DE2201991A1

DE2201991A1 - Extraktive Gewinnung von Insektenhaeutungshormonen

Info

Publication number: DE2201991A1
Application number: DE19722201991
Authority: DE
Inventors: Luigi Canonica; Bruno Danieli; Giorgio Ferrari
Original assignee: Dauten SA
Current assignee: Dauten SA
Priority date: 1971-01-18
Filing date: 1972-01-17
Publication date: 1972-08-10
Also published as: DE2201991C2; NL146027B; HU164403B; IL38540A0; OA04070A; DD95564A1; BR7200290D0; CH613213A5; FR2122498A1; AU462750B2; DK130701B; JPS5720320B1; US3828082A; FR2122498B1; NL7200655A; CA983018A; GB1382682A; DK130701C; AT314726B; AU3797272A

Description

Die Erfindung betrifft Steroidhormone, die die Metamorphose von Insekten beeinflussen und steuern, insbesondere ein Vorfahren zu deren Herstellung und ihre spezifische Verwendung als biologische Insecticide.

Unter den Insekter.häutungshorroonen, die die vorliegende Erfindung betrifft, sind einige wenige bereits bekannt, beispielsvieir.e Crustecdyson (auch Ecdyateron ge~ nannt), Ma'k ister on Λ und Ecdyson, während ein anderes, lluriaicron, welches im folgenden näher definiert wird, bisher wader be f.; abrieben noch identif i/.iart worden ist.

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Crüstecdyson, d.h. 2ß,3ß,^14ci,20R,22R,2^ri~lIexahydroxy-5ß-cholest-7-en-6-on der Formel:

HO

(D

wurde zum esten Mal aus einer Crustacee, und av/ar aus Jasus calandei (Chera. Cora. 1966, Seite 37) in einer Menge von 2 mg reinem Hormon je Tonne Crustacee isoliert. Sein Vorhandensein wurde auch zusammen mit Ecdyson in Bombyx morl festgestellt. Es kommt auch im Insekt Antherea pernyi vor (200 mg aus 31 kg Puppen).

Es wurde isoliert aus Podocarpus elatun Pflanzen, begleitet von Pflanzonsteroiden als Verunreinigungen ( Com. 1966, Seite 9O!3), in einer Menge von 0,0[3 f* auf das Gewicht des pflanzlichen Materials (Chem. Com. 1960, Seite 971); ea findet aich auoh in P.niücrophyllua (T.Lett, 1968, Seite 3883). Schließlich kommt ea vor in Polypodiura vulgäre L. (0,07 5° - 1,0 ^o des Trockengowirh \.v (PbytocheraiGtry, 9, 1247 (1970) ).

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Makisteron A, 2ß_f 3ß, 14oC,20R,22R, 25-Hexahyaroxy-24-TDethyl-5ß-cholest-7-en-6-ori der IOrmel:

HO OH

(II)

wurde in Podocarpus maeroplxyllus in an amount as high as 0,001 i» (T. Lett. 1969, Seite 3887) nachgewiesen·

Aus der Gruppe der Polyhydroxyateroide wurde das Ecdyson der Formel:

(III)

als erstes isoliert und identifiziert (A.Butenandt, ]>. Knrlson und Mitarbeiter, Ann. Chcia. 6G2,1 (1963); dies war elf·!· Auijßaugspuni't für v/o lter ο Forscj.vunger! hin

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sichtlich der Eigenschaften dieser Steroid ο und ihresEingreifensin den Entwicklurjgf.Kyklus vun Insel;ton.

Während der .vergangene]] Jahre v/m¹ tie in der Fach- ina"besondere Patentliteratur eine lieihe vco Verfahren nur Herstellung dieser Hormone beschrieben. Das Hauptproblem blieb jedoch bisher ungelöst, nämlich die' Herstellung in einer gewerblich annehmbaren Menge, d.h. in hohen Ausbeuten \mä zu erträglichen Gestehungskosten, !tatsächlich haben olle bisher bekanntgewordenen Verfahren den gemeinsamen Nachteil, daß sie außerordentlich kostspielig und darüberkirauo sehr beschwerlich sind.

Der Erfindung liegt nun die Feststellung «ugrunoe, o.i^:li derartige Hormone sowohl als reine L-ub stan «en als ouoh Ui Form e.ino3 teilv.'eisc gereinigten Extraktes in sowohl gewerblich als auch wirtschaftlich annehmbaren i-fengem durch Extraktion aus Pflanzen der Familie CoHVolvulaceae, U:o^!;(;r·· gruppe Ipornacö, Gatti^ng Calonyotion (Cb.oisy) üallier f. gev/onnen werden können.

Es wurde insbesondere festgestpllt, daj3 die !Dxti/aktioi) der in Rede stellenden Steroidhorniuno ?λι guten lie.sultuten führt bei Verwendung der soeben erwähnten Pflanzen, dirwild in gebirgigen und subtropischen Bereichen, insbesondere in der Sub-HiualiJ ja-Zure (Indien) vo?:]>o:iii,en, wo >,:c von den Eingeborciion "llülodoua" gencjiut wovcio·]; dioi.r :--■-zeichnung umfaßt .in der/tatsächlichen Praxis eine An na hl! von miteinander nah verwandten Pflfjji¹/cn, (lonni Tdcin i:·".;-zierung strittig ist, Co beißt es jn "Otop3:;^:i^f g Inüigono-j;: Drugs of India" U.IT.Dhur η η ei i?o:ju Private '.ύ; iiiited, V.-jl·- cut ta, 19!;β (i.Jiiitü ^Tj1) (Ιοί;·:; rn.Ujii.'ij;;·- Ocr wi i;:'o-nr]jo;rtl:; ■-chf.'T) 3"joi-:oi«hu!3np; Ipoi.)^o3 houci-titjc: rn^ t;το·i ch [.

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Ira Gegensatz
/hierzu wird in J. Pharro. Sc₁, Vol. 56, No. 6, Seite

771». 1967 iti Kontext einen Artikels von Gupta und Mitarbeitern bekräftigt, da/J KaIn dnna dor ITa wo ist, unter Vielehen) Ipomaea nmr ica ta üblicherweise bekannt ist. In "British Pharmaceutical Codex"1949, Seite 459 wiederum heißt es, daß Kaladana aus getcockueten Samen von Ipomaea hederacea besteht.

Die Pflanze Kaladana, die für die vorliegende Erfindung von Bedeutung ist, gehört mit Sicherheit zn der oben angegebenen Familie, Untergruppe und Art und besitzt folgende charakteristische Merkmale:

Ein perennierendes Lianengewäoha mit sehr langen sich verdrehenden oder verschlingenden Trieben, die sich verzweigen, krautartig aber an dor Basis holzartig hart aind und ein oder zwei längs verlaufende Kerben oder Einschnitte aufweisen, welche dicht besetzt sind ipit kurzen kraut-

Ie. i oiit artigen Stacheln; diese Stacheln sind/abwärts gebogen, haben eine stumpfe Spitze und sind nicht stechend.

Verwandt mit C. rjuricatum (I.) G.Don unterscheidet sich die in Rede stehende Pflanze durch die alternierend angeordneten herzförmigen, in eine Spitze auslaufenden Blätter, die weder gelappt noch pfeilnpitzenförmig sind, einen leicht buchtig-gewollten Rand besitzen und größer sind:

Die Länge betrugt bis zu etwa ?.¹} ca und die Breite bis zu

, 90 lang 22 CFi; der Blattstiel ist etwa 1/2 bis 1/3/wie das Blatt, an der Basis leicht verbreitert und in diesem Bereich kaum behaart..

Stengel Die Blüten oind zu 2 oder 3 auf einem aehr.el-ständigen/

ungeordnet; dio Blurnenkrone int ein länglicher konischer

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Tubulus von weißlicher Farbe, nicht so lang wie bei C.muri-. catum (etwa 7 cm), der Rand ist trichteriörmig und gedreht, stumpf 5-lappig mit einem Durchmesser von etv/a 8 cm; der Farbton ist ein mehr oder weniger starkes Lila oder Rosa. Die Blume blüht zur Nachtzeit; Staubgefäße und Griffel ragen nicht aus dem Blütenhüllen-Tubulus heraus; der Kelch besitzt spitz zulaufende und aufgesetzte Lappen, die jedoch gespreizt oder weit sind, bis sie beim Reifen der Kapsel eiförmig-spitz zulaufend und leicht divergierend werden.

Die Kapsel hängt herab, ist eiförmig-spitz zulaufend und besitzt drei (2 bis 4) schwarze Samenkörner in Form eines Keils oder Einsatzes (die Außenfläche ist eiförmig odor oval und die Innenfläche eben oder planar); die Samenkörner sind fein flaumig-granulär und besitzen eine mittlere Länge von 7 ram und eine Breite von 6 mm.

Die Pflanze kommt frei, d.h. wild in dem gebirgigen Sub-Hiraalaja-Bereich von Indien und Westpakistan bis zu Höhen von 1 500 m vor. Die Droge bestehend aus den Samen wird lokal als Abführmittel benutzt, das Pulver hingegen als Antipyreticum.

Um jeglichen Zweifel zu^erstreuen, wird die Pflanze anhand der beigefügten Zeichnung näher erläutert. In dieser zeigen:

Fig. 1 einen Trieb der Pflanze mit Blättern und Blüten;

Fig. 2 die reifen Samen tragenden Kapseln; und

Fig. 3 und 4 die Vorder- bzw. Seitonansicht eines Samens.

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Wie "bereits gesagt, betrifft die Erfindung die oben aυfgezählten Steroidhormone, die die Metamorphose von Insekten beeinflussen und steuern.

Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Gewinnung von Insektenhäutungshormonen aus Teilen der Pflanze Kaladana, die reich an solchen Hormonen sind, insbesondere aus deren Samen, wobei diese Hormone in beträchtlicher Menge und zu sowohl wirtschaftlich als auch technisch-gewerblich annehmbaren Gestehungskosten erhalten werden.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Isolierung der genannten Hormone in hohen Ausbeuten (beispielsweise 0,5 bis 1 ?£ der frischen Samen) und in einem außergewöhnlich hohen Reinheitsgrad aus Kaladana unter Anwendung eines sehr einfachen und schnellen Verfahrens.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine neue Substanz, die aus dera Kaladana-Estrakt isoliert und identifiziert worden ist; diese Substanz besitzt die Struktur eines Polyhyäroxy-Steroids; sie hat den Namen Muristeron erhalten; ihre Eigenschaften und Merkmale werden im weiteren Verlauf der Beschreibung näher erläutert.

Gegenstand der Erfindung ist schließlich der Kaladana-Extrokt, der, wie nachgewiesen wurde, eine sehr starke biologisch insekticide Aktivität und ein weites Wirkungsspektrum besitzt zusätzlich zu seiner natürlichen Wirkung als starkes Antifraßmittel (antifeeding agent) gegenüber Insekten.

Außer für den Schutz für PiliJijseukulturen finden die polyhydroxylierten Steroide, Gegenstand der vorliegenden

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Erfindung, auch noch die an sich bereits bekannte Ve?:wendung auf pharmazeutischem und Veterinär-medizinischem Gebiet.

Pur das mit lCaladana durchzuführende Extraktionsvcrfahren werden die Pflanzenteile, vorzugsweise die Samen, zunächst an der Luft oder auf andere geeignete Weise getrocknet und dann zu einem schrotartigen Mehl vermählen, aun üerc in einer ersten Verfahrensstufe ohne Erwärmen ωit Hilfο '¹I-nes Kohlenwasserstoff-Lösungsmittels, vorzugsweise Potioläther oder Ligroin (Siedebereich 80 bis 90⁰O) das enthaltene Fett abgetrennt wird.

Die Droge wird dann erschöpfend mit einem Gemisch Gi.ß einem aliphatischen Chlorkohlenvasr-erstoff, einem aliphatischen Alkohol und einer stickstoffhaltigen Base extrahiert..Die Extraktion wird vorzugsweise mehrere Male bei Raumtemperatur und unter Rühren und schließlich mit dem aliphatischen Chlorkohlenwasserstoff alleine, gleichfalls unter Rühren und bei Raumtemperatur wiederholt.

Jeder Extraktionslauf dauert im Folie eines diskontinuierlichen Verfahrens etwa 12 Stunden; in jedem Folie wird die Extraktion als beendet angesehen, wenn sich der letzte Extrakt im Liberuinnn Test für den Nachweis von Steroiden als negativ erweist. Selbstverständlich kann die Extraktion auch kontinuierlich durchgeführt worden unter Anwendung der jedem Fachmann geläufigen Verfahrensweise.

Die kombinierten Extrakte werdc;ji dann im Vakuum bei Temperaturen nicht über 4<>°U eingeengt und ntoiion-gol;i^-- -sen. Aus dem Konzentrat sohoiciet «ich ein krj ;;t;ilJ ines Produkt ob, tiiai ii;i folgenden Gv^iiinitkriutnKi is:»t V ,·,»«- nanu I ν.,'.ια νρ,·< tfjo ^ewuiiüolitoi"! ilui'i^oito entliJi.lt.

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Das Extraktionsgemisch für die Droge umfaßt wie bereits angegeben:

a) Ein chloriertes aliphatischen KohlenwasserStoff-Lösungsmittel, vorzugsweise Chloroform; en können aber auch Kohlenstofftetrachlorid, Methylenchlorid oder Trichloräthylen Verwendung finden;

b) einen aliphatischen Alkohol enthaltend 1 bis 4 Kohlenetoffatorae, vorzugsweise Methanol; und

c) eine stickstoffhaltige Base ausgewählt aus der Gruppe Ammoniak und Amine,

Das Verhältnis der verschiedenen Komponenten des Extraktionsgemisches zueinander hängt von diesen Komponenten selbst ab: Im Falle Chloroform/Ilethanol/Ammoniak beträgt das Verhältnis 9 : 0,9 : 0,1 Volumina.

Selbstverständlich sind zahlreiche Wechsel und Modifizierungen möglich sowohl hinsichtlieh der Lösungsmittel und Reaktionspsrtner in der Extraktionsstufo als auch der Bedingungen, unter denen die Extraktion durchgeführt wird, welche ja als solche eine allgemein zum Stand der Technik gehörende Maßnahme ist.

Um die im Gesamtkristallisat T enthaltenen Steroidhorrnone zu identifiaieren, wurde dau Krislallisat mit wenig kaltem Chloroform gewaschen und dann getrocknet und analysiert. Die chrouötographische Analyse wurde auf einer dünnen Schicht aun Silica-Gel G durchgeführt unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform, Äthanol und Wasßor (80 : 19 : 1) als Kritv/icklungcsyetem und von Va η ill inüchv/efolr»L'.urtⁱroi.genij zum Sichtbarmachen der !"lecken nach

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Erhitzen auf 12O⁰C während 10 Minuten; dabei zeigte sich, daß der oben genannte kristalline Niederschlag eine Anzahl von Verbindungen enthielt, von denen sich tfwei als Crustecdyson und Makisteron erwiesen. Unter anderem -werden nämlich erhalten: Ein blauer Fleck mit ILy₁ = 0,22, ein violetter Fleck mit R_y = 0,20, charakteristisch für Makisteron A und ein gelber Fleck R_p = 0,1!;, der charakteristisch ist für Crustecdyson.

Im Zusammenhang mit dem blauen Fleck wurde festgestellt, daß im Gesaintkristallisat T zusätzlich zu Crustecdyson und Makisteron A noch andere polyhydroxylierten Sterine vorhanden sind, unter denen in wesentlichen Kongen sowohl das Ecdyson als auch eine neue Substanz, das Muristeron festgestellt wurde.

Die Bezeichnung Muristeron soll ein neu gefundenes polyhydroxyliertes Sterin bezeichnen, dessen Eigenschaften bestätigen, daß es zu derselben Familie von polyhydroxylierten Sterinen gehört, wie sie bereits oben beschrieben wurde. Die neue Substanz wird durch folgende Eigenschaften charakterisiert:

1.) IR-Absorptionsspektrum in KBr zeigt charakteristische Banden bei Wellenzahlen von 3 600 bis 3 200, 1 600 und 1 630 ein ;

2.) das UV-Absorptions3pektrum in Methanol zeigt /\ _max = 235 nm (£ = 9050);

3.) das optische Drehungsvermögen beträgt [cC] _ ₊ 40 5⁰ ₊ 1°, (Konzentration c = 1,02 in Pyridin). ^D ~

Behandelt man die Substanz mit Aceton in Gegenwart einer kleinen Menge eines Säurekatalysators wie Phoophor-

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tnolybdänsäure, so erhält man ein Gemisch aus Mono- und Diacetonid, das sich chrotnatographisch mit einer Silica-Gel-Säule trennen läßt, indem mit Chloroform-Äthanol zunächst im Verhältnis 99 : 1 und dann im Verhältnis 98,5 : 1,5 eluiert wird. Mit dem Elutionsraittel im Verhältnis 99 : 1 wird das Diacetonid erhalten., das beim Acetylieren mit Essigsäureanhydrid in Pyridin ein Diacetonid-Monoacetat liefert, das bei 208 bis 214⁰C (Kofier) nach Umkristallisieren aus Hexan schmilzt. Wird mit Chloroform-Äthanol im Verhältnis 98,5 : 1,5 eluiert, so erhält man das Monoacetonid, das in gleicher Weise acetyliert wird, wobei man ein Gemisch aus Monoacetonid-Triacetat und Monoacetonid-Diacetat erhält, Dieses Gemisch wird auf Tonerde chromatographiert und mit Chloroform-Äthanol 99 : 1 und dann mit Chloroform-Äthanol 98,5 : 1,5 eluiert. Im ersteren Falle erhält man das Monoacetonid-Triacetat, Fp 255 bis 260⁰C (Kofier) nach Umkristallisieren aus Äthylacotat-Hexan, im letzteren Falle das Monoacetonid-Diacetat, Fp 140 bis 144⁰C (Kofier) uach Umkristallisieren aus Hexan.

Wie bereits oben gesagt, bringt die Erfindung auch ein Verfahren zum Isolieren der oben genannten Hormone auf schnelle und zv/eekraäßige Weise. Das Gesamtkristallisat T, welches die Polyhydroxysterin-Fraktion enthält, wird chromatographisoh auf einer dünnen Schicht getestet (Lösungstoittelsystem: Methylenchlorid 25, Methanol 5, Benzol 5; 3 ^c/o Vanillin in Alkoholreagens + 0,5 cra^ HpSO. bei 120⁰C 10 Minuten) und dann dem Auftrennungnverfahren unterworfen, welches auf der unterschiedlichen Löslichkeit dieser Substanzen in Wasser und organischen Lösungsmitteln beruht. So geht, nimmt man das alkaloidfreie Gesamtkristallisat T mit destillierten V/asser, gegebenenfalls unter Erhitzen auf, das Crustecdyson (Ecclysteron) in wässrige Lo-

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sung. Diese Maßnahme wird uehrere Male wiederholt bis ein Dünnschichtchromatographie—Test anzeigt, daß die Intensität des gelben Fleckes von Crustecdyson in der wasserunlöslichen Fraktion A verringert worden ist, bis dieser endgültig schwächer wird als der violette Fleck von Hakisteron und als der blaue Fleck,

Zu der mit Crustecdyaon (Ecdysteron) angereicherten wässrigen Lösung wurde Methanol gegeben biß eine Methanolkonzentration von 40 Vol.-^ erreicht worden wnr; diese wässrig alkoholische Lösung wurde dann aui' 1/5 des ursprünglichen Volumens eingeengt. Nach dem Abkühlen schied sich eine Fraktion aus, die Makisteron A und Orustecdycun in beinahe gleichen Mengen enthielt, wie dies der Düm:~ schichtchroroatographie-Test ergab, der wie oben beschrieben, durchgeführt wurde. Dieses Produkt C v/urde aus dem Konzentrat abfiltriert. Die Mutterlaugen wurden bei niederer Temperatur zur Trockne eingedampft und uoi Rückfvuand wiederholt aus einem Methanol-Acetongemisch (1:5) um·- kristallisiert, bis er sich als Chromatographisoh rein erwies. Das auf diese Weise erhaltene Cruateodyson (Eodysteron) schmolz bei 239 bis 242⁰C unter Zersetzung, /'oCjf® ~ +59° + 1° (c = 1 in Methanol). Mit überschuhigera Essigsäureanhydrid in kaltem Pyridin wurde daraus ein Acetylderivat mit Fp 153 bis 157⁰C erhalten.

Die wasserunlösliche Fraktion A als solche, die noch mit V/asser vollgesogen war, wurde mit heißem reinem KoLJmnol aufgenommen, lieira Abkühlen auf Raumtemperatur wurde der unlösliche Teil B auf einem FiHtür getaumelt. Daß vllverig-methanolische Filtrat enthielt 1-oim Dünnöcihiehtohrcv-utographie-Test üno rentliche Crustocuyson, das nicJi ir, üoj: wasfjerunlösliclie?) Fraktion dorj Cei-anLl-.i'.istal.linatcn bofuu-

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den hatte zusammen mit Ecdyson. Die weitere Reinigung von Ecdyson wurde aufgrund seiner geringeren Wasserlöslichkeit durchgeführt. So "ließ sich durch einfaches und v/iederholtes Umkristallisieren aus destilliertem Wasser vollständig reines Ecdyson erhalten. Diese Substanz besaß folgende physikalische und chemische Kenndaten:

Fp 160 ~ 163⁰C; die geschmolzene Substanz festigte sich wieder und schmolz erneut bei 230 bis 240⁰C.

foCjft⁰= +65,7° + 1° (c = 1,033 in Äthanol)

λ max = 242 nm (log ε= 11960); nach Behandeln mit heißen Säuren während 1 h traten 2 neue Absorptionsbanden bei 244 und 297 nm auf).

λ max (KBr) 3650-3100, 1650, 1450, 1385, 1055, 880 cm""¹.

Beim Behandeln von Ecdyson mit Überschüßigem kaltem Essigsäurcanhydrid in Pyridin wurde ein Triacetylderivat mit Fp 85 bis 95⁰C erhalten.

Darauf wurde aus der unlöslichen Fraktion B das reine Makisteron A abgetrennt durch wiederholtes Umkristallisieren des Rückstandes zunächst aus Methanol alleine und dann bis zur chroraatographiochon Reinheit aus Methanol enthaltend 1 °ß> Wasser. Da3 auf diene V/eise erhaltene Makisteron A schmolz bei 258 bis 260⁰C; fXj^⁰= + 65° + 1° (c = 0,5 Methanol). Auch Makiüteron Λ gab beim Behandeln mit Easig-Gäureanhydrid in Pyridin ein Acetylderlvat mit Fp 237⁰C. Dio Mutterlougen aus den verschiedenen Kristallisationsfitufon v/urilon voreiiii^t und Iu;i niederer Temperatur zur Trockne eingedampft (D). Der Uüekr;tarid D wurde mit dem Kückotand C vereinigt, don (kmze in Methanol gelöst, die

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Methanollösung im Vakuum bei niederer Temperatur zur Trockne eingedampft und der so erhaltene Rückstand E einem neuen Auftrennungsverfahren unterworfen oder mit einem neuen Anteil Gesamtkristallisat T vereinigt.

Alternativ hierzu können auch die Rückstände D und C zur Extraktion weiterer, im Kristallisat T enthaltener polyhydroxylierte Steroide als reine Substanzen verwendet werden.

Die chromatographische Untersuchung des Rückstandes D wurde wie oben beschrieben durchgeführt und ergab einen grün gefärbten Fleck mit R„-V/ert etwa 0,23, der das Vorhandensein einer neuen Substanz, nämlich Muristeron anzeigte. Es wurde festgestellt, daß sich diese Substanz aus dem Rückstand D chromatographisch mit Hilfe einer Kieselgel-Säule abtrennen ließ und in den Fraktionen eluiert mit Chloroform enthaltend 5 bis 10 Vol.-56 Methanol enthalten war.

Durch Eindampfen dieser Eluate zur Trockne wurde ein Rückstand erhalten, der beim Umkristallisieren aus Äthylacetat ein kristallines Produkt ergab mit Fp (korrigiert) 227 bis 23O⁰G, das aich leicht in V/asser löste und der empirischen Formel C₂₇H₄₄O₃ entsprach.

Muristeron gab beim Behandeln mit Essigsüureanhydrid in Pyridin ein Tetraacetylderivat, das beim Kristallisieren aus Äthylacetat-Hexan (1:1) einen korrigierten Schmelzpunkt von 236 bis 238⁰C besaß.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beinpielo näher erläutert.

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Beispiel 1

Kaiadanasamen (20 kg) wurden in einer Scheibenmühle

2 mit Siebteil enthalten 30 Löcher je cm vermählen. Das gemahlene Rohmaterial wurde durch Extraktion mit kaltem Ligroin (Siedebereich 60 bis 90⁰C) entfettet. Drei aufeinanderfolgende Extraktionen reichten aus, wobei jeweils mit 35 1 Benzin unter Rühren 5 Stunden lang extrahiert wurde. Das entfettete Material wurde dann unter Rühren 2 mal nacheinander, mit 60 1 eines Gemisches aus Chloroform, Methanol und wässrigem Ammoniak im Volumenverhältnis 9 : 0,9 : 0,1 extrahiert. Jede Extraktionsstufe dauerte 12 Stunden, die Extraktion wurde bei Raumtemperatur vorgenommen.

Darauf wurden 2 aufeinanderfolgende Extraktionen durchgeführt,, von denen jede 3 Stunden dauerte, gleichfalls unter Rühren, mit 50 1 Chloroform. Diese Stufe wurde wiederum bei Raumtemperatur durchgeführt.

In jedem Falle wurde der Extrakt vom Feststoff durch Filtrieren unter vermindertem "Druck abgetrennt.

Alle Extrakte wurden vereinigt und unter vermindertem Druck bei Temperaturen nicht über 40⁰C eingeengt, bis auf ein Volumen von 10 1. Darauf ließ man das Konzentrat einige Tage in einem Kühlschrank stehen, bis sich kein Kristallisat mehr abschied. Das Kristallisat wurde abgenutscht, auf dem Filter mit wenig Chloroform und dann mit Petroläther gewaschen und in Vakuum getrocknet. Durch Einengen der Mutterlaugen und erneutes Stehenlassen im Kühlochrank wurden weitere Anteile Rohprodukt erhalten. Die Auabeute betrug 140 g.

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Die Analyse mittels Dünnychichtchronatographie (Silica-Gel G) unter Verwendung von Chloroforin-lthanol-Wasser (80 : 19 ϊ 1) als Lösungsmittel und von Vanillin-Schwefelsäurereagenz als Fleckendetektor unter Erhitzen auf 120⁰C während 10 Minuten zeigte die oben näher beschriebenen Flekken mit Rp-Werten 0,22 (blau), 0,20 (violett) und 0,15 (gelb).

Beispiel 2

120 g Gesamtkristallisat T, erhalten nach Beispiel 1, wurden in 1 000 cm (11) destilliertem Wasser aufgeschlämmt; die Aufschlämmung wurde 1 Stunde lang bei einer Temperatur von 25⁰C gerührt und dann abgesaugt. DaP Eiltrat wurde zur Seite gestellt und der Filterkuchen weiteren aufeinanderfolgenden Behandlungen mit Wasser unter denselben Bedingungen unterworfen. Für jede Beha lid ltmg wurden wiederum 1 000 ein Wasser verwendet.

Nach der vierten Behandlung ergab die Dünnschichtchroraatographie, wie oben durchgeführt, dass der gelbe Fleck von Crustocdyson im Kuchen (10 g) endgültig schwächer war als der violette Flock für Makisteron A und der blaue Fleck für Ecdyson.

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Die vereinigten wässrigen Filtrate (4 000 cm ) wurden mit Methanol ( 1 600 cm ) versetzt und diese Lösung im Vakuum bei einer Temperatur von maximal 35⁰C auf ein Volumen von etv/a 1 100 enr eingeengt. Das Konsentrat \vurde auf einem Eishad abgekühlt und das ausgefallene kristalline Produkt (30 g) nuf einem Filter geaaimoelt.

Dieses Produkt 0 wurde Mittels DünnschichtChromatographie untersucht: .IjS uet:;to sicJi nuunnjtuGn aus I-kjkis'Uij-o

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A und Cruatecdyson. Dio Mutterlaugen von C wurden dann im Vakuum bei Temperaturen nicht über 35⁰C zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mehrere Male aus einem Gemisch aus Methanol und Aceton 1 : 5 urokristallisiert, "bis das kristalline Produkt chromatographisch rein war. Das auf diese Weise erhaltene Crusiecdyson (Ecdysteron) besaß die oben angegebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften.

Der wasserunlösliche Teil dos Gesamtkristallisates A als solcher, d.h. noch wasserfeucht, wurde auf einem Wasserband bei 5O⁰C mit Methanol aufgenommen und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Der Niederschlag wurde auf einem Filter gesammelt (B). Das vom Niederschlag B abgetrennte methanolische l'iltrat zeigte bei der chromatographischen Untersuchung, daß es Crustecdyson und Ecdyson enthielt. Zur Abtrennung von Ecdyson wurde das Piltrat bei niederer Temperatur ('35⁰C) im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand wiederholt aus destilliertem V/asser urakristallisiert. Es waren mindestens 3 Kristallisationen notwendig, um ein chromatographisch reines Produkt zu erhalten. Für 7,5 g Rückstand v/urden 1 500 car Wasser benötigt.

Zur endgültigen Reinigung wurde das Produkt nach dem Trocknen im Vakuum aus ÄthyJacetat umkristallisiert. Das so erhaltene Ecdyson schmolz bei 230 bis 240⁰C und besaß die weiter oben genannten chemischen und physikalischen Eigenschaften.

Der unlösliche Rückstand B, etwa 15 g, wurde zunächst

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cnr Methanol und dann aus Methanol enthaltend 1 Wasser bis zur chromatographischen Reinheit um-

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kristallisiert. Das so erhaltene Produkt war Makisteron A. Es besaß alle chemischen Charakteristik^, die oben angegeben wurden. Die Mutterlaugen v/urden vereinigt und im Vakuum bei Temperaturen unter 35⁰C zur Trockne eingedampft. Der so erhaltene Rückstand D wurde mit dem Rückstand C vereinigt; das Ganze wurde in Methanol gelöst und die methanolische Lösung in Vakuum bei niederer Temperatur zur Trockne eingedampft; der erhaltene Rückstand E wurde dann einer neuen Auftrennungsstufe unterworfen oder mit einem neuen Anteil Gesamtkristallisat T₁ vereinigt.

Der Rückstand D (21 g) vermischt mit 50 g Silica-Gel (Korngröße 0,05 bis 0,2 mm) wurde in eine Säule aufgegeben, die mit 600 g desselben Silica-Gel vorbereitet worden war. Zunächst wurde mit Chloroform-Methanol 95 : 5 eluiert und der Trocknerückstand dieses Eluates verworfen. Die anschließenden vier Fraktionen, eluiort mit Chloroform-Methanol 90 : 10 (1 1) gaben einen Rückstand, der entsprechend der Dünnschichtchroraatographie die neue, sich durch einen grünen Flecken anzeigende Substanz enthielt. Diese Substanz wurde erneut auf einer frisch wie oben bereiteten Säule chromatographiert, bis sie rein war, wobei jeweils nur mit Chloroform-Methanol 95 : 5 eluiert wurde. Die neuen Eluate wurden zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Äthylacetat umkristallisiert; das kristalline Produkt, Muristeron, schmolz bei. 227 bis 23O⁰C (korrigiert);

IR (KUr): 3 600 - 3 200; 1 600; 1 630 cm"¹ UV (CIUOiI) 236 nra; D.O. 0,994 52,50 Ml (C = 9050). λ: + 49,6° + 1° (c = 1,02; Pyridin).

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Beispiel

Crustecdyson-ffriacetat

0,15 g Crustecdyson (Ecdysteron) gemäß Beispiel 2

"5
wurden ip 5 ca wasserfreiem Pyridin gelöst und mit 2 cm Essigsäureanhydrid "bei Raumtemperatur 24 Stunden lapg be handelt. Die lösung wurde in Eiswasser ausgegossen und der Niederschlag auf einem Filter gesammelt, getrocknet und wiederholt aus 'Äthylacetat/n-Hexan umkristallisiert. Erhalten wurden 0,056 mg eines kristallinen Produktes mit 3?p 155 Ms 157⁰C, das sich als Ecdysteron-Triacetat erwies.

Analyse G ^ E %

Gefunden _ 65,64 8,56

Berechnet für 0-,Hc_nO_1n-H₉O 65,46 8,55

^°-' + 59° + 1° (c = 1, Methanol)

(Aust.J.Chem., 22, 1045 (1969);. Fp = 198,5⁰C - 199°C für das Hemihydrate CaCJ^ = 59°).

Beispiel 4 Male i s ter on-Tr ia c e ta t

0,2 g Makisteron gemäß Beispiel 2 wurden wie oben für Orustecdyson beschrieben behandelt. Beim Umkristallisieren aus Äthylaeetat/n-Hexan wurden 0,15 g Malcisteron-Triacetat erhalten, Fp 257⁰C (Tet.Lett. 3883 (1966), 210-213).

Analyse

Gefunden

Berechnet für Cz₄II₁-pO_in

^?.°= + 74° ._t. 1° (c := 1, !!ethanol)

— ?o — 2 09833/1216

C	,38	H	io
65	,80	8,	40
65	8,	58

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Beispiel 5

Ecdyson-Triacetat

0,10 g Ecdyson aus Beispiel 2 wurden wie obon beschrieben behandelt.

Der feste Rückstand wurde auf Silica-Gel ohromatographiert unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (99 : 1) als Eluens. Die einzelnen Fraktionen wurden kombiniert und aus Hexan umkristallisiert; erhalten wurden 45 rag einer amorphen Substanz, die bei 85 bis 95⁰O schmolz.

Beispiel 6 Mur ister on-1'etraa ceta t

500 mg Muristeron aus Beispiel 2 wurden in 4 cm wasserfreiem Pyridin gelöst und mit 2 cur Esnigsänreanhydrid versetzt; das G-anze wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Dar» Reaktionsgemisch wurde in überschüssiges Wasser ausgegossen, der Niederschlag abgetrennt, getrocknet und chroinatographisoh auf einer Silica-Gel-Säule (Korngröße 0,05 bis 0,2 mm) gereinigt; eluiert wurde mit Chloroforra-Hethanol 90 : 2. Der beim Eindampfen der Eluate erhaltene liüclrstand wurde aus Äthylacetat-Hexan 1 : 1 umkrir.talliniert; die kristalLine Substanz schmolz bei 256 bis 258⁰C. Das IR-Spektrum in KBr zeigte charakteristische Banden bei 5600 bis 5500, 1740, 1720, 1680 und 1250 cm*"¹.

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Wie "bereits oben dargelegt, ist die besonders wichtige Eigenschaft des Gesaratkristallifjates, das mit Hilfe des erf indungsgeiaäßen Verfahrens erhalten wird, seine insekticide Aktivität und infolgedessen seine Schutzwirkung für Kulturpflanzen. Bei Versuchen im freien PeId zeigte sich, daß Lösungen enthaltend 0,1 bis 0,2 % Gesamtkristallisat die gewünschte insekticide und Kulturpflanzen schützende Aktivität gegenüber Schadinsektenarten, besaß, die verschiedenen Klassen angehörten wie lepidopteren (insbesondere Pieris brassicae und Bombyx iQori), Coleopteren (insbesondere Doriphora decemlineata) u.a. .

Manchmal ist es angezeigt, den Wirkstoff mit entsprechenden Dispergiermitteln zu kombinieren, um eine gleichmäßige Verteilung des Wirkstoffes selbst sicherzustellen.

Andere Formulierungen können zusätzlich synthetische oder natürliche synergistische Substanzen enthalten, um das Wirkungsspektrura des Mittels zu verstärken oder noch zu erweitern.

Eine gleich wichtige Eigenschaft des biologisch insekticiden Mittels mit weitem Wirkungsspektrum ist seine spezifische Aktivität und daher seine praktisch vollständige Inaktivität gegenüber anderen Formen pflanzlichen und/oder tierischen Lebens.

Pa t e η ta ηSprüche

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Claims

Patentansprüche

11.) Verfahren zur Gewinnung von Insektenhäutungshormonen aus pflanzlichen Stoffen, dadurch gekennzeichnet, daß man Pflanzen der Gattung Calonyction (Choi3y) Hallier F., Untergruppe Ipomaea, Pamilie Convolvulace'ae in an sich bekannter Weise extrahiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Samen zu einem groben Mehl vermählt, mit einem Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel entfettet und dann gründlic h mit einem Gemisch aus einem aliphatischen Chlorkohlenwasseratoff, einem aliphatischen Alkohol enthaltend 1 bis 4 Kohlcnstoffaioije und einer organischen Base extrahiert und die extrahierten Fraktionen einengt und gründlich wäscht und einen kristallinen Rückstand abtrennt (Gesamtkristalliaat).

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch '^lg e kennzeichnet, daß man al.^c; aliphatischen Chlorkohlenwasserstoff Chloroform, Kohlenstofftetra chlorid, Hethylenchlorid und/oder Trichlorethylen und als organische Base Ammoniak und/oder aliphatisch^ Amine verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Extraktion ein Geraisch aus Chloroform, Methanol und Ammoniak im Verhältnis 9 : 0,9 : 0,1 verwendet.

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5. Verfahren nach Anspruch 1 "bis 4, insbesondere zur Gewinnung von reinem Crustecdyson, dadurch gekennzeichnet, daß wan das Gesamtkristallisat rait destilliertem Wasser aufnimmt, ao daß Crustecdyson in die wässrige Phase übergeht und ein wasserunlöslicher Rückstand A verbleibt, daß man den Rückstand A wiederholt bis zur praktisch vollständigen, chromatographisch nachweisbaren Extraktion von Crustecdyson wäscht, die kombinierten wässrigen Lösungen mit Methanol bis zu einer Methanolkonzentration von bis zu 40 VoI.-^ versetzt und dann auf 1/5 des ursprünglichen Volumens einengt, das erhaltene Konzentrat kühlt, die ausfallende feste Praktion G abtrennt, die flüssige Phase zur Trockne eindampft und den erhaltenen festen Rückstand mehrere Male aus einem Gemisch aus Methanol und Aceton im Verhältnis 1 : 5 bis zum Erhalt von chromatographisch reinem Crustecdyson umkristallisiert.

6. Verfahren noch Anspruch 5, insbesondere zur Gewinnung von reinem Ecdyson, dadurch gekennzeichnet , daß man den unlöslichen Anteil A in heißem reinem Methanol aufnimmt, so daß beim Abkühlen eine Methanol-Lösung erhalten wird, die alles Ecdyson und gegebenenfalls restliches Crustecdyson enthält, neben einer unlöslichen Phase B, die alles Makisteron A enthält, \vorauf man die so erhaltene methanolische Lösung zur Trockne eindampft und den· Rückstand einer wiederholten Kristallisation aus destilliertem Wasser unterwirft, bis man vollständig reines Ecdyson erhält.

7. Verfahren nach Anspruch 6, insbesondere zur Gewinnung von reinem I-Iakir>teron A, dadurch gekennzeichnet, daß man die unlösliche PLose 33 wiederholt urakristallisiert und beim ersten Kai reines Methanol und bei

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den folgenden Malen Methanol enthaltend 1 fo Wasser verwendet, bis man·chromatographisch reines Makisteron A erhält.

8. Verfahren nach Anspruch 7, insbesondere zur Gewinnung von reinem Muristeron, dadurch gekennzeichnet, da/3 ü3an die Mutterlaugen in den verschiedenen Kristallisationsstufen vereinigt, bei niederer Temperatur zur Trockne eindampft, den erhaltenen Rückstand auf einer Silica-Gel-Säulc chromatographiert unter Verwendung νου Chloroform enthaltend 5 bi3 10 Vol.-# Methanol als Eluens, die S3.uate zur Trockne eindampft und den Rückstand aus iithylacetat zu kristallinem Muristeron mit Fp (korrigiert) 227 bis 23O⁰G umkristallisiert.

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