AT149759B - Verfahren zur Herstellung des gelben Oxydationsferments und seines Farbstoffes. - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung des gelben Oxydationsferments und seines Farbstoffes. 



   In der Biochemischen Zeitschrift, Bd. 254 (1932), S. 441 (Chem. Zentralblatt, 1933, Bd. I, S. 1456), ist ein Verfahren zur Darstellung einer ein sauerstoffübertragendes Ferment, das gelbe Oxydationsferment, neben andern Fermenten und Zellbestandteilen enthaltenden Lösung aus Hefe beschrieben. 



  Nach diesem Verfahren findet jedoch keine Abtrennung des Hämochromogens vom Ferment statt. Die erhaltenen Fermentlösungen sind äusserst unrein und enthalten das Ferment nur in einer Konzentration von etwa   6'10-5   Mol Liter. 



   Es wurde nun gefunden, dass man die dem Ferment anhaftenden Begleitstoffe und Verunreinigungen aus den rohen wässerigen Lösungen, die man aus tierischem oder pflanzlichem, das gelbe Oxy- 
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 setzt, dass das gelbe Oxydationsferment selber in Lösung bleibt, die Begleitstoffe und Verunreinigungen aber gefällt werden. Das in Lösung verbleibende gelbe Oxydationsferment lässt sich durch weiteren Zusatz eines derartigen Lösungsmittels und durch Umfällen aus   wässeriger Lösung   mit solchen Lösungsmitteln, Sättigen mit Kohlensäure und erneute Behandlung einer wässerigen Lösung des ausgefallenen Stoffes mit Lösungsmitteln der gekennzeichneten Art als gelbes Pulver abscheiden. Dieses stellt das gereinigte Ferment dar. 



   Es ist   natürlich   auch möglich, andere Methoden der Reinigung des Fermentes zu benutzen, nachdem es von dem grössten Teil seiner Begleitstoffe durch Fällung mit mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln getrennt worden ist. So kann man die gereinigte Lösung bei niedriger Temperatur konzentrieren und das Ferment mittels Wasser, Kohlendioxyd oder Lösungsmitteln umkristallisieren und umfällen. 



   Es wurde festgestellt, dass dieses Ferment aus einer gefärbten Komponente besteht, die an eine Eiweisskomponente gebunden ist, und dass man den Farbstoff von der Eiweisskomponente trennen und in kristallisierter Form isolieren kann. Die Abspaltung des Eiweiss von der Farbstoffkomponente findet im Gegensatz zu dem bei niedriger Temperatur gefällten Oxydationsferment bei längerer Einwirkungsdauer und höherer Temperatur   (380)   statt. Hiezu verfährt man am   zweckmässigsten   in der Weise, dass man das Eiweiss denaturiert und diese Denaturierung mit solchen Lösungsmitteln vornimmt, in denen der Farbstoff in Lösung bleibt. Solche   eiweissdenaturierenden Losungsmittel sind   z. B.

   Methyl-, Äthyl-und andere Alkohole, Aceton und andere Lösungsmittel, die für sich oder vorzugsweise in Mischung mit Wasser zur Anwendung gelangen. Man erhält dann eine eiweissfreie grün fluoreszierende Lösung des Farbstoffes, die katalytisch unwirksam ist, im Sichtbaren aber ein Absorptionsspektrum aufweist, das dem der ursprünglichen Fermentlösung sehr ähnlich ist. Gegen das Absorptionsspektrum des Fermentes sind seine Banden um 15-20   u.   nach Blau verschoben. Aus dieser eiweissfreien Lösung des Farbstoffes kann der Farbstoff selbst in kristallisierter Form erhalten werden, wenn man die Lösung alkalisch macht,   z.   B. mit verdünnter Natronlauge, und sodann beispielsweise mittels   einer Metall-oder Kohlenfadenlampe oder Sonnenlicht belichtet.

   Hiebei wird der Farbstoff umgewandelt   und kann nunmehr nach dem Ansäuern durch Ausschütteln mit Chloroform oder andern in Wasser nicht oder nicht vollständig mischbaren Lösungsmitteln, wie Tetrachlorkohlenstoff, Methylenchlorid, Benzol u. dgl., von der wässerigen Lösung abgetrennt werden, während der nicht belichtete Farbstoff der angesäuerten Lösung durch Lösungsmittel nicht entzogen werden kann. Aus Wasser erhält man ihn in schön gelb gefärbten Nadeln. 



   Anstatt die alkalische proteinfreie Lösung des Farbstoffes der Einwirkung von Licht auszusetzen, kann man den gleichen Endeffekt ohne Belichtung dadurch erreichen, dass man Lösungen des Farbstoffes in Alkali längere Zeit stehenlässt und erwärmt. 



   Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung näher zu erläutern, ohne jedoch dieselbe auf diese Beispiele zu beschränken. 



   Beispiel 1 : Zu einer Lösung der Fermente und andern Zellbestandteilen, wie sie z. B. nach dem im Chem. Zentralblatt 1933,   I,   S. 1456, beschriebenen Verfahren erhalten werden kann, gibt man 
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 mehr Aceton ausfällt, wieder in Wasser löst und bei 0  das halbe Volumen Aceton zufügt. Sättigt   man dann mit Kohlensäure, so fällt das Ferment als gelbrotes 01 aus, das aus seiner wässerigen Lösung   bei   0  mit   Methanol als leuchtend gelbes Pulver, das noch farblose Eiweisskörper enthält, niedergeschlagen wird. 
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   Beispiel 2 : Trennung des Farbstoffes von seiner   Eiweisskomponente.   



   Das nach Beispiel l erhaltene Fermentpulver wird bei 380 mit einer Mischung von einem Volumen Wasser und drei Volumen Methanol geschüttelt. Dadurch wird das Eiweiss denaturiert, während der Farbstoff in Lösung geht. Nach der Entfernung des ungelösten Eiweisses (z. B. durch Zentrifugieren) wird die eiweissfreie Lösung des Farbstoffes, die grün fluoresziert, im Vakuum eingedampft, wobei ein gelbes Pulver erhalten wird, das den Farbstoff des Oxydationsfermentes darstellt. 



   Beispiel 3   : Überführung   des Farbstoffes des gelben Oxydationsfermentes in seine kristallisierte Modifikation. 



   Der eiweissfreie Farbstoff (erhalten nach Beispiel 2) wird in n/2 Natronlauge gelöst und mit einer Metallfadenlampe belichtet. Dabei wird er umgelagert und geht beim Ansäuern in ein Produkt über, das man durch Extraktion mit Chloroform von der wässerigen Lösung abtrennt. Die Chloroformlösung wird dann vorsichtig konzentriert, wobei sich der umgelagert Farbstoff abscheidet. Er wird durch Umkristallisation aus Wasser in schön gelb gefärbten Nadeln erhalten. Das Produkt kann im Hochvakuum unzersetzt sublimiert werden. Der Farbstoff schmilzt unter Zersetzung bei   320 .   



   Beispiel 4 : Die Lösungen des Farbstoffes bzw. der isolierte rohe Farbstoff aus dem gelben Oxydationsferment, wie sie nach den Beispielen 2 und 3 erhalten werden, werden mit Alkali auf eine Konzentration von halbnormal bis normal NaOH gebracht und 48 Stunden stehen gelassen. Nach dem Ansäuern kann man beispielsweise mit Chloroform den Farbstoff aus der Lösung extrahieren. Durch Verdampfen des Chloroforms und Umkristallisieren wird der Farbstoff in Form feiner Nadelbüschel erhalten. 



   Statt die alkalische Lösung stehenzulassen, kann man sie auch etwa zwei Stunden lang auf etwa 50-600 erwärmen. 



   Beispiel 5 :   2'5     l   Leberpresssaft, hergestellt durch Auspressen eines Breies von fein zerkleinertem Gewebe der Leber mit der dreifachen Menge Wasser, werden, gegebenenfalls nach einer Vorreinigung mit   Bleisubacetat   (Liquor Plumbi subacetici DAB 6), in   ähnlicher Weise,   wie dies bei der Herstellung von Lebedevsaft geschieht, zur Gewinnung des gelben Oxydationsfermentes entsprechend den Ausführungen des Beispieles 1 behandelt. 



   PATENT-ANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung des gelben Oxydationsfermentes aus solches enthaltenden Lösungen, dadurch gekennzeichnet, dass man den rohen, aus tierischen oder pflanzlichen Zellen hergestellten Lösungen in der Kälte mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel zusetzt, sodann nach Abtrennung der ausgeschiedenen Anteile aus der verbleibenden Lösung das Oxydationsferment durch Zusatz weiterer Mengen derartiger Lösungsmittel ausfällt und gegebenenfalls dieses hierauf nach wiederholter Reinigung durch Wiederauflösen im Wasser und fraktionierte Fällung mit mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln aus der schliesslich erhaltenen Lösung durch Einleiten von Kohlensäure abscheidet.

Claims (1)

1. 2. Weitere Ausgestaltung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Gewinnung des einen Bestandteil des gelben Oxydationsfermentes bildenden Farbstoffes das nach Anspruch 1 erhaltene gereinigte Ferment mit eiweissdenaturierenden Lösungsmitteln, in denen der Farbstoff löslich ist, zusammenbringt und aus der hiebei erhaltenen Lösung den Farbstoff z. B. durch Verdampfen des Lösungsmittels abscheidet.

   3. Weitere Ausgestaltung des Verfahrens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man den nach Anspruch 2 erhältlichen Farbstoff in verdünnter Alkalilauge, vorzugsweise Natronlauge, löst, die Lösung der Einwirkung von Licht aussetzt, sodann nach dem Ansäuern mit Lösungsmitteln extrahiert, welche mit Wasser nicht oder nicht vollständig mischbar sind, und aus dem so erhaltenen Extrakte den Farbstoff abscheidet.

   4. Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Lösung des Farbstoffes in verdünnter Alkalilauge, vorzugsweise Natronlauge, längere Zeit bei gewöhnlicher oder kurze Zeit bei erhöhter Temperatur stehenlässt, sodann nach dem Ansäuern, wie im Anspruch 3 angegeben, extrahiert und den Farbstoff abscheidet.