に入手可能な調製 品を、その後、コンセントレーターＣＨ２（Amlcon、P.O.Box 1103、Witten、 ドイツから入手可能）により１０倍（２００ｍＬ）に濃縮した。このコンセント レーターＣＨ２は、供給管と、ホースポンプと、Amicon社からＳ１Ｙ３の商品名 で得られるDelrinヘッドピース付きの限外フィルタ上の限外フィルタマウントを 具備する。このようにして得られた濃縮物を、その後、５％マンニトール溶液に より５倍体積に稀釈し、次いで再度元の体積に濃縮した。この方法を全部で５回 繰り返した。この限外濾液を捨て、高濃度で胸腺ペプチドを含むフィルタ上の残 留物を滅菌濾過（０．２μｍ）し、次いで凍結乾燥した。このようにして得られ た凍結乾燥物を以下ＴＭＬと呼ぶ。驚くべきことに、このＴＭＬは初期産物とは 対照的に、室温で保存したときさえも数年間安定であることが示された。 例２ 800μｇ／ｍＬのタンパク質濃度（ローリー法）を有する溶液を、例１で得ら れたＴＭＬ凍結乾燥物から調製した。血液細胞に対するその生物学的活性を、Ha rtungら（Hartung，T.,A.Sauer and A.Wendel,Biochem.Pharmakol.Univ.Konstan z:全血液のサイトカイン応答;25^thAnnual Conference of the Society for Immu nology,９月1994;ポスター）の方法に従って測定した。こうして、植物性赤血球 凝集素（ＰＨＡ）での刺激後に、全血液のバッチ培養中のリンパ球からのサイト カイン放出を測定した。 この報告で記載したアッセイは、ＰＨＡおよびＴＭＬまたは刺激物質としての 透過物(permiate)、並びに対応する陰性コントロールまたは陽性コントロールを 使って行った。サイトカインIL-１β、IL-２、IL-６、IL-１０：ＴＮＦ-αおよ びＩＦＮ-γを測定した。 材料および方法 血液採取：クエン酸塩を含む血液（Monovette,Sarstedt） 培養バッチ：ふた付き４穴培養皿（４×１ｍＬ）（Nunc;Art.No.:176740） 培養バッチは、血液採取後少なくとも４時間で調製した。 処理：試料チューブ（Sarstedt,Art.No.:60036550） 卓上遠心機ＥＢＡ ３Ｓ（Hettich） サイトカイン測定：Quantikine Kits（Elisa of R＆DSystems GmbH,Borsigstr.7 ,65205 Wiesbaden） マイクロブレートフォトメーターＨＴIII（Anthos） ＲＰＭＩ培地の生成（層流下）：900ｍＬの注射用の水を滅菌された２Ｌのエ ルレンマイヤーフラスコ中に入れ、一包みの粉末状ＲＰＭＩ-1640（AutoMod、Si gma:Art.No.:R7755）を攪拌しながら加えた。その後、１０ｍＬの２００ｍＭＬ- グルタミン溶液（Sigma Art.No.:6-7513）を加えた。 238.3ｍｇのＨＥＰＥＳ（Sigma;Art.No．:H-0878）を滅菌された小ガラスビー カーに量り分け、少量の水に溶解し、ＲＰＭＩ溶液に加えた。透明なＲＰＭＩ溶 液を滅菌されたメスシリンダーに入れ、これを、注射用の水でＲＰＭＩ容器、小 ガラスビーカーおよびエルレンマイヤーフラスコを洗いながら１０００ｍＬに満 たした。最終溶液を１Ｌの滅菌瓶中に入れて＋４℃で貯蔵し、１ケ月間維持する ことができた。 ＲＭＰＩ培地＋ＰＨＡの調製（層流下）：1.875ｍｇのＰＨＡ（Sigma;Art.No. :L9132）を滅菌された100ｍＬのメスフラスコに量り分け、目盛りマークまでＲ ＰＭＩ培地を満たした。この溶液を短時間充分に攪拌し、滅菌ストッパーおよび 密封部を備えた30ｍＬの滅菌バイアルに30ｍＬずつ分注した。滅菌済みの使い捨 てシリンジまたはカニューレで溶液を移した。 層流下での全血液バッチの調製：４穴培養皿を使用した。最終濃度は以下のと おりである：ＰＨＡ、15μｇ／ｍＬ、ＴＭＬ 806μｇ／ｍＬおよびＵＦ５／Thym osand（登録商標）、50μｇ／ｍＬ。培養バッチは（培養皿の１穴に対して）個 々に以下の構成成分から成り、これを培養皿の穴に直接ピペットで移した。 陰性コントコール：200μＬの血液、522μＬの培地、278μＬのＰＢＳまたは マンニトール 陽性コントロール：200μＬの血液、522μＬの培地＋ＰＨＡ、278μＬのマン ニトール溶液（刺激物質／マンニトール容量平衡） ＴＭＬサンプル：200μＬの血液、522μＬの培地＋ＰＨＡ、278μＬのＴＭＬ （刺激物質＋ＴＭＬ） Thymosand試料：200μＬの血液、522μＬの培地＋ＰＨＡ、278μＬのThymosan d（lot No.4019550） バッチを２４時間、密閉蓋付きの培養皿で、ＣＯ₂を含む雰囲気の＋３７℃の インキュベーション室でインキュベートした。 ＜培養バッチの加工＞： 血清上清を得るために血液試料を遠心し（１０分；5600rpm）、410μＬまでの 目盛り付きサンプル管に各々分注し、−７０℃で貯蔵した。 ＜サイトカイン測定＞ サイトカインIL-１β、IL-２、IL-６、IL-１０、ＴＮＦ-αおよびＩＦＮ-γを 、製造業者Ｒ＆Ｄ Systemsのテスト説明書に従って、血清上清から測定した。各 測定に対して２回測定を行った。統計学的に有効な値を得るために、各サイトカ インに対して、新しいスタンダードシリーズを使って各時間、３回測定を行い、 その結果、一つのサイトカイン（IL-２を除く）あたり各サンプルについて６つ の測定値を得た。 添付の図１-１０から以下の結果を導き出すことができる。 植物性赤血球凝集素は、細胞培養において発熱反応を刺激する合成薬剤として 使用される。図から明らかなように、全ての場合において植物性赤血球凝集素の 存在は、サイトカインレベルの増加を引き起こす。本発明により得られたフィル ター残留物ＴＭＬは、ＰＨＡで刺激された細胞培養中のリンパ球でのインターロ イキン-10の産生（IL-１０）の顕著な増加を引き起こした（図２）。IL-１０は プロスタグランジン-Ｅ２の合成を阻害するため、この結果は炎症抑制効果に相 当する。これに対して、炎症促進性インターロイキン-２（IL-２）の生成（図４ ）、並びに炎症促進性ＩＦＮ-γの生成（図３）は、ＰＨＡ で刺激された白血球で減少する。３０-ＫＤの膜のみで濾過し、３-ＫＤの膜で濾 過していない組成物（ＵＦ５／Thymosand）は、インターロイキン-１０の産生の 低下を引き起こす（図１）。ＴＮＦ-αの分泌は、ＴＭＬ分画によりさらに約１ ３０％まで増加するが（図６）、低分子構成成分を除去していないThy mosand分 画は、ＰＨＡで刺激された細胞でのＴＮＦ-α分泌の約４５％まで低下する（図 ５）。 IL-６の分泌は、ＴＭＬにより約２３０％まで増加するのに対して、Thymos an d（ＵＦ５）は約７５％の低下を引き起こす（図７および図８）。 インターロイキン−１βの分泌は、ＴＭＬ分画（ＴＭＬ残留物）により約２３ ０％まで増加するが（図１０）、IL-１βの分泌は、対照的に、ＵＦ５調製品（T hymosand）を用いると６０％まで減少する（図９）。 この結果は驚異的である。何故なら、ＴＭＬにおける個々のペプチド分画また は胸腺因子の量比は、Thymosand初期産物の場合と変わらないからである。 室温においてさえ、何年もの間安定なままであり、しかも高濃度で（Thymosan dの濃度の100倍まで）調製することが可能な組成物が、本発明よる方法で獲得さ れた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．免疫調節特性および炎症抑制特性を備え、且つ保存に際して優れた安性定 を有する胸腺因子の薬学的組成物を製造する方法であって、ホモジナイズされた 胸腺組織を水溶液により抽出することと、該抽出液から固形の構成成分を除去す ることと、第一の限外濾過物を得るために、固形成分を除去した前記抽出液に、 ３０ｋＤの排除体積を有するフィルタ膜を用いた第一の限外濾過を少なくとも１ 回行うこととを具備し、この第一の限外濾過によろ濾液に対して、３ｋＤの排除 体積を有する限外フィルタを用いた第二の濾過を少なくとももう１回行った後、 その残留物を使用することを特徴とする前記薬学的組成物の製造方法。 ２．前記残留物をマンニトール水溶液と混合し、３ｋＤの排除体積を有する限 外フィルタで少なくとも１回の透析濾過を行うことをさらに特徴とする請求項１ 記載の方法。 ３．第一の限外濾過を３０ｋＤの排除体積を有するフィルタで３〜７回行うこ とをさらに特徴とする請求項１または２記載の方法。 ４．透析濾過をマンニトールで３〜７回行うことをさらに特徴とする請求項２ または３記載の方法。 ５．固形粒子を、孔サイズ１〜３μｍを有するフィルタにより除去することを さらに特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。 ６．第一の限外濾過のためのフィルタの有効性を、Leviviridaeウイルスを用 いて実証することをさらに特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項記載の方 法。 ７．第二の限外濾過で得られた残留物を凍結乾燥することをさらに特徴とする 請求項１ないし６のいずれか１項記載の方法。 ８．請求項１ないし７のいずれが１項記載の方法に従って得られる薬学的製剤 。 ９．請求項１ないし７のいずれか１項記載の方法に従って得られる組成物の、 免疫調節特性および抗炎症特性を有し且つ保存安定性の優れた薬剤を調製するた めの使用。