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Verfahren zur Herstellung des Farbstoffes des gelben Oxydationsfermentes.
In Zellmaterialien, wie Hefe und manchen Bakterien, wie Essigbakterien, Milchsäurebakterien, Buttersäurebakterien, tierischen Zellen und Geweben, wie Leber, der Netzhaut und andern, findet sich ein sauerstoffübertragendes Ferment von gelber Farbe neben andern Fermenten und Zellbestandteilen. Dieses Ferment besteht aus einer gefärbten Komponente, die an eine Eiweisskomponente gebunden ist und die man nach dem Verfahren des Patentes Nr. 149759 von dieser Eiweisskomponente trennen und in Form eines gelben Pulvers isolieren kann.
Es wurde nun gefunden, dass man diesen gelben Farbstoff ohne Isolierung des Ferments aus den Zellmaterialien gewinnen kann. Zu diesem Zweck braucht man nur tierische oder pflanzliche Zellen, die man zweckmässig vorher gewaschen, getrocknet oder zerkleinert hat, wie z. B. Unterhefe, mit solchen Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen zu behandeln, welche die Farbstoffkomponente des Fermentsystems zu lösen vermögen. Die Extraktion des Farbstoffes lässt sich bedeutend beschleunigen, wenn man den zum Extrahieren verwendeten Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen Säuren oder saure Salze zusetzt.
Bei Verwendung von Säuren und sauren Salzen kommt man auch zum Ziel, wenn man lediglich Wasser benutzt. Hiebei empfiehlt sich eine Erhöhung der Temperatur, um eine möglichst günstige Ausbeute zu erhalten.
Der gelbe Farbstoff des Oxydationsfermentes lässt sich in ein kristallines Abwandlungsprodukt überführen. Hiezu wird seine Lösung z. B. mit verdünnter Natronlauge alkalisch gemacht und belichtet, was z. B. mit einer Metallfadenlampe bewirkt werden kann. Hiedurch entsteht ein Abbauprodukt, das nach dem Ansäuern durch Ausschütteln mit Chloroform oder andern in Wasser nicht oder nicht vollständig mischbaren Lösungsmitteln von der wässrigen Lösung abgetrennt werden kann. (Der nicht belichtete Farbstoff kann der angesäuerten Lösung durch Lösungsmittel nicht entzogen werden.) Aus Wasser erhält man ihn in schön gelb gefärbten Nadeln.
Anstatt die alkalische Lösung des Farbstoffes der Einwirkung des Lichtes auszusetzen, kann man den gleichen Endeffekt ohne Belichtung dadurch erreichen, dass man Lösungen des Farbstoffes in Alkali längere Zeit stehenlässt oder erwärmt.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung näher zu erläutern, ohne jedoch dieselbe auf diese Beispiele zu beschränken.
Beispiel 1 : 10 kg Hefe werden mit 20l einer 10% igen Salzsäure in einem geeigneten Gefäss so lange gerührt, bis eine gleichmässige Masse entstanden ist. Dann wird langsam auf etwa 30-60 erwärmt und bei dieser Temperatur einige Stunden gehalten. Nun wird die gesamte Reaktionsmasse abgesaugt.
In der Flüssigkeit, die eine schöne grünlichgelbe Farbe ; aufweist, findet man den grössten Teil des gelben Farbstoffes aus dem Oxydationsferment verhältnismässig rein vor und es wird der Farbstoff, beispielsweise durch Einengen im Vakuum oder durch Fällung mit Caleiumsalzen, hieraus gewonnen.
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belichtet, unter Eiskühlung mit Chloroform unterschichtet, bis zur kongoauren Reaktion angesäuert und ausgeschüttelt. Hierauf geht der grünfluoreszierende Farbstoff ins Chlorofoim.
Setzt man dem zur Extraktion des Ausgangsproduktes verwendeten Gemisch von Wasser und Methanol so viel Salzsäure zu, dass das Lösungsgemisch etwa 5% freie Säure enthält, so ist die Extraktion schon nach etwa ein Drittel der sonst notwendigen Zeit beendet. Allerdings sind die so erhaltenen Lösungen nicht ganz so rein wie die ohne Säurezusatz erhaltenen.
Statt wässrigem Methanol lässt sich auch wässriger Äthylalkohol oder Aceton oder wässriger Alkohol mit Zusatz einer kleinen Menge von mit Wasser wenig oder nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie Äther, Essigäther od. dgl., verwenden. An Stelle der Salzsäure können auch Schwefelsäure, Phosphorsäure oder saure Salze, wie beispielsweise Bisulfat, benutzt werden.
Beispiel 3 : 2 kg Hefe werden mit 4l einer 10%igen Trichloressigsäurelösung im Mörser gut durchgerieben, bis eine homogene Masse entstanden ist. Dann wird bei Zimmertemperatur etwa zehn Stunden stehengelassen und nun abfiltriert.
Die erhaltenen Lösungen können dann, wie im Beispiel 2 erwähnt, weiter aufgearbeitet werden.
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Volumen etwa 20 e betrug, wird mit etwa 250 e. m3 einer Mischung von 3 Volumenteilen Methanol mit einem Volumenteil Wasser übergossen und 17 Stunden bei 380 geschÜttelt. Nach dem scharfen Abzentrifugieren wird eine grüngelbe Lösung erhalten, aus der sich der gelbe Farbstoff des Fermentes genau so abscheiden und reinigen lässt, wie es bei den aus Hefe gewonnenen Produkten beschrieben ist.
Zur Gewinnung des kristallinen Abwandlungsproduktes wird die Lösung des Farbstoffes auf eine Konzentration von halb normal bis normal NaOH gebracht und 48 Stunden stehengelassen. Nach dem Ansäuern kann man z. B. mit Chloroform den Farbstoff der Lösung extrahieren. Durch Verdampfen des Chloroforms und Umkristallisieren wird der Farbstoff in Form feiner Nadelbüschel erhalten.
Statt die alkalische Lösung stehenzulassen, kann man sie auch etwa zwei Stunden lang auf etwa 50-60'erwärmen. Der gereinigte Farbstoff kann im Hochvakuum unzersetzt sublimiert werden und schmilzt unter Zersetzung bei 320 .
PATENT-ANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung des Farbstoffes des gelben Oxydationsfermentes aus pflanzlichem oder tierischem Zellmaterial, dadurch gekennzeichnet, dass man zwecks unmittelbarer Gewinnung des Farbstoffes dieses Zellmaterial mit den Farbstoff lösenden Lösungsmitteln oder deren Gemischen behandelt und aus den so gewonnenen Lösungen den Farbstoff isoliert.