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Verfahren zur Gewinnung von Hormonen Es wurde gefunden, daß man das
Brunsthormon aus seinen wässerigen Lösungen, z. B, aus brunsthormonhaltigen Körperflüssigkeiten
(Harn, Follikelsaft usw.), oder aus wässerigen Extrakten brunsthormonhaltiger Organe
(Ovarien, Placenta, Corpus luteum, Hoden usw.) gewinnen kann, wenn man diese wässerigen
Lösungen, erforderlichenfalls nach vorhergehendem Einengen, mit einem oder mehreren
Salzen der Alkalien, der Erdalkalien, des Magnesiums oder des Ammoniums, wie z.
B. Natriumchlorid, Natriumsulfat, Calciumchlorid, Magnesiumsulfat, Ammoniumsulfat
usw., zweckmäßig bis zur Sättigung versetzt, das abgeschiedene hormonhaltige Produkt
abfiltriert, mit der gesättigten Salzlösung nachwäscht und in geeigneter Weise reinigt.
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Ferner zeigte sich, daß, im Falle die brunsthormonhaltige wässerige
Lösung -zugleich Hypophysenvorderlappenhormone enthält, wie dies z. B. für den Harn
schwangerer Frauen bekannt ist, durch die Behandlung mit Salzen gleichzeitig beide
Hormone ausgefällt werden können.
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Enthält der bei der Salzfällung erzeugte Rückstand bloß das Brunsthormon,
so wird er zur Reinigung, feucht oder nach vorsichtigem Trocknen, zweckmäßig mit
wasserfreien organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Benzol, Äther, Chloroform, Aceton,
absolutem Alkohol, fetten Ölen usw., ausgezogen. Lösungen in 01 können nach
ihrer Einstellung auf den gewünschten Wirkungsgrad direkt therapeutische Verwertung
finden. Bei Verwendung leicht flüchtiger Extraktionsmittel kann man das Brunsthormon
durch Vertreibung des Lösungsmittels isolieren.
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Maßgebend für die Trennung der Hormone untereinander und insbesondere
von den anorganischen Verunreinigungen war die Beobachtung, daß das Hypophysenvorderlappenhormon
zwar in den gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln unlöslich, in etwa go°/oigen
wasserhaltigen organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Methylalkohol, Äthylalkohol
oder Aceton, aber löslich ist. Die anorganischen Bestandteile lösen sich darin noch
nicht, während das Brunsthormon sowohl in wasserfreien wie auch in etwa go°/oigen
wasserhaltigen Lösungsmitteln löslich ist.
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Enthält der bei der Salzfällung erzeugte Rückstand gleichzeitig das
Brunst- und das Hypophysenvorderlappenhormon, so gewinnt man beim Ausziehen mit
etwa go°/oigen wasserhaltigen organischen Lösungsmitteln nach dem Vertreiben des
Lösungsmittels ein hochwirksames Gemisch der Hormone. Durch
Behandeln
mit wasserfreien organischen Lösungsmitteln kann diesem Gemisch das Brunsthormon
entzogen werden, während das Hypophysenvorderlappenhormon quantitativzurückbleibt.
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Zur Trennung kann man auch direkt dein z. B. aus Sch-,vangerenharn
bei der Salzfällung erhaltenen Rückstand noch feucht oder nach vorhergehendem vorsichtigem
Trocknen zuerst mit wasserfreien und hierauf mit etwa go°/oigen wasserhaltigen Lösungsmitteln
ausziehen. Durch Vertreiben des Lösungsmittels erhält man im ersteren Falle- das
Brunsthormon, im letzteren das Hypophysenvorderlappenhormon in nahezu quantitativer
Ausbeute. Nach der englischen Patentschrift 3231174 wird das Hypophysenvorderlappenhormon
bereits durch etwa 8o°toigen Alkohol ausgefällt und ist erst in etwa 5o°/oigem Alkohol
löslich. Dieses unter= schiedliche Verhalten gegenüber den vorliegenden Befunden
beruht wahrscheinlich auf dem verschiedenen Reinheitsgrad der nach den beiden Verfahren
erhaltenen Hormonfraktion.
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In dem nicht zum Stande der Technik gehörenden Patent 671 043
ist ein Verfahren zur Reinigung und Anreicherung von Hormonen beschrieben, welches
dadurch gekennzeichnet ist, daß -man die das Hormon enthaltenden Lösungen mit einem
Salz sättigt und dann aus dieser ungesättigten Lösung das Salz partiell auskristallisieren
läßt, wobei man einen hormonhaltigen Brei erhält. Das vorliegende Verfahren ist
von demjenigen des Patents 671 043 abgegrenzt, indem diese Verfahrensmaßnahmen nicht
durchgeführt werden. Es wird vielmehr eine wässerige hormonhaltige Lösung mit Salzen
bis zur Sättigung versetzt, das abgeschiedene hormonhaltige Produkt abfiltriert
und mit der gesättigten Salzlösung nachgewaschen; die Verfahrensstufe der partiellen
Auskristallisation gemäß Patent 671 043 wird somit nicht durchgeführt.
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Beispiel i io l Harn einer trächtigen Kuh werden bei niederer Temperatur
auf etwa i 1 eingedampft und ohne Berücksichtigung einer manchmal dabei auftretenden
Trübung mit Chlornatrium gesättigt. Der erhaltene Niederschlag wird auf einer kleinen
Nutsche abgesaugt und mit gesättigter wässeriger Kochsalzlösung ausgewaschen. Er
enthält die Gesamtmenge des im Ausgangsmaterial vorhandenen Brunsthormons. Durch
Ausziehen mit Chloroform oder Benzol wird es ohne Verlust in Lösung gebracht.
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Beim Verdampfen des Lösungsmittels bleibt ein bräunliches Öl zurück,
das zum Teil kristallinisch erstarrt. Es ist löslich in starkem Alkohol, Methylalkohol
oder Aceton, ebenso in den gebräuchlichen wasserunlöslichen organischen Lösungsmitteln,
wie Benzol, Toluol, Chloroform, sowie in fetten Ölen. Beispiel 2 Zu einem noch eiweißhaltigen
wässerigen Extrakte aus Placenta, der durch Ausziehen von frischer Placenta mit
verdünntem Alkohol und Vertreiben des organischen Lösungsmittels aus dem Filtrate
dargestellt wurde, setzt man Amrhonsulfat bis zur Sättigung zu. Es entsteht -ein
geringer Niederschlag, der auf einem -Filterchen gesammelt wird. Man wäscht mit
gesättigter wässeriger Ammoniumsulfatlösung gut aus und trocknet das Filter mit
dem Niederschlage im Vakuum. Durch Verreiben mit Sesamöl oder Olivenöl wird das
Brunsthormon daraus in eine Öllösung übergeführt, welche nach dem Abfiltrieren des
unlöslichen Teiles direkt für physiologische Zwecke verwendbar ist. Soll das Brunsthormon
weiterverarbeitet bzw. gereinigt werden, so verwendet man an Stelle des- Öls absoluten
Alkohol als Lösungsmittel. Man erhält eine gelb gefärbte Lösung, welche beim Abdampfen
des Lösungsmittels einen öligen Rückstand hinterläßt, der die in Beispiel i angegebenen
Eigenschaften zeigt. Er enthält das gesamte Brunsthormon des Ausgangsmaterials.
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Beispiel 3 :251 Harn schwangerer Frauen werden im Vakuum auf
1,51 eingedampft und der Rückstand mit 300 g Ammonsulfat und ioo g Natriumsulfat
versetzt. Nach istündigem Rühren wird der Niederschlag abgesaugt, mit gesättigter
Ammonsulfatnatriumsulfatlösung ausgewaschen und zweimal mit je 6oo ccm go°/oigem
Alkohol ausgezogen. Das klare Filtrat wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand
getrocknet. Es bleibt eine gelbliche, zerfließliche Substanz zurück, die in Wasser
mit einer geringen Trübung, in verdünntem Alkohol, Methylalkohol oder Aceton dagegen
klar löslich ist. Sie enthält das Brunst- und Hypophysenvorderlappenhormon des Harns
in quantitativer Ausbeute. Beispiel 4 251 Schwangerenharn «-erden, wie bei Beispiel
i, eingedampft und dann mit Natriumsulfat bis zur Sättigung versetzt. Der Niederschlag
wird abgesaugt und mit gesättigter wässeriger Natriumsulfatlösung ausgewaschen.
Er wird darauf vorsichtig getroclrnet, pulverisiert und mit kleinen Mengen von Benzol
oder Chloroform so lange ausgezogen,
bis eine Probe der Lösung ohne
Rückstand verdampft. Die Lösung enthält das Brunsthormon. Beim Verdunsten des Lösungsmittels
verbleibt es als gelbliches Öl.
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Dem Extraktionsrückstand wird hierauf das Hypophysenvorderlappenhormon
durch etwa goo/oigen Methyl- oder Äthylalkohol oder goo/oiges Aceton entzogen. Beim
Vertreiben des Lösungsmittels verbleibt eine gelbliche, zerfließliche, klar in Wasser
lösliche Masse. Sie enthält das Vorderlappenhormon.