HUP0103429A2

HUP0103429A2 - Eljárás leukociták folyamatos tisztítására és betöményítésére vérből

Info

Publication number: HUP0103429A2
Application number: HU0103429A
Authority: HU
Inventors: Mats Jarekrans
Original assignee: Bionative Ab
Priority date: 1998-03-26
Filing date: 1999-03-23
Publication date: 2002-01-28
Also published as: HK1035210A1; AU3447099A; HUP0103429A3; DK1078041T3; DE69920209D1; EP1078041A1; HU228495B1; WO1999049016A1; ES2224631T3; EP1078041B1; US6743624B1; DE69920209T2; ATE276356T1

Abstract

A találmány tárgya új eljárás és készülék leukociták folyamatostisztítására és betöményítésére vérből, előnyösen a buffy coatfrakcióból. Az eljárást az alábbi lépésekben hajtják végre: (a) aplazmát a vértől szűréssel elkülönítik azért, hogy egy szűrt buffycoat frakciót kapjanak; (b) az (a) lépésben nyert buffy coatfrakcióhoz adnak egy a plazmához képest hipotóniás vizes oldatotazért, hogy a buffy coat frakcióban levő eritrocitákat elroncsolják;(c) a (b) lépésben előállított buffy coat frakció és vizes hipotóniásoldat keverékét egy keverőben összekeverik; (d) a (c) lépésbenelőállított elegyet egy átfolyó elegyítőedényen keresztül vezetik; (e)a (d) lépés után a leukociták elválasztása céljából az elegyetátvezetik egy centrifugán; (f) az (e) lépésben különített leukocitákatkinyerik. A leukocitákat interferon előállítására használják. Ó

Description

) KÖZZÉTÉTELI .............

PÉLDÁNY r ·:· :··’ ELJÁRÁS LEUKOCITÁK FOLYAMATOS TISZTÍTÁSÁRA ÉS BETÖMÉNYÍTÉSÉRE VÉRBŐL

A találmány tárgya új eljárás és készülék leukociták folyamatos tisztítására és betöményítésére vérből, előnyösen a buffy coat frakcióból. A leukocitákat interferon előállítására használjuk.

Az interferonok endogén eredetű, kisméretű proteinek immunológiailag aktív csoportja, amelyek a vírusfertőzések elleni természetes védekezésben játszanak szerepet. A leukocitákat a vírusfertőzést követően a gerincsejtek állítják elő és választják ki. Az interferonok a szervezet egyéb sejtjei plazmamembránjához kötődnek és vírusokkal szemben ellenálló állapotba hozzák őket azáltal, hogy három enzim, egy oligonukleotid szintáz, egy endonukleáz és egy kináz termelését fokozzák. A korszerű orvosi gyógyászati gyakorlatban az interferonokat tartalmazó készítményeket fertőzések, különösen vírusos fertőzések elleni kezelések során alkalmazzák, valamint olyan célból is, hogy a beteg immunrendszerét általában aktiválják.

Az interferonokat jelenleg három különböző módszerrel állítják elő: rekombináns módszerrel, sejtvonalból és humán leukocitákból. A humán leukocitákból származó interferon termékeket további két csoportra, részben tisztított és nagymértékben tisztított termékekre oszthatjuk. A találmány

93022-2636B-BÉ/BB/fa

-2szerinti eljárás különösen nagymértékben tisztított, humán leukocitából származó interferonra vonatkozik.

A humán leukocitából származó interferon nagyléptékű előállítását általában a Kari Cantell és mtsai. által a Cantell, K.; Hirvonen, S.; Kauppinen, H.-L.; és Myllyla, G. Production of interferon in human leukocytes from normal donors with the use of Sendai virus, in Methods in Enzymology, 78, 29-38 (1981) helyen valamint a Cantell, K.; Hirvonen, S. és Koistinen, V. Partial purification of human leukocyte interferon on a large scale, in Methods in Enzymology, 78, 499-505 (1981) helyen ismertetett módon végzik. A Cantell szerinti módszert a következőképpen lehet összefoglalni: egészséges donoroktól származó kevert buffy coat frakciót felszuszpendálnak hideg 0,83 %-os ammónium-klorid oldatban, majd a szuszpenziót centrifugálják. Ebben a lépésben a leukocitákat tisztítják és elválasztják a többi vérsejttől. Ekkor a leukocitáknak körülbelül 30 %-a elvész. A leukocitákat elkülönítik és módosított Eagle minimáltáptalajban (minimal essential medium, MEM) inkubálják. A továbbiakban a szuszpenziót előkészítő interferonnal (priming interferon) érzékenyítik, majd az interferontermelés iniciálása céljából Sendai vírussal inokulálják. A kinyert nyers interferont összegyűjtik, az interferont kicsapják, és tovább tisztítják.

A vérből történő előállítás során az véralvadás meggátlására alvadásgátlót lehet a vérhez adni, hogy a vért folyékony állapotban tartsuk. Ha az ily módon kezelt vért nyugalomban hagyjuk, a sejtek fokozatosan leülepednek, mivel sűrűbbek mint a plazma; a vörösvérsejtek ülepednek a fenékre,

-3a fehérvérsejtek és a vérlemezkék a vörösvérsejtek felett egy vékony fehér réteget alkotnak (buffy coat), és a plazma képezi a tartályban a legfelső fázist.

A leukocita előállítás lépéseit még most is a legtöbbször adagonként, kézimunkával kezelt laboratóriumi lombikok és megfelelő eszközök alkalmazásával végzik. A léptéknövelést eddig csak az alkalmazott lombikok és centrifugák számának és természetesen az ezeket kezelő személyzet létszámának a növelésével érték el. A jelenlegi technika alkalmazásával végzett interferontermelés a munkaintenzív eljárásokra jellemző tipikus hátrányokkal jár, amelyek a magas bérköltség, a rossz reprodukálhatóság, a hozamok változékonysága, stb. Mindenesetre, a jelenlegi eljárások többségét a rendelkezésre álló laboratóriumi eszközök és módszerek jobb kihasználásával igyekeztek javítani.

A találmány célja ezeknek a hátrányoknak a kiküszöbölése, magasabb hozamok elérése, a reprodukálhatóság javítása és a bérköltségek csökkentése. Továbbá, a találmány célja a léptéknövelés megkönnyítése, valamint a folyamat magasabb fokozatú GMP (Good Manufacturing Practice) minősítésének az elérése.

A találmány szerinti eljárás a szabadalmi igénypontokban leírt módon kínál megoldást a hagyományos előállítási módszerek fent említett problémáinak és hiányosságainak a kiküszöbölésére. A találmány szerinti eljárás előnyei közé tartozik például az, hogy automatizálható, amely a reprodukálhatóságot fokozza, csökkenti a az emberi beavatkozás igényét és csökkenti a bérköltségeket. Továbbá, a

-4találmány szerinti eljárás léptékét könnyű növelni és nagyobb termékvolumenekhez adaptálni.

Az alábbiakban részletesebben ismertetjük a találmányt, amelyet a következő ábrákkal szemléltetünk:

Az 1. ábra a találmány szerinti eljárás lényegét mutatja blokkdiagram formájában;

A 2. ábrán látható műveleti vázlat a találmány szerinti automatizált leukocita tisztítási folyamatot illusztrálja.

Váratlanul azt tapasztaltuk, hogy egy folyamatos és automatizált eljárást lehet a leukociták tisztítására és betöményítésére alkalmazni. A találmány tárgya tehát eljárás leukociták folyamatos tisztítására és betöményítésére vérből. Az eljárás a következő lépésekből áll:

(a) a plazmát szűréssel elkülönítjük a vértöl és ily módon egy szűrt buffy coat frakciót kapunk;

(b) a plazmához képest hipotóniás vizes oldatot adunk az (a) lépésben nyert buffy coat frakcióhoz azért, hogy a buffy coat frakcióban levő eritrocitákat szétroncsoljuk;

(c) a buffy coat frakciót és a (b) lépésben alkalmazott hipotóniás vizes oldatot egy keverőkészülékben keverjük;

(d) a (c) lépésben nyert keveréket egy átfolyó elegyítöedényen keresztül vezetjük;

(e) a (d) lépésben nyert keveréket a leukociták elválasztása céljából centrifugáljuk;

(f) az (e) lépésben elválasztott leukocitákat gyűjtjük.

A találmány további tárgya berendezés vérből származó leukociták folyamatos tisztítására és betöményítésére. Ez a berendezés a következő eszközökből áll:

-5(i) membránszűrő a plazmának a vértől való elválasztására szűréssel, szűrt buffy coat frakció előállítására; (ii) statikus keverő a buffy coat frakció és a hipotóniás vizes oldat keverésére, a buffy coat frakcióban levő eritrociták roncsolására (lízisére);

(iii) átfolyó elegyítőedény;

(iv) centrifuga a leukociták elválasztására.

Az 1. ábrán látható blokkdiagrammon a találmány szerinti első lépés a plazmának a vértől való elválasztása szűréssel. Az ismert módszerek szerint a plazmát általában centrifugálássai választják el a vértől, amelynek eredményeképpen a plazma szétesett eritrocitákkal szennyezetté válik, és így a plazma frakció a továbbiakban már nem használható (lásd a 4 294 824 számú amerikai szabadalmi leírást). A centrifugálás alkalmazása szűrés helyett magasabb beruházási költségekkel, nagyobb szervizigényességgel, valamint magasabb higiéniai és tisztítási követelményekkel jár. A találmány szerinti eljárás során a plazmát szűréssel választjuk el a vértől, majd az elválasztott buffy coat frakcióban levő eritrocitákat elbontjuk. A találmány egy előnyös megvalósítása szerint az eljárás a kereskedelemben kapható, vérbankoktól származó buffy coat frakcióból indul ki. Ezt a buffy coat frakciót szűréssel elválasztjuk az azt tartalmazó plazmától. Az így nyert plazma tiszta és más célokra felhasználható. Meglepetve tapasztaltuk, hogy a plazma szűréssel végzett elválasztása során egy folyamatos eljárás vált lehetővé, amelyet nagyvolumenű termelésig lehetett fejleszteni. A hagyományos centrifugálásos elválasztással nem

-6lehetett léptéknövelést végrehajtani. A centrifugálási lépés nagyobb léptékben alkalmazva roncsolta az eritrocitákat, és ezáltal szennyezte a buffy coat frakciót és a plazmát. Nagyvolumenű szűrés esetén az eritrociták változatlanok maradtak a buffy coat frakcióban, így az elválasztott plazmát további célokra lehet használni.

Az eljárásban a szűrés paraméterei oly módon vannak kiegyensúlyozva, hogy sűrű, koncentrált leukocitákat tartalmazó buffy coat frakciót és ezzel egyidöben tiszta, amennyire csak lehetséges színtelen plazma frakciót kapjunk. A plazma frakciót más eljárások kiindulási anyagaként lehet alkalmazni, mert tiszta és nem tartalmaz adalékokat. A találmány egyik megvalósítása szerint a plazma és a leukociták elválasztására membránszűrőt alkalmazunk. Az alkalmas szűrök pórusmérete 0,1 - 1,0 pm, előnyösen 0,4 - 0,6 pm. Egy másik megvalósítás szerint a szűrést üreges rostok alkalmazásával végezzük, amelyek a találmány szerinti eljárás kivitelezésére és a találmány szerinti készülék vagy rendszer részeként alkalmasak.

A buffy coat frakcióban levő eritrociták szétroncsolása céljából a buffy coat frakciót a plazmához képest hipotóniás oldattal, például vizes, például 0,8 - 0 tömeg/térf.% koncentrációjú vagy előnyösen 0,8 tömeg/térf.% koncentrációjú ammónium-klorid oldattal keverjük, de alacsonyabb koncentrációk alkalmazása esetén a roncsolási időt csökkenteni kell. A hipotóniás oldat áramlási sebessége előnyösen kétszerese a buffy coat frakció áramlási sebességének. Hatékony elegyedés elérése céljából a buffy

-7- .· ·: :.. ···:

·· «····· ·· coat frakció és például az ammónium-klorid oldat keverékét egy statikus keverön, majd ezt követően egy átfolyó elegyítőedényen vezetjük át. Az átfolyó elegyítőedény az áramlás/térfogat arány figyelembevételével olyan kialakítású, hogy az alkalmazott hipotóniás oldat tulajdonságaitól és a hőmérséklettől függően körülbelül 0,5 - 10 perc tartózkodási időt érjünk el, amelynek során az oldat az egész edényben homogenizálódik. Az átfolyó elegyítöedény úgy van kialakítva, hogy a retenciós idő 5-10 perc legyen ammónium-klorid alkalmazása esetében, és a legelőnyösebben 10 perc legyen hideg, 0,8 tömeg/térf.% koncentrációjú ammónium-klorid alkalmazása esetében.

Ezt követően, a buffy coat frakció és az ammónium-klorid oldat elegyét a leukociták elválasztása céljából egy folyamatos centrifugába vezetjük. A centrifuga lehet folyamatos vagy félfolyamatos működésű, higiéniai szempontok szerint tervezett készülék, amelyet szétszerelés nélkül lehet fertőtleníteni (Sanitation-ln-Place, SÍP) és tisztítani (Clean-ln-Place, CIP). Ebben a lépésben a centrifuga alkalmazása az elválasztásra a nagyléptékű eljárás során nem okoz problémát, mert az eritrocitákat a roncsolással már eltávolítottuk.

A további eljárás tartalmazhat egy második eritrocita roncsolási lépést is. Végül, a tisztított és koncentrált leukocitákat, az ún. sejtszuszpenziót, egy inkubációs edénybe továbbítjuk, ahol az interferontermelést a Sendai vírus hozzáadásával indukáljuk. Az interferontermelést előnyösen egy bioreaktorban hajtjuk végre. A bioreaktor alkalmazásának előnye az inkubálás céljaira abban áll, hogy az inkubációs

-8lépést jobban lehet szabályozni, könnyebb léptéket növelni, és a SÍP és CIP műveleteket könnyebb végrehajtani. A korábban ismertetett lépésekkel együtt ez a megoldás összetettebb eljárás, amely könnyebben adaptálható az interferon ipari léptékű előállítására.

A találmány előnyös megvalósítása szerint az alkalmazott vér emberi vér.

PÉLDÁK

1. Példa

A szokásos termelési adagból származó buffy coat frakciót tartalmazó műanyag tömlők tartalmát külön-külön kiürítjük. Az adott frakciónak a felét egy külön edénybe öntjük (2. ábra, a), és a 2. ábrán látható kísérleti eljárással dolgozzuk fel, a másik felét pedig az ismert gyártási eljárással dolgozzuk fel. A kísérleti eljárás során a plazmát megfelelő rostátmérőjű és pórusméretű üreges rostokon át szűrve (b) választjuk el. A szűrt plazmát frakcionáljuk, és a 280 nm-nél (Azbo) legmagasabb abszorpciójú frakciókat félrerakjuk a későbbi funkcionális tesztek céljaira (ennek eredményeit a 2. táblázat mutatja). A legmagasabb abszorpciójú plazma frakciót olymódon különítjük el, hogy a szűrés során az abszorpciót 280 nm-nél folyamatosan mérjük egy UV spektrofotométerrel (c), és amikor az abszorpció elér egy meghatározott értéket, a (d) szelep automatikusan megnyílik a plazmát tároló edény (e) irányába. A spektrofotométert (c) a plazmában levő szétroncsolt eritrociták mennyiségének mérésére is használjuk. Amikor az eritrociták például mechanikai erő hatására

-9roncsolódnak, akkor felszakadnak, és a plazma a szabad hemoglobin miatt vöröses színű lesz. Ha a szűrt plazma valamilyen ok következtében vöröses színű lesz, akkor az elszíneződött frakciót eldobjuk abban az esetben, ha a spektrofotométer által mért elnyelés (abszorpció) elér egy előre meghatározott, körülbelül 410 nm értéket. Mikor az elnyelés eléri az előre meghatározott 410 nm értéket, akkor a (d) szelep automatikusan megnyílik az (f) hulladékgyűjtő irányba.

Amint a fentiekben említettük, a mechanikai erők képesek szétroncsolni az eritrocitákat. Az eritrociták szétroncsolásának egyik módszere az, hogy az oldatot nagy nyomással préseljük az üreges rostokba. Ennek érdekében az adagoló nyomását automatikusan szabályozzuk olymódon, hogy a nyomást egy (g) nyomásérzékelővel mérjük, és a (h) pumpa működését a mért nyomás függvényében automatikusan oly módon szabályozzuk, hogy az adagolási nyomás álladó, körülbelül 0,4 bar értékű legyen.

Miután a plazmát elválasztottuk, a leukocita frakció és az ammónium-klorid egy keverőkamrába folyik, ahol ezeket statikus keverővei összekeverjük. A leukocita frakció áramlási sebességét az első áramlásmérővel (j) mérjük. A 0,8 tömeg/térf.% koncentrációjú ammónium-klorid oldat áramlási sebességét a második áramlásmérővel (j) mérjük. Mivel a leukocita frakció áramlási sebessége szűrés során változhat, ezért a 0,8 tömeg/térf.% koncentrációjú ammónium-klorid oldat áramlási sebességét a leukocita frakció áramlási sebességének megfelelően automatikusan szabályozzuk. Az

- 10ammónium-klorid oldat áramlási sebessége kétszerese a leukocita frakció áramlási sebességének. A keverék oldatot ezután egy (k) statikus keverőbe továbbítjuk, ahol a két oldatot tökéletesen összekeverjük. Az elegy ezután folyamatosan az (I) átfolyó elegyítöedénybe folyik. Az átfolyó elegyítőedényben a tartózkodási idő 10 perc, amely a mérések szerint elegendő a roncsoláshoz. Az átfolyó elegyítőedényből a roncsolt sejteket tartalmazó elegy egyenesen a 3000 fordulat/perc fordulatszámmal forgó félfolyamatos centrifugába jut (m). A centrifugát szakaszosan ürítjük. Az így kapott sejteket még egyszer roncsoljuk és egy közegben szuszpendálva sejtszuszpenziót kapunk.

100 ml-es inkubációs lombikokba vagy 3 literes laboratóriumi fermentorokba helyezünk adott mennyiségű sejtszuszpenziót azért, hogy összehasonlítsuk az ismert eljárással előállított sejteket a kísérleti eljárással előállított sejtekkel. Az interferon mennyiségét az inkubált lombikokban és a laboratóriumi fermentorokban ELISA technikával mérjük.

Az ismert eljárás alkalmazásával a plazma frakcionálását a buffy coat frakció centrifugálásával végezzük. A centrifugálást 1 literes műanyag palackok alkalmazásával végezzük. A roncsolás egy edényben történik, amelyben a leukocita frakciót és a 0,8 tömeg/térf.% koncentrációjú ammónium-klorid oldatot összekeverjük és 10 percen át állni hagyjuk. Az ezt követő centrifugálási lépést ugyancsak 1 literes műanyag palackok alkalmazásával végezzük.

-11 1. Táblázat A kísérletekben elért interferon hozam

	Hozzáadott menynyiség (ml)	Sejtkonc. (.10⁷sejt/ ml)	ELISA IU/ml⁴	Hozam/ sejt (10'³lU/sejt)	Hozam (%)	Hozam/ sejt II (%)	Ossz. hozam
961009
(T)¹	1,5	0,8	32000	4	100	100	100 %
(R)²	1,5	0,8	32000	4
961023
(T)	1,1	1	41000	4,1
(T)	1,1	1	47000	4,7	85	90	155 %
(R)	2	1	52000	5,2
(R)	2	1,1	51000	4,6
961030
(T)	1	0,8	42000	5,3
(T)	1	0,8	43000	5,4
(R)	1	0,8	46000	5,8
(R)	1	0,8	46000	5,8
(T)	1,5	1,1	61000	5,5
(T)	1,5	1,1	54000	4,9	91	91	91 %
(R)	1,5	1,1	65000	5,9
(R)	1,5	1,1	64000	5,8
96114
(T)	1	1,1	38000	3,5
(T)	1	1,1	37000	3,4
(T)	1,5	1,7	56000	3,3

- 121. táblázat folytatása

(T)	1,5	1,7	56000	3,3	84	82	84 %
(R)	1	1,1	42000	3,8
(R)	1	1,1	46000	4,2
(R)	1,5	1,6	70000	4,4
(R) ' --------------	1,5	1,6	64000	4
961121
(T)	1,5	1,1	58000	5,3
(T)	1,5	1,1	53000	4,8
(T)	2	1,5	73000	4,9
(T)	2	1,5	66000	4,4	139	94	196 %
(R)	2	0,7	29000	4,1
(R)	2	0,7	46000	6,9
(R)	3	1,1	56000	5,1
(R)	3	1,1	51000	4,6
961127
(T)	1,1	1,1	41000	3,7
(T)	1,1	1,1	47000	4,3
(T)	1,5	1,7	69000	4,1
(T)	1,5	1,7	69000	4,1	128	92	193 %
(R)	1,5	0,8	32000	4
(R)	1,5	0,8	36000	4,5
(R)	2,5	1,2	53000	4,4
(R)	2,5	1,2	56000	4,7
Lab T	45	0,8	46000	5,8
Lab R	84	0,8	40000	5
961204

- 131. táblázat folytatása

(T)_____	1	0,8	30000	3,8
m_	1	0,8	31000	3,9
JI)____	1,5	1,2	48000	4
m_	1,5	1,2	50000	4,2	87	96	87 %
JR}___	1	0,9	37000	4,1
(R)____	1	0,9	35000	3,9
(R)	1,5	1,4	53000	4,4
(R)	1,5	1,4	56000	4,1
Lab_T	65	1,1	50000	4,5
Lab_R	65	1,1	55000	5
961206
(T)	1,5	1	51000	5,1
(T)	1,5	1	48000	4,8
(T)	2,25	1,5	83000	5,5
(T)	2,25	1,5	79000	5,3	116	116	78 %
(R)	1	1	40000	4
(R)	1	1	50000	5
(R)	1,5	1,5	70000	4,7
(R)	1,5	1,5	62000	4,1
961211
(T)	1,5	1,1	66000	6
(T)	1,5	1,1	61000	5,5
(T)	2	1,4	88000	6,3
(T)	2	1,4	86000	6,1	106	89	106 %
(R)	1,5	0,9	61000	6,8
(R)	1,5	0,9	67000	7,4

- 141. táblázat folytatása

_ÍR)_____	2	1,2	79000	6,6
(R)	2	1,2	74000	6,2
Lab_T	65	1	68000	6,8
Lab_R	65	1	64000	6,4
Átlag		104	94	121
Szórás		20	10	47
V.K.³		19 %	10 %	39 %
N		9	9	J___

¹ (T) a találmány szerinti eljárással nyert sejtek (kísérleti sejtek) (R) az ismert eljárással nyert sejtek (referencia sejtek) β

V.K. Variációs Koefficiens ⁴ IU nemzetközi egység (International Unit)

- 151. Táblázat

Az 1. táblázat mutatja a találmány szerinti eljárás és az ismert eljárással nyert sejtek funkcionális analízise eredményeinek az összehasonlítását. A táblázatban a (T) jellel jelöljük azokat a sejteket, amelyeket a találmány szerinti eljárással nyertünk. Az (R) jellel jelöljük azokat a sejteket, amelyeket egy ugyanazon a napon, ugyanabból a vérközpontból származó buffy coat frakcióból az ismert módon készítettünk. A Lab_T jelölés azokra a sejtekre vonatkozik, amelyeket a találmány szerinti eljárással állítottunk elő, de a kísérletet nagyobb léptékben (3 liter) hajtottuk végre, mint az (T) sejtek esetében. A Lab_R jelölés azokra a sejtekre vonatkozik, amelyeket egy ugyanazon a napon, ugyanabból a vérközpontból származó buffy coat frakcióból az ismert módon készítettünk, de a kísérletet nagyobb léptékben (3 liter) hajtottuk végre, mint az (R) sejtek esetében. A “Hozzáadott mennyiség” annak a különböző térfogatú sejtszuszpenziónak a térfogatát adja meg, amelyet azért adtunk az elegyhez, hogy a funkcionális tesztet különböző sejtkoncentrációkkal végezhessük. A “Sejtkonc.” a mért sejtkoncentráció, amelyet az adott sejtmennyiség hozzáadása után mértünk. “ELISA” a különböző eredetű sejtek 1 ml térfogatú mennyisége által termelt alfa-interferon mennyiséget jelöli. A “Hozam/sejt” a különböző eredetű, egyetlen sejt által előállított alfa-interferon mennyiségét jelöli. A “Hozam” jelentése az 1 ml térfogatban a (T)/Lab_T kísérletben és az (R)/Lab_R kísérletben előállított alfa-interferonnak a

- 16százalékban kifejezett relatív, átlagos eredménye. A “Hozam/sejt II” jelentése a (T)/Lab_T kísérletben és az (R)/Lab_R kísérletben egy egyetlen sejt által előállított alfa-interferonnak a százalékban kifejezett relatív, átlagos eredménye. Az “Össz. hozam” jelentése a (T)/Lab_T kísérletben és az (R)/Lab_R kísérletben előállított összes alfa-interferonnak a százalékban kifejezett relatív átlagos eredménye abban az esetben ha a két kísérletben azonos mennyiségű sejtet adtak a rendszerhez.

Az 1. táblázatban közölt eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti (T) sejtek átlagosan jobb Össz. hozam” eredményt értek el, mint az (R) sejtek. Mivel az (T) és (R) sejteket eredményező eljárás azonos számú sejttel indult és a végső betöményített leukocita sejtszuszpenzió térfogata a két eljárásnál azonos, ezért a kinyert sejtek mennyiségét mindkét eljárásra nézve kiszámíthatjuk. Ha összehasonlítjuk a 961121 és a 961127 kísérletekben nyert sejtkoncentrációkat olyan esetben, amikor azonos mennyiségű sejtszuszpenziót adtunk a kísérlethez, nyilvánvalóan látszik, hogy a találmány szerinti eljárással nagyobb mennyiségű sejtet kapunk. Ennek megfelelően, mivel a “Hozam” és a “Hozam/sejt” értékek körülbelül azonosak, ezért a találmány szerinti eljárással nagyobb mennyiségű interferont lehet előállítani.

A szűrési lépés eredményeképpen kapott plazmát az inkubációs közeg (EMEM) komponenseként hasznosíthatjuk. Mielőtt a plazmát az inkubációs közeghez adjuk, az immunoglobulin frakciót 25 tömeg% polietilén

-17glikol (Macrogol 6000) oldat hozzáadásával kicsapjuk az oldatból. Az oldatot olymódon készítjük, hogy 430 g polietilén-gIikölt feloldunk egy liter desztillált vízben.

Az ismert eljárás során a plazma frakcióban visszamaradt sejtek eltávolítása céljából egy extra centrifugálási lépést kell végrehajtani (1600 fordulatszám/perc).

Az üreges rostok alkalmazásával elválasztott plazma funkcionális tesztje során a közönséges plazma helyett ezt a plazmát adtuk a közeghez, amikor a leukocitákat kisléptékben, 100 ml-es lombikokban inkubáltuk. A plazmát a proteinkoncentrációt jelző A280 értéknek megfelelően, ekvivalens mennyiségben adtuk az inkubált közeghez. Az ezekben a lombikokban termelt interferon mennyiségét ELISA technikával mértük, és összehasonlítottuk a közönséges plazmával végzett kísérletek ELISA eredményeivel.

. Táblázat Kísérleti hozamok; a plazma minősége

- 192. Táblázat

A 2. táblázat a találmány szerinti eljárásból származó plazmák funkcionális tesztjeinek az eredményét mutatja az ismert eljárásból származó plazmákkal összehasonlításban (M-5296R, 961014, 961028, 961030, 961104 és 961202) arra az esetre nézve, amikor szűrt plazmákat készítettünk. Az “A 280” jelentése a 280 nm-nél mért abszorpció mértéke. A “Hozzáadott mennyiség” jelentése a különböző plazma mennyiségeket jelenti, amelyeket azért adtunk az inkubációs közeghez, hogy az egyes közegekben a proteinkoncentráció azonos legyen. A “Hozzáadott közeg” az alkalmazott inkubációs közeg térfogata. A “Sejtkonc.” az a sejtkoncentráció, amelyet a hasonló sejtszuszpenzióból származó sejtek hozzáadása után mértünk. “ELISA” az egy milliliter közegben termelt interferon mennyisége. A “Hozam/sejt” az egyetlen sejt által előállított alfa-interferon mennyisége. A “Hozam” a találmány szerinti eljárással előállított különböző plazmák jelenlétében inkubált sejtek által az egy milliliter térfogatban előállított interferon százalékban kifejezett átlagos mennyisége a közönséges M-5296R kísérletből származó plazma alkalmazásával végzett kísérlet eredményével történő összehasonlításban. A “Hozam/sejt ΙΓ a különböző plazmakoncentrációk jelenlétében inkubált egyetlen sejt által előállított alfa-interferon százalékban kifejezett átlagos mennyisége. “Ossz, hozam” a különböző plazmakoncentrációk jelenlétében inkubált sejtek által előállított alfa-interferon százalékban kifejezett teljes átlagos mennyisége az M-5296R

-20kísérlettel való összehasonlításban.

2. Példa

A találmány szerinti berendezés fertőtlenítését lépésenként és automatikusan a következőképpen hajtjuk végre:

A buffy coat edényt (a) és a szűrőket (b) az (n) edényből átvezetett foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) átmossuk. A plazmaszűrőben a PBS áramlási irányát az ellenkező irányba fordítjuk. A statikus keverőt (k), az átfolyó elegyítőedényt (|) és a centrifugát (m) az (o) edényből átvezetett ammónium-kloriddal átmossuk. A rendszert kiürítjük.

A rendszer tisztítását a (p) edényből 0,5 M nátrium-hidroxid oldat alkalmazásával végezzük legalább fél órán át. A rendszert kiürítjük.

A rendszert a (q) edényből átvezetett 25 térfogat%-os etilalkohol oldattal feltöltve tartjuk.

Használat előtt a rendszert kiürítjük, majd desztillált vízzel és steril PBS-sel átmossuk.

Fertőtlenítés után a berendezést a kritikus pontoknál szétszedjük és szemrevételezéssel ellenőrizzük, hogy nem maradt e a rendszerben sejt, sejttörmelék, stb. Minden ellenőrzés vagy a 3. táblázatban ismertetett eljárás során mintákat veszünk az egész rendszeren átáramló steril PBS-böl és vízből. Az European Pharmacopeia, 2^nd Edition kézikönyvben ismertetett eljárás alkalmazásával a mintákban meghatározzuk a csíraszámot, valamint az ugyanott leírt módszer alkalmazásával a jelenlevő endotoxin mennyiségét.

-21 •>14 '**4

3. Táblázat

Kísérleti eredmények: a sterilitás mértéke

Kísérlet	Mosófolyadék	Baktérium (cfu/ml⁵)	Endotoxin (EU/ml⁶)
961009	PBS	<0,5	<0,2
961023	Víz	0,5	<0,2
961030	Víz	<0,5	<0,2
961114	víz az üreges rostokon való átszűrés után	<0,5	<0,2
961114	víz az átfolyó elegyítőedény után	1
961121	víz, szűrlet	<0,5	kimutathatatlan
961121	víz az átfolyó elegyítőedény után	<0,5
961127	Víz	<0,5	<0,2
961204	Víz	<0,5	kimutathatatlan
991206	Víz	<0,5	kimutathatatlan
961211	Víz	<0,5	kimutathatatlan

cfu életképes baktériumok száma (colony forming unit) EU endotoxin egység/ml (Endotoxin Unit)

-22A berendezésen belül nem találtunk sejteket, sejtfragmentumokat, stb. A 3. táblázat adatai demonstrálják, hogy a találmány szerinti berendezést steril körülmények között lehet működtetni, és szétszerelés nélkül, a CIP eljárással tisztítható.

Noha a találmány szerinti eljárás a feltalálók szerint jelenleg ismert legelőnyösebb megvalósításainak megfelelően van leírva, különböző szakmai szempontból nyilvánvaló változtatások és módosítások mégis eszközölhetők rajta anélkül, hogy a eltérnénk a találmány oltalmi körétől, amelyet az alábbi szabadalmi igénypontokban ismertetünk.

Claims

-23SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás leukociták folyamatos tisztítására és betöményítésére vérből azzal jellemezve, hogy az eljárást az alábbi lépésekben hajtjuk végre:

(a) a plazmát a vértől szűréssel elkülönítjük azért, hogy egy szűrt buffy coat frakciót kapjunk;

(b) az (a) lépésben nyert buffy coat frakcióhoz adunk egy a plazmához képest hipotóniás vizes oldatot azért, hogy a buffy coat frakcióban levő eritrocitákat elroncsoljuk;

(c) a (b) lépésben előállított buffy coat frakció és vizes hipotóniás oldat keverékét egy keverőben összekeverjük;

(d) a (c) lépésben előállított elegyet egy átfolyó elegyítőedényen keresztül vezetjük;

(e) a (d) lépés után a leukociták elválasztása céljából az elegyet átvezetjük egy centrifugán;

(f) az (e) lépésben különített leukocitákat kinyerjük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az (a) lépésben a vér helyett a vérből nyert buffy coat frakciót használjuk, és a plazmát szűréssel távolítjuk el a buffy coat frakcióból.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a (b) lépésben a hipotóniás vizes oldat ammónium-klorid.
4. Az 1. - 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a vér szűrését membránszűrő alkalmazásával

-24végezzük, amelynek a pórusátmérője 0,1 - 1,0 pm között van.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a vér szűrését olyan membránszúrő alkalmazásával végezzük, amelynek a pórusátmérője 0,4 - 0,6 pm között van.
6. Az 1. - 5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az átfolyó elegyítőedény olyan kialakítású, hogy benne a (d) lépésben a keverék tartózkodási ideje körülbelül 0,5 - 10 perc.
7. Az 1. - 6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az (f) lépésben kinyert leukocitákat egy második lépésben is roncsoljuk.
8. Az 1. - 7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az (f) lépésben kinyert leukocitákat interferontermelés céljából egy bioreaktorban inkubáljuk.
9. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az (a) lépésben elválasztott plazmát kinyerjük.
10. Az 1. - 7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az eljárás automatikus, és a szétszerelés nélküli fertőtlenítés) (SÍP) és szétszerelés nélküli tisztítási (CIP) műveletek végrehajtására alkalmas.
11. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a vér emberi vér.
12. Leukociták vérből történő folyamatos tisztítására és betöményítésére alkalmas berendezés amely a következő részekből áll:

(i) membránszűrö a plazma elválasztására vérből, szűrt

-25buffy coat frakció kinyerésére;

(ii) a membránszűrővel összekötött statikus keverő, amellyel a membránszűrőből jövő buffy coat frakciót és a hipotóniás vizes oldatot keverjük azért, hogy a keverék buffy coat frakciójában levő eritrocitákat elroncsoljuk;

(iii) a statikus keverővei összekötött átfolyó elegyítőedény, amely olyan kivitelű, hogy benne a keverőbői jövő elegy homogenizálódik;

(iv) a átfolyó elegyítőedénnyel összekötött centrifuga, amellyel a leukocitákat elválasztjuk az átfolyó elegyítőedényből jövő oldatból.
13. A 12. igénypont szerinti készülék azzal jellemezve, hogy vér helyett vérből nyert buffy coat frakciót használunk, és a plazmát a buffy coat frakcióból szűréssel távolítjuk el.
14. A 12. igénypont szerinti készülék azzal jellemezve, hogy a hipotóniás vizes oldat ammónium-klorid.
15. A 12. igénypont szerinti készülék azzal jellemezve, hogy az alkalmazott membránszűrő pórusátmérője 0,1 - 1,0 pm között van.
16. A 14. igénypont szerinti készülék, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott membránszűrő pórusátméröje 0,4 - 0,6 pm között van.
17. A 12. igénypont szerinti készülék, azzal jellemezve, hogy az átfolyó elegyítöedény olyan kialakítású, hogy benne az elegy tartózkodási ideje körülbelül 0,5 - 10 perc.
18. A 12. igénypont szerinti készülék azzal jellemezve,

-26hogy a centrifuga a leukociták folyamatos vagy félfolyamatos elválasztására alkalmas.
19. A 12. igénypont szerinti készülék azzal jellemezve, hogy fertőtleníthető és tisztítható, oly módon, hogy a készülék az u.n. Sanitation-ln-Place, SÍP, valamint a Clean-In-Place, CIP eljárásokkal szétszerelés nélkül fertőtleníthető és tisztítható.

A bejelentő helyett a meghatalmazott

DANUBIA

Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

szabadalmi ügyvivő