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Verfahren zur Gewinnung reiner Antibiotika der
Tetracyclingruppe
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Antibiotika der Tetracyclingruppe aus einer Fermentationsflüssigkeit, aus der das Mycel durch Ansäuern und Filtrieren ausgeschieden wurde, oder aus einer unreinen Lösung, die Antibiotika der Tetracyclingruppe enthält. Die gegenständlichen Antibiotika der Tetracyclingruppe gehören in die Gruppe biologisch aktiver Stoffe, die von Perhydronaphthacen abgeleitet sind.
Das Grundskelett aller Tetracyclin-Antibiotika ist wie folgt :
EMI1.1
Die Substituenten können sich in den Stellungen, die in der folgenden Tabelle angeführt sind, befinden ; alle diese Antibiotika können mit dem Verfahren gemäss der Erfindung erhalten werden.
EMI1.2
<tb>
<tb>
Substituenten <SEP> Üblicher <SEP> Name <SEP> des <SEP> Antibioticum
<tb> 4-N <SEP> (CHj,) <SEP> ; <SEP> j, <SEP> 6-OH, <SEP> 6-CHg. <SEP> 12a-OH <SEP> Tetracyclin <SEP> (TC)
<tb> 4-N <SEP> (CHg2, <SEP> 5-OH, <SEP> 6-OH, <SEP> 6-CHs, <SEP> 12a-OH <SEP> 5-Oxytetracyclin <SEP> (OTC)
<tb> 4-N <SEP> (CHg2, <SEP> 6-OH, <SEP> 6-CH3, <SEP> 7-C1, <SEP> 12a-OH <SEP> 7 <SEP> - <SEP> Qllortetracyclin <SEP> (CT <SEP> C) <SEP>
<tb> 4-N <SEP> (CHg) <SEP> 2.
<SEP> 6-OH, <SEP> 6-CH3, <SEP> 7-Br, <SEP> 12a-OH <SEP> 7-Bromtetracyclin <SEP> (BrTC) <SEP>
<tb> 4-N <SEP> (CH <SEP> , <SEP> 6-OH, <SEP> 7-C1, <SEP> 12a-OH <SEP> 6-Demethylchlortetracyclin <SEP> (DCTC) <SEP>
<tb> 4-N <SEP> (CH3)2, <SEP> 6-OH, <SEP> 12a-OH <SEP> 6-Demethyltetracyclin
<tb> 4-N(CH3)2, <SEP> 6-CH3, <SEP> 12a-OH <SEP> 6-Desoxytetracyclin
<tb>
Nach den bisher bekannten Verfahren können die Antibiotika der Tetracyclingruppe aus der Fer- mentationsflüssigkeit oder aus unreinen Lösungen auf drei Arten gewonnen werden, u. zw. :
1. durch Ausfällen der Antibiotika mit einem entsprechenden Fällungsmittel und nachfolgende
Extraktion des ausgefällten Anteiles mit einem organischen Lösungsmittel ;
2. durch Extraktion des Antibiotikums aus wässeriger Lösung mit Hilfe eines Lösungsmittels, wel- ches das Antibiotikum gut löst und mit Wasser nicht mischbar ist ;
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3. durch Adsorption mit Hilfe von Ionenaustauschern, Aktivkohle usw.
Das Verfahren gemäss der Erfindung gehört in die erste Gruppe und betrifft daher die Isolierung der Tetracyclin-Antibiotika durch Ausfällen. Es umfasst die Gewinnung der Antibiotika der Tetracyclingruppe aus einer Fermentationsflüssigkeit, aus welcher das Mycel durch Ansäuern und Filtrieren mit entsprechenden Filtriermitteln ausgeschieden wurde. Zu diesem Zweck können vorteilhaft Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Oxalsäure, Chloressigsäure und andere Säuren verwendet werden. Die besten Ergebnisse werden erhalten, wenn der pH-Wert vor dem Filtrieren unterhalb 3, 0 liegt. Das Antibiotikum kann anstatt aus der Fermentationsflüssigkeit auch aus unreinen Antibiotikumlösungen erhalten werden.
Nach dem Verfahren gemäss der Erfindung werden einer Fermentationsflüssigkeit oder einer unreinen Lösung des Antibiotikums der Tetracyclingruppe Wolframsäure oder ihre Salze, die in Wasser oder in den erwähnten wässerigen Lösungen löslich sind, zugesetzt. Die Löslichkeit des Wolframats ist bei Fällung nicht von wesentlicher Bedeutung, weil wegen Komplexbildung des Wolframations mit dem Antibiotikum das Wolframat ständig gelöst wird und mit anwesendem Antibiotikum reagiert: somit wird das Wolframat vollständig gelöst.
Von den Salzen der Wolframsäure wurden folgende Verbindungen herangezogen :
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<tb>
<tb> Verbindung <SEP> Molekulargewicht
<tb> Ammonium-Metawolframat <SEP> (NH4)2W4O13 <SEP> . <SEP> 8 <SEP> H2O <SEP> 1123, <SEP> 65 <SEP>
<tb> Ammonium-Parawolframat <SEP> (NH4)6W7O24 <SEP> . <SEP> 6 <SEP> H2O <SEP> 1887,36
<tb> Cadmium-Borowolfram <SEP> at <SEP> Cd2B2W9O32 <SEP> . <SEP> 18 <SEP> H2O <SEP> 2737,49
<tb> Phosphor-Wolframsäure <SEP> Pros. <SEP> 12 <SEP> WO3 <SEP> . <SEP> 42 <SEP> H2O <SEP> 3680, <SEP> 00 <SEP>
<tb> Kalium-Orthowolframat <SEP> K2WO4 <SEP> . <SEP> 2H2O <SEP> 362,09
<tb> Kalium-Metawolfram <SEP> at <SEP> K <SEP> 0. <SEP> 8 <SEP> H2O <SEP> 1165, <SEP> 77 <SEP>
<tb> Kalium-Parawolframat <SEP> K6W7O24 <SEP> . <SEP> 6 <SEP> H2O <SEP> 2013,72
<tb> Natriumwolframat <SEP> Na2WO4 <SEP> .
<SEP> 2 <SEP> H2O <SEP> 293,84
<tb> Natriumwolframat, <SEP> handelsübliches <SEP>
<tb> Produkt <SEP> NaWO. <SEP> : <SEP> \0 <SEP> 329, <SEP> 87 <SEP>
<tb> Natrium-Parawolframat <SEP> Na6W7O24 <SEP> . <SEP> 16 <SEP> H2O <SEP> 2097,22
<tb>
EMI2.2
durchschnittliche Ausbeute beträgt 99, 30/0. Ein grosser Überschuss von Wolframat übt einen wesentlichen Einfluss auf die Löslichkeitserhöhung des Wolframat-Antibiotikum-Komplexes aus. Es kann vorausgesetzt werden, dass ein löslicher Komplex des Antibiotikums mit Wolframationen entsteht.
Die Fällung kann bei PH 0, 5-7, 0 erfolgen. Es wurde gefunden, dass man die Antibiotika der Tetracyclingruppe mit Wolframsäuresalzen nur im sauren Medium fällen kann. Vorzugsweise werden Wolframate mit einem Molekulargewicht von über 500 herangezogen, da bei diesen der pH-Wert der Lösung bei Fällung keinen wesentlichen Einfluss ausübt. In sehr sauren Lösungen kann man einfache Wolframate vom Typus ME. WO, verwenden.
Das Ansäuern hat die Fällung des Antibiotikum-Komplexes mit Wolframsäuresalzen zur Folge ; die Zusammensetzung des Komplexes ist vom PH abhängig. Der pH-Wert der Lösung übt einen Einfluss auch auf die Zusammensetzung des Wolframsäuresalzes aus, da in saurem Medium zuerst das Molekulargewicht des Wolframats einige Male erhöht wird, weil Monowolframat bei PH 6, 0-8, 0 reversibel in Hexawolframsäure-Ionen nach der Gleichung
EMI2.3
übergeht.
Es wurde gefunden, dass die Komplexe der Antibiotika der Tetracyclingruppe sogar bis PH 0, 5 - 1
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beständig sind. Bei einem pH-Wert von oberhalb 4, 0 bilden sich wahrscheinlich Komplexe mit Parawolframaten vom Typus M35H7W6O24, in stärker saurem Medium bei PH unterhalb 4, 0 entstehen jedoch Komplexe mit Salzen vom Typus MeH, WgO .
Dies wurde durch Analysen der Komplexe, die bei verschiedenen pH-Werten erhalten wurden, bestätigt. So enthält z. B. der Komplex des Tetracyclins mit NaWO :
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<tb>
<tb> 1. <SEP> erhalten <SEP> bei <SEP> pH <SEP> 6,0 <SEP> 46,4% <SEP> anorganischer <SEP> Substanz
<tb> 2. <SEP> erhalten <SEP> bei <SEP> PH <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 47, <SEP> rf1/0 <SEP> anorganischer <SEP> Substanz
<tb> 3. <SEP> erhalten <SEP> bei <SEP> pH <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 48, <SEP> rf1/0 <SEP> anorganischer <SEP> Substanz
<tb> 4. <SEP> erhalten <SEP> bei <SEP> PH <SEP> unterhalb <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> 49, <SEP> 91o <SEP> anorganischer <SEP> Substanz.
<tb>
Die gleichen Ergebnisse mit einem Fehler von : 2% zeigten mikrobiologische Analysen zur Bestimmung des Antibiotikum-Gehaltes im Komplex.
Ausser dem Einfluss des pH der Lösung auf die Komplex-Zusammensetzung und dadurch auch auf die Menge des Wolframsäuresalzes, das zur Fällung des Antibiotikums nötig ist, übt der pH-Wert noch einen stärkeren Einfluss auf die Menge des Antibiotikums, das aus der Lösung isoliert wird, aus. Bei höheren pH-Werten als 4, 0 konnten aus der Lösung nur 40% des Antibiotikums isoliert werden, bei einem optimalen pH von 1 bis 2, 5 bleiben jedoch nach der Isolierung des Antibiotikums aus der Lösung von
EMI3.2
<tb>
<tb> 1. <SEP> 5039 <SEP> y/ml <SEP> CTC <SEP> 27 <SEP> y/ml
<tb> 2. <SEP> 5039 <SEP> γ/ml <SEP> OTC <SEP> 31 <SEP> y/ml
<tb> 3. <SEP> 3080y/mlTC <SEP> 52 <SEP> y/ml <SEP>
<tb> 4. <SEP> 1820y/mlBrTC <SEP> 14 <SEP> y/ml <SEP>
<tb> 5.800 <SEP> γ
/ml <SEP> DCTC <SEP> 9 <SEP> y/ml
<tb>
Auf Grund der angeführten Resultate konnte festgestellt werden, dass man - um ein regelmässiges und wirtschaftliches Verfahren zu sichern - dem PH der Antibiotikumlösung bei der Komplex-Fällung grosse Aufmerksamkeit widmen muss, besonders auch deshalb, weil man merken kann, dass sich der pH-Wert der Antibiotikumlösung bei Fällung wegen des zugefügten Wolframats stark ändert.
Die entstandene Komplex-Fällung wird mit einem Filtriermittel, z. B. Dicalit, vermischt und filtriert. Der Filterrückstand wird mit Wasser gewaschen, vom Filter entfernt und wiederholt in Wasser suspendiert. Durch Zusatz von 10%igem Natriumhydroxyd wird der pH-Wert auf 8, 5 eingestellt und dabei der Komplex gelöst. Die erhaltene Suspension wird filtriert ; der Niederschlag, der das Filtriermittel enthält, wird mit Wasser von pH 9, 0 gewaschen. Nach dem Waschen des Filtriermittels werden die Filtrate vereinigt und zum besseren Reinigen der Antibiotika wiederholt mit einer solchen Menge von 10 bis 20'figer Salzsäure gefällt, dass der pH-Wert 1, 5- 2, 0 erreicht. Der ausgeschiedene Komplex wird nach der Zugabe von Filtriermittel wiederholt filtriert und mit angesäuertem destilliertem Wasser gewaschen.
Die Fällung wird mehrmals in Wasser suspendiert, die Suspension mit lOigem Natriumhydroxyd bis pH 8, 5-10 versetzt und wiederholt filtriert. Das Filtriermittel wird mit Wasser, welches einen pH-Wert von ungefähr 9, 0 hat, gewaschen ; die Filtrate werden vereinigt und weiter verarbeitet,
Das Antibiotikum kann man aus einer solchen alkalischen Lösung vorzugsweise auf folgende zwei Weisen isolieren :
1. Durch Fällung mit Calcium- oder Magnesiumchlorid oder Mischungen dieser beiden Stoffe ;
2. durch Isolierung mit Hilfe von Ionenaustauschern.
Demnach besteht das Verfahren gemäss der Erfindung zur Gewinnung von Antibiotika der Tetracyclingruppe aus einer Fermentationsflüssigkeit, aus der das Mycel durch Ansäuern und Filtration abgetrennt wurde, oder aus einer unreinen Lösung, die das Antibiotikum der Tetracyclingruppe enthält, in seinem Wesen darin, dass man der Fermentationsflüssigkeit oder unreinen Lösung Wolframsäure oder ihre
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berechnet auf NaWO. 2 H20, bei einem pH-Wert von 0, 5 bis 7,0, vorzugsweise einem pH-Wert von 1, 0 bis 2, 5, zusetzt, den durch Filtration isolierten Niederschlag mit einer zuigen Lösung von Natriumhydroxyd bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 8, 5 bis 10, 0 versetzt und aus der erhaltenen Lösung das Antibiotikum in an sich bekannter Weise,
vorzugsweise mit Calcium-und/oder Magnesiumchlorid und/oder mit Hilfe von Ionenaustauschern, isoliert.
Beim Arbeiten mit Calcium- oder Magnesiumchlorid wird der alkalischen Lösung des Wolfram-
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Antibiotikum-Komplexes mit einem PH-Wert von 8, 5 bis 10 bis zum Erreichen eines pH von etwa 7, 5, 10-20% ige Salzsäure und danach noch festes Ammonchlorid im Gewichtsverhältnis von 1 : 1 bis l : 3 zugesetzt. Durch den Zusatz von Ammonchlorid wird die Fällung von Calcium- oder Magnesiumwolframat verhindert.
Nach der Zugabe von Ammonchlorid wird eine 10-20%oigne Lösung von Calciumoder Magnesiumchlorid zugesetzt und danach der pH-Wert der Lösung mit Hilfe von 100/oigem Natrium-
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hydroxyd später einen starken Einfluss auf das Filtrieren ausübt. bei schneller Zugabe von Natriumhydroxyd bemerkt man eine Tendenz zur Bildung eines fein-dispergierten Niederschlages, der später sehr schwer zu filtrieren ist. Bei langsamer Zugabe von Natriumhydroxyd erhält man jedoch einen Niederschlag von gröberer Struktur, der auch ohne Filtriermittel gut filtrierbar ist.
Das calciumsalz des Antibiotikums filtriert man mit oder ohne Filtriermittel und wäscht esmit destilliertem Wasser, welchem etwas calciumchlorid zugesetzt wurde. Das Filtrat wird mit dem Waschwasser vereinigt und aus den vereinigten Filtraten das Natriumwolframat zurückgewonnen. Das gewaschene Calciumsalz des Antibiotikums wird zusammen mit dem Filtriermittel vom Filter entfernt und im Vakuum bei 30 - 40 mm Hg bei einer Temperatur von 40 bis 500 C getrocknet. Das trockene Calciumsalz wird mit Methanol, Isobutanol. Methylbutylketon oder einem andern Alkohol oder Keton, der vorher mit Wasser gesättigt und mit Salzsäure bis PH 2, 0 angesäuert wurde, extrahiert.
Zur Entfernung von Verunreinigungen wird die z. B. methanolische Lösung mit Aktivkohle versetzt.
Dann wird die Aktivkohle abfiltriert und das adsorbierte Antibiotikum mit angesäuertem Methanol gewaschen.
Zur Abscheidung von Metallionen aus dem Antibiotikum kann man den Methanolextrakt durch eine Säule mit Ionenaustauscher fliessen lassen. Dadurch erhält man ein Antibiotikum von hohem Reinheitsgrad. Nach Durchwandern der Säule wird der methanolische Extrakt im Vakuum auf 1/4 des Volumens eingeengt und dadurch auf an sich bekannte Weise das Hydrochlorid oder die Base des Antibiotikums erhalten. Der Reinheitsgrad der erhaltenen Kristalle von Antibiotikum-Hydrochlorid beträgt etwa 800 bis 910 y/mg und die Ausbeute nach dem Umkristallisieren 85-900/o, berechnet auf die Menge des Antibiotikums in der Fermentationsflüssigkeit.
Beim Verfahren zur Isolierung des Antibiotikums mittels Ionenaustauscher lässt man die erhaltene Antibiotikum-Komplex-Lösung bei PH 8, 5-10, 0 mit einer Geschwindigkeit von 5 bis 50 ml/min durch die Säule mit Kationenaustauscher, z. B. Duolit C-25 (Polystyrolsulfosäure, Herstellerfirma Chemical Process Co., Redwood City, Kalifornien, U. S. A.), fliessen, wobei man ein Verhältnis von Filtrat zu Ionenaustauscher von 3 : 1 bis 2 : 1 anwendet. Nach dem Austreten aus der Säule wird die' Flüssigkeit zur Wiedergewinnung von Wolframat verwendet.
Das Antibiotikum wird aus dem Kationenaustauscher mit n-bis 4n-Ammoniumhydroxyd eluiert.
Das Eluat konzentriert man im Vakuum bei 30 mm Hg bei einer Temperatur von 40 bis 450 C auf 1/3 des ursprünglichen Volumens. Die konzentrierte Lösung verdünnt man mit destilliertem Wasser im Verhältnis 1 : 1 und lässt sie durch Anionenaustauscher, z. B. Amberlite IRC 411 (vernetztes Polystyrolgerüst mit Sulfosäuregruppen, Herstellerfirma Röhm & Haas, Philadelphia, U. S. A.), fliessen ; damit entfernt man die letzten Spuren von Wolframationen. Die Menge des Austauschers und der Lösung soll in einem Verhältnis von ungefähr 1 : 1 stehen und die Durchflussgeschwindigkeit durch die Säule soll 10 - 30 ml/min betragen.
Das Eluat wird im Vakuum bei 30 mm Hg bei einer Temperatur von 40 bis 450 C auf 1/3 des ursprünglichen Volumens eingeengt. Aus dem konzentrierten Eluat wird das reine Antibiotikum auf an sich bekannte Weise erhalten. Durch Umkristallisieren aus Methanol erhält man Kristalle eines Reinheitsgrades von 990 bis 1000 y/mg. Die Ausbeute beträgt 85 - 900/0, berechnet auf die Menge des Antibiotikums in der Fermentationsflüssigkeit.
Um die Antibiotikum-Base zu erhalten, setzt man dem wässerigen Konzentrat l dignes Natriumhydroxyd oder Ammoniumhydroxyd bis PH 3, 5-4, 0 zu. Durch Zugabe von einigen Körnern von isoelektrischem Tetracyclin wird eine bessere Kristallisation der Antibiotikum-Base erzielt. Nach 10- bis 24stündigem Stehen scheidet sich die Antibiotikum-Base aus ; man filtriert sie, wäscht mit Wasser und Butanol und trocknet durch Lyophilisation.
Aus dem Filtrat, das nach der Filtration von Calcium- oder Magnesiumsalz des Antibiotikums der Tetracyclingruppe erhalten wurde bzw. aus der Ausflusslösung des ersten Ionenaustauschers, wird die
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Wolframsäure auf bekannte Weise, z. B. mit konz. Salzsäure, abgetrennt und wieder verwendet. Das Filtrat des Calciumsalzes des Antibiotikums kann bei folgenden Chargen wiederholt zur Fällung verwendet werden, soferne man vorher das überschüssige Wasser auf die Hälfte des ursprünglichen Volumens einengt. Es wurde gefunden, dass man die Wolframatlösung ohne Regenerierung fünfmal ohne Beeinträchtigung des Reinheitsgrades des erhaltenen Antibiotikums verwenden kann.
Mit der Zeit häufen sich jedoch im Filtrat grössere Mengen an Natriumchlorid und Ammonchlorid an, die bei der Neutralisierung gebildet werden, weshalb das Wolframat regeneriert werden muss. Man regeneriert es über Wolframsäure auf folgende Weise :
Nach der Fällung des Calciumsalzes des Antibiotikums wird das Filtrat auf 1/3 des Volumens eingeengt und dann die Hz WO 4 mit überschüssiger konz. Salzsäure gefällt. Der Überschuss an Salzsäure sowie eine hohe Konzentration des Wolframats in der Lösung haben einen guten Einfluss auf die Bildung der Wolframsäure, der Einfluss der Temperatur hingegen ist minimal. Durch den Salzsäureüberschuss wird die Sedimentierung der Fällung schneller und die Filtration leichter.
Die ausgeschiedene Wolfram- säure wird abfiltriert und mit äeigem Natriumhydroxyd in stöchiometrischem Verhältnis vermischt.
Die auf diese Weise bereitete Lösung von Natriumwolframat kann wieder zur Fällung des Antibiotikums verwendet werden.
Die Komplexe der Antibiotika der Tetracyclingruppe mit Wolframationen sind beständige Verbindungen, die durch mehrmalige Fällung gereinigt werden können. Die Komplexe wirken gleichfalls antibiotisch, jedoch sind sie etwa um 501o weniger wirksam als die reinen Antibiotika.
Die erhaltenen Komplexe stellen tatsächlich neue Verbindungen dar, wie durch UR-, UV-und Röntgen-Spektren nachgewiesen wurde. So zeigt das UR-Absorptionsspektrum vom Komplex des Chlortetracyclins mit NaWO. 2 H O in Kaliumbromid relative Durchlässigkeit von Infrarotstrahlung in Abhängigkeit von der Wellenlänge bzw. der Frequenz.
Nach dem Verfahren der Erfindung erhaltene Antibiotika enthalten kein Wolfram. Das wurde mit Hilfe der Spektralanalyse nachgewiesen. Proben von Antibiotikum wurden im Quarztiegel verbrannt, womit das Streuen des Musters im Lichtbogen verhindert und gleichzeitig die Genauigkeit der Messung erhöht wurde. Die Muster wurden nachher einem Gleichstrom-Lichtbogen von 10 A ausgesetzt. Die Emissionsspektren wurden mit Spektrograph Jerrel-Ash 3, 4 met Ebert auf Platten Kodak Scientific Plateg 00 mit Expositionszeit von 70 sec aufgenommen. Mit Hilfe dieser Emissionsspektren wurde nachgewiesen, dass nach dem Verfahren gemäss der Erfindung erhaltene Antibiotika kein Wolfram, für welches die Linien der Wellenlängen 2944, 39, 2946, 98 und 2947, 38 A charakteristisch sind, enthalten.
Das Verfahren gemäss der Erfindung hat den Vorteil, dass bei der Fällung das Antibiotikum in hoher Ausbeute erhalten wird, weil bei richtigem PH maximal nur 10 des nicht-gefällten Antibiotikums in der Fermentationsflüssigkeit zurückbleibt, und dass man die Mittel zur Fällung des Antibiotikums, d. h. die Wolframate, später zurückgewinnen und wieder einsetzen kann. Ferner hat die Fällung mit Wolframsäuresalzen noch den Vorteil, dass die Wolframationen mit keiner Komponente der Fermentationsflüssigkeit oder der unreinen Lösung eine Fällung bilden, weshalb praktisch alle übrigen Stoffe in Lösung bleiben und das Antibiotikum nicht verunreinigen.
Auf Grund der Fällung in saurem Medium wird das Antibiotikum nicht abgebaut, wogegen bei der Fällung in alkalischem Medium nach den bekannten Verfahren teilweise ein Abbau stattfinden kann. Es ist bekannt, dass einige Antibiotika der Tetracyclingruppe gegen alkalische Verbindungen sehr empfindlich sind ; in saurem Medium sind sie jedoch beständig.
Vom wirtschaftlichen Standpunkt aus gesehen hat das Verfahren gemäss der Erfindung noch einen weiteren Vorteil im Vergleich zu den bisher bekannten Verfahren, bei welchen das Mittel zur Fällung der Antibiotika verworfen werden muss, weil es nach der Isolierung des reinen Antibiotikums nicht isoliert werden kann bzw. das Verfahren zur Isolierung des Fällungsmittels nicht ökonomisch wäre. Dieser Vorteil besteht darin, dass man beim Verfahren gemäss der Erfindung maximal l o des Mittels zur Fällung des Antibiotikums verliert, und diese Menge wird dauernd ersetzt.
Beispiel 1: 201 Fermentationsflüssigkeit werden mit 20% iger Salzsäure bis pH 2, 6 angesäuert und danach mit dem Filtriermittel Dicalit 4108 versetzt und filtriert. Die Fällung wird wiederholt und der Niederschlag in Wasser, das mit Salzsäure bis pH 1, 5-2, 0 angesäuert wurde, suspendiert und nochmals filtriert. Das erste und zweite Filtrat werden vereinigt und zur weiteren Bearbeitung 2, 5 1 abgenommen. Die Menge des Chlortetracyclins in der Fermentationsflüssigkeit betrug 3723 y/ml. Nachdem
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2 HzO inmitberücksichtigt.
Der erhaltene Niederschlag wird vom Filter abgenommen und in 400 ml destilliertem Wasser suspendiert und dann wird langsam l00/oiges Natriumhydroxyd bis PH 8, 5 zugefügt. Durch die pH-Erhöhung geht der Komplex in Lösung. Anschliessend wird 20% igue Salzsäure stufenweise bis zum Erreichen eines PH-Wertes von 1, 5 bis 2, 0 zugesetzt. Der ausgeschiedene Komplex wird wieder filtriert und mit Wasser, das mit Salzsäure auf PH 2, 5 angesäuert wurde, gewaschen.
Der Niederschlag wird in Wasser suspendiert und mit 100/oigem Natriumhydroxyd bis PH 8, 5-9, 0 versetzt. Der erhaltenen alkalischen Lösung setzt man 20% ige Salzsäure bis PH 7, 5, danach 30 g festes Ammonchlorid und noch 300 ml 10% iger Lösung von Calciumchlorid zu ; schliesslich wird der pH-Wert der Lösung mit 10% igem Natriumhydroxyd auf 8, 0-8, 2 eingestellt. Das Zusetzen von Natriumhydroxyd muss sehr langsam erfolgen, damit man einen gut filtrierbaren Niederschlag erhält.
Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und mit destilliertem Wasser, dem etwas Calciumchlorid zugefügt wurde, gewaschen. Die Filtrate werden aufgehoben und zur neuerlichen Fällung des Antibiotikums bzw. zur Regenerierung des Wolframats verwendet. Das gewaschene Calciumsalz des Antibiotikums wird vom Filter entfernt und im Vakuum bei 30-40 mm Hg bei einer Temperatur von 40 bis 450 C getrocknet. Nach dem Trocknen wird es mit Methanol, das mit Salzsäure auf PH 2, 0 angesäuert wurde, extrahiert. Der methanolische Extrakt wird mit Aktivkohle versetzt, die Aktivkohle abfiltriert und das Filtrat im Vakuum auf 1/4 des ursprünglichen Volumens eingeengt, worauf zum methanolischen Konzentrat 30% ige Salzsäure zugefügt und dieses wiederholt auf 1/3 des Volumens eingeengt wird.
Nach Abdampfen von überschüssigem Methanol beginnt das Chlortetracyclin-Hydrochlorid zu kristallisieren.
Nach Beginn der Kristallisation wird die Destillation unterbrochen ; beim Erkalten kristallisiert das Chloretracyclin-Hydrochlorid weiter. Die Abgeschiedenen Kristalle des Antibiotikums werden abfiltriert, mit kaltem Methanol gewaschen und getrocknet.
Man erhält 12, 1 g des Antibiotikums vom Reinheitsgrad 800 y/mg. Nach dem Umkristallisieren aus Methanol erhält man Antibiotikum vom Reinheitsgrad 980 y/mg.
B e i s p i e l 2: 2,6 l filtrierte Fermentationsflüssigkeit, die nach dem Verfahren von Beispiel 1 erhalten wurden, werden auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde, behandelt, doch wird statt NaWO. 2 HO in diesem Fall Natrium-Parawolframat (NaO. 16 H2O) im gleichen Gewichtsverhältnis zu Antibiotikum von 1, 2 : 1, berechnet auf Na2WO4 . 2 HO, verwendet.
Man erhält 11, 3 g des Antibiotikums vom Reinheitsgrad 850 y/mg.
Beispiel 3 : 51 filtrierte Fermentationsflüssigkeit, die nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 erhalten wurden, werden mit Kalium-Parawolframat (K, W-0 . 6 H O) im Verhältnis zu Antibiotikum. von 1, 3 : 1, berechnet auf NaZWo4'2 HzO, versetzt. Da die Fermentationsflüssigkeit 18, 62 g des Antibiotikums enthält, muss man also 22, 0 g Kalium-Parawolframat, gelöst in 400 ml destilliertem Wasser, zusetzen.
Nach dem Zusatz von Kalium-Parawolframat wird der pH-Wert durch Zugabe von 10% figer Salzsäure auf 2, 0 eingestellt und dann die Suspension mit 100 g Dicalit 4108 vermischt und durch Büchnertrichter filtriert. Der Niederschlag wird mit 100 ml destilliertem Wasser, welchem 1 mol looier Salzsäure zugefügt wurde, gewaschen. Der gewaschene Niederschlag wird vom Filter entfernt und in 800 ml destilliertem Wasser suspendiert. Mit Hilfe von 10@obigem Natriumhydroxyd wird der pH-Wert auf 8, 5 eingestellt. Die Suspension wird filtriert und der Niederschlag, der Dicalit enthält, mit 500 ml destilliertem Wasser, welchem 20 ml l oiges Natriumhydroxyd zugesetzt wurde, um den pH-Wert auf 9, 0 bis 10, 0 einzustellen, gewaschen.
Nachdem das Dicalit gewaschen wurde, werden die Filtrate vereinigt und der Wolframkomplex des Antibiotikums wiederholt mit 20% figer Salzsäure gefällt ; die Salzsäure wird stufenweise zugegeben, bis ein pH von 1, 5 bis 2, 0 erreicht ist. Der ausgeschiedene Komplex wird wiederholt mit 100 g Dicalit filtriert und mit 100 ml angesäuertem destilliertem Wasser (1 ml 10%iger Salzsäure auf 100 ml Wasser) gewaschen.
Der gewaschene Niederschlag wird in 100 ml destilliertem Wasser suspendiert und der pH-Wert mit
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liertes Wasser) gewaschen. Die Filtrate werden vereinigt und weiter verarbeitet. Der Niederschlag am Filter wird verworfen. Das Filtrat wird mit piger Salzsäure bis pH 7, 5 angesäuert, darauf setzt man 60 g festes Ammonchlorid zu. Ferner werden anschliessend noch 200 ml 20% igue Lösung von Magnesiumchlorid und hierauf tropfenweise eine l00/oige Lösung von Natriumhydroxyd zugesetzt, bis ein PH von
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8, 0 bis 8, 2 erreicht ist.
Das ausgeschiedene Magnesiumsalz des Chlortetracyclins wird mit Hilfe von 50 g Dicalit filtriert.
Der erhaltene Niederschlag wird mit 80 ml Wasser, dem 1 g Magnesiumchlorid zugesetzt worden war, gewaschen.
Die Filtrate werden aufbewahrt und später zur Regenerierung von Wolframat verwendet. Das gewaschene Magnesiumsalz des Chlortetracyclins wird vom Filter entfernt und im Vakuum bei 30 bis 40 mm Hg bei einer Temperatur von 40 bis 450 C getrocknet. Das trockene Magnesiumsalz wird stufenweise mit 3 1 Methanol, das 30 ml konzentrierte Salzsäure enthält, extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und filtriert, um das suspendierte Dicalit zu entfernen.
Der filtrierte Extrakt wird mit 4 g Aktivkohle versetzt, auf 400 C erwärmt und schnell filtriert. Der erhaltene Niederschlag von Aktivkohle wird mit 80 ml angesäuertem Methanol gewaschen. Die Filtrate werden vereinigt und das Methanol so lange abdestilliert, bis 2, 2 1 Methanol abdestilliert sind ; danach setzt man 60 ml konz. Salzsäure zu und destilliert weiter, bis das Chlortetracyclin-Hydrochlorid zu kristallisieren beginnt. Das geschieht meistens, wenn ungefähr 600 - 700 ml Methanol abdestilliert sind.
Beim Erkalten kristallisiert das Chlortetracyclin-Hydrochlorid weiter.
Die ausgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert und mit 20 ml kaltem Methanol gewaschen. Man erhält 20, 8 g Chlortetracyclin-Hydrochlorid vom Reinheitsgrad 810 y/mg.
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mit Dicalit 4108 versetzt und filtriert. Der Niederschlag wird in Wasser, das mit Salzsäure bis PH 1, 5 bis 2, 5 angesäuert wurde, suspendiert und wiederholt filtriert. Das erste und zweite Filtrat werden vereinigt. Die Menge des Chlortetracyclins in diesen beträgt 5039 y/ml.
5 l der filtrierten Fermentationsflüssigkeit werden mit 10% figer Salzsäure, bis zum Erreichen von
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der pH-Wert wieder auf 2, 0 eingestellt.
Den Niederschlag lässt man sedimentieren und dann wird filtriert. Die Menge des Antibiotikums im Filtrat beträgt 27 y/ml ; auf diese Weise werden aus der Fermentationsflüssigkeit 99, 470/0 des Antibiotikums isoliert.
Der Niederschlag des Komplexes von Chlortetracyclin mit Wolframationen wird vom Filter abgenommen und in 11 destilliertem Wasser suspendiert, danach wird langsam 10% igue Natronlauge zugesetzt, bis ein pH-Wert von 8, 5 erreicht ist. Die Lösung wird filtriert und das Filtrat langsam mit lomiger Salzsäure bis PH 1, 5-2, 0 versetzt. Der abgeschiedene Komplex wird wiederholt abfiltriert, der Niederschlag vom Filter entfernt, in 2 l Wasser suspendiert und mit 10% figer Lösung von Natriumhydroxyd bis pH 7, 5-8, 0 versetzt.
Diese alkalische Lösung lässt man durch eine Säule von 4 cm Durchmesser, welche mit 800 g Kationenaustauscher Duolit C-25 (Polystyrolsulfosäure) gefüllt ist, fliessen. Die Durchflussgeschwindigkeit beträgt 20 ml/min.
Nach dem Austreten aus der Säule wird die Lösung zur Wiedergewinnung von Wolframat verwendet.
Das Antibiotikum wird aus dem Austauscher mit 4 l n-Ammoniumhydroxyd eluiert und das erhaltene Eluat im Vakuum bei 30 mm Hg bei einer Temperatur von 450 C auf ein Volumen von 1, 41 eingeengt.
Die konzentrierte Lösung wird mit 11 destilliertem Wasser verdünnt, dann lässt man sie mit einer Geschwindigkeit von 15 ml/min durch eine Säule von 2 cm Durchmesser, welche mit 300 g Anionenaustauscher Amberlite IRC 411 (vernetztes Polystyrolgerüst mit Sulfosäuregruppen) beschickt ist, fliessen, um die letzten Spuren von Wolframationen zu entfernen.
Das Eluat wird im Vakuum bei 30 mm Hg und bei einer Temperatur von 40 bis 450 C auf ein Volumen von 800 ml eingeengt. Dem eingeengten Eluat wird konz. Salzsäure bis PH 1, 5 zugesetzt und hierauf wird es weiter eingeengt, bis sich Kristalle auszuscheiden beginnen. Nun wird die Lösung mit Natriumchlorid gesättigt und langsam erkalten gelassen. Die ausgeschiedenen Kristalle von Chlortetracyclin-Hydrochlorid werden abfiltriert und mit 20 ml kaltem destilliertem Wasser gewaschen.
Man erhält 27, 1 g Chlortetracyclin-Hydrochlorid vom Reinheitsgrad 890 y/mg. Durch Umkristallisieren gewinnt man ein Produkt mit einem Reinheitsgrad von 960 y/mg ; die Ausbeute ist 821o, berechnet auf die gesamte Menge des Antibioticum in der Fermentationsflüssigkeit.
Beispiel 5: Es werden 5 1 Fermentationsflüssigkeit, die auf die in Beispiel 4 angeführte Weise erhalten wurden, verwendet. Der Chlortetracyclin-Gehalt beträgt 5039 y/ml. Das Verfahren nach Beispiel 4 wird wiederholt, jedoch mit dem Unterschied, dass man statt NazWO,. 2 HzO zur Fällung Kalium-Metawolframat (KO. 8 HO) im Verhältnis von 1, 2 : 1 zur Gesamtmenge des vorhandenen
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Chlortetracyclins verwendet.
Nach dem Umkristallisieren erhält man reines Chlortetracyclin-Hydrochlorid vom Reinheitsgrad 980 y/mg. Die Ausbeute nach der Kristallisation beträgt 820/0.
Beispiel 6 : 21 Fermentationsflüssigkeit des Oxytetracyclins, aus welcher das Mycel entfernt wurde und die 6200 γ/ml Oxytetracyclin enthält, werden mit 17 g NaWO. 2 HO, gelöst in 100 ml destilliertem Wasser, versetzt ; danach wird der pH-Wert durch Zugabe von 10 figer Salzsäure auf 2,0 eingestellt.
Der ausgefällte Niederschlag wird 4 h stehengelassen und dann wird filtriert. Der Niederschlag vom Filter wird in 700 ml destilliertem Wasser suspendiert und durch wiederholten Zusatz von 10% igem Natriumhydroxyd bis PH 8, 5 gelöst.
Nach dem Lösen des Niederschlages fällt man den Wolframatkomplex des Antibiotikums wiederholt mit 20% piger Salzsäure, welche bis PH 1, 5 zugesetzt wird. Den ausgefällten Komplex lässt man 6 h stehen, dann wird der Niederschlag abfiltriert und mit angesäuertem Wasser von PH 1, 5 gewaschen.
Der gewaschene Niederschlag wird vom Filter entfernt und in destilliertem Wasser suspendiert ; hierauf wird 10% iges Natriumhydroxyd zugefügt, bis der Niederschlag völlig in Lösung geht und ein pH-Wert von 9,0 erreicht ist.
Durch Zusatz von 20% iger Salzsäure wird der PH auf 7, 5 vermindert und nun werden 40 g festes Ammonchlorid und sofort danach 70 ml einer 20% gen Lösung von Calciumchlorid und anschliessend
EMI8.1
Den abgeschiedenen Niederschlag lässt man 6 h lang stehen und filtriert dann. Der Niederschlag wird mit 60 ml destilliertem Wasser, das 1 g Calciumchlorid enthält, gewaschen. Das Filtrat wird für eine neuerliche Fällung des Antibiotikums bei der nächsten Charge oder zur Regenerierung von Wolframat aufbewahrt.
Das gewaschene Calciumsalz des Oxytetracyclins wird im Vakuum bei 30 - 40 mm Hg bei einer Temperatur von 400 C getrocknet. Das trockene Calciumsalz wird nach und nach mit 2, 5 l Methanol, welchem 25 ml konz. Salzsäure zugefügt wurde, extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt, filtriert und bei einer Temperatur von 40 C mit 10 g Aktivkohle versetzt. Die Aktivkohle wird abfiltriert und mit 100 ml angesäuertem Methanol gewaschen. Den Extrakt lässt man durch eine Säule mit 200 g Amberlite IR 110 (Polystyrolgerüst mit quaternären Ammoniumgruppen, Herstellerfirma Röhm & Haas, Pennsylvania, U. S. A.), fliessen und dann wird die Säule mit 200 ml Methanol gewaschen. Nach dem Ausfliessen aus der Säule wird die Flüssigkeit im Vakuum auf ein Volumen von 11 eingeengt, mit 40 ml konz.
Salzsäure versetzt und wiederholt destilliert, bis sich Kristalle auszuscheiden beginnen. Beim Erkalten erfolgt eine weitere Kristallisation, die etwa 10 h dauert.
Die Ausbeute beträgt 89%, der Reinheitsgrad des Oxytetracyclin-Hydrochlorids 900 y/mg.
B e i s p i e l 7: 2 l Fermentationsflüssigkeit, die auf die in Beispiel 6 angegebene Art erhalten wurden, werden auf gleiche Weise behandelt, jedoch mit dem Unterschied, dass zur Fällung 14 g Ammonium-Metawolframat (NH4)2W4O13. 8 HO und zur Extraktion des Calciumsalzes statt Methanol 2 1 Isobutylketon, gesättigt mit Wasser, und 30 ml konz. Salzsäure, verwendet werden.
Die Ausbeute beträgt 92%, der Reinheitsgrad 800 y/mg.
Beispiel 8 : 101 Fermentationsflüssigkeit mit einem Gehalt an Oxytetracyclin von 4100 y/ml werden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise vom Mycel abgetrennt. Zur weiteren Verarbeitung nimmt man 5 I und vermindert den pH-Wert durch Zusatz von 10% iger Salzsäure auf 1, 0, danach werden noch 30 g konzentrierter Lösung von Naz WO,. 2 HzO zugefügt und der pH wieder durch Zugabe von 10% figer Salzsäure auf 1, 0 gebracht.
Der Niederschlag wird 4 h lang stehen gelassen und danach wird filtriert. Das Filtrat enthält 41 y/ml des Oxytetracyclins und somit sind 99, 490/0 der Gesamtmenge des Antibiotikums isoliert. Der Niederschlag wird vom Filter entfernt, in 800 ml destilliertem Wasser suspendiert und mit 10%igem Natriumhydroxyd bis PH 8, 5 versetzt. Die Lösung wird filtriert und das Filtrat langsam mit 10%iger Salzsäure versetzt, bis ein PH von 1,0 erreicht ist. Der abgeschiedene Komplex wird wieder abfiltriert, der Niederschlag vom Filter abgenommen und wiederholt in 11 destilliertem Wasser suspendiert und durch Zugabe von 10%obigem Natriumhydroxyd auf PH 7, 5-8, 0 gebracht.
Die alkalische Lösung lässt man mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 15 ml/min durch eine Säule mit Kationenaustauscher Duolit C-25 fliessen. Nach dem Austreten aus der Säule lässt man die Flüssigkeit wiederholt durch in gleicher Weise gefüllte Säulen fliessen. Nach dem Austreten aus der zweiten Säule wird die Flüssigkeit aufbewahrt und dann zur Rückgewinnung von Wolframat verwendet.
Das Antibiotikum wird aus dem Austauscher mit 3 1 n-Ammoniumhydroxyd, welches zuerst durch
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die zweite und danach durch die erste Säule geschickt wird, eluiert. Das erhaltene Eluat konzentriert man im Vakuum bei 30 mm Hg bei einer Temperatur von 450 C auf ein Volumen von 11.
Die konzentrierte Lösung wird mit 500 ml destilliertem Wasser verdünnt und hierauf mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 15 ml/min durch eine Säule mit einem Durchmesser von 2 cm, die mit 300 g Amberlite IRC 411 gefüllt ist, durchfliessen gelassen. Die Flüssigkeit, die aus der Säule austritt, wird im Vakuum auf 500 ml eingeengt. Zu dieser konzentrierten Flüssigkeit fügt man Salzsäure bis pH 1, 5 zu und engt sie auf ein Volumen von 100 ml ein. Die erhaltene Lösung wird mit Natriumchlorid gesättigt und langsam gekühlt. Die ausgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert, mit 20 ml kaltem destilliertem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Die Ausbeute beträgt 840got der Reinheitsgrad 880 y/mg.
Beispiel 9 : 51 Fermentationsflüssigkeit, welche 6200 y/ml Tetracyclin enthalten, werden vom Mycel abgeschieden, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Zur abfiltrierten Fermentationsflüssigkeit mit einem PH-Wert von 2, 0 werden 42 g Na2WO,. 2 H. O, gelöst in 200 mi Wasser, zugefügt und dann wird 10% igue Salzsäure bis zum Erreichen eines PH von 2, 0 zugesetzt.
Den Niederschlag lässt man 4 h stehen und danach wird filtriert. Der Niederschlag wird vom Filter entfernt, in 500 ml destilliertem Wasser suspendiert und mit 10"/oigem Natriumhydroxyd bis PH 8, 5 versetzt. Die Lösung wird filtriert und dem Filtrat langsam 10% igue Salzsäure zugefügt, bis ein PH von 1, 0 erreicht ist. Der ausgeschiedene Komplex wird wiederholt abfiltriert, der Niederschlag in 200 ml destilliertem Wasser suspendiert und mit 10%obigem Natriumhydroxyd bis PH 7, 5-8, 0 versetzt.
Die alkalische Lösung lässt man mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 30 ml/min durch eine Säule mit Kationenaustauscher Duolit C-25 fliessen. Die Lösung, die aus der Säule ausfliesst, wird durch eine zweite, gleich gefüllte Säule geschickt und nach dem Austreten aus der zweiten Säule zur Regenerierung von Wolframat aufbewahrt.
Das Antibiotikum eluiert man aus dem Austauscher mit 31 g n-Ammoniumhydroxyd, das man zuerst durch die zweite und danach durch die erste Säule schickt ; das erhaltene Eluat konzentriert man im Vakuum bei 30 mm Hg bei einer Temperatur von 400 C auf ein Volumen von 400 ml und lässt es nachher mit einer Geschwindigkeit von 20 ml/min durch die Säule, welche mit Amberlite IRC 411 gefüllt ist, fliessen. Die Lösung, die aus der Säule austritt, wird im Vakuum auf ein Volumen von 200 ml eingeengt und der pH-Wert mit lomiger Salzsäure auf 3, 8 eingestellt ; dann wird die Lösung mit Kristallen von Tetracyclin gesättigt.
Das erhaltene Gemisch wird 2 h gemischt und über Nacht im Kühlschrank stehengelassen. Dann wird filtriert, der Niederschlag von Tetracyclinbase an der Luft getrocknet und lyophilisiert.
Die Ausbeute beträgt 78go, der Reinheitsgrad 830 y/mgr
Beispiel 10 : 51 einer nach Beispiel 9 erhaltenen Fermentationsflüssigkeit werden mit 36 g Natrium-Parawolframat (NagWO. 16 H2O) versetzt und der pH-Wert mit lomiger Salzsäure auf 1, 5 eingestellt. Danach werden unter Mischen 150 g Dicalit 4180 zugegeben, worauf filtriert wird.
Der Niederschlag wird in 1, 5 I destilliertem Wasser suspendiert und mit 10%obigem Natriumhydroxyd bis zum Vorliegen von PH 8,5 versetzt. Die Suspension wird filtriert und der Niederschlag mit 500 ml Wasser von pH 10, 0 gewaschen. Das Hauptfiltrat und das Waschfiltrat werden vereinigt und dann wird der Wolfram-Komplex des Tetracyclins durch Zugabe von 20% figer Salzsäure bis PH 2, 0 wieder gefällt.
Der ausgefallene Komplex wird wiederholt mit 100 g Dicalit filtriert und mit 100 ml angesäuertem destilliertem Wasser eines pH-Wertes von 2, 0 gewaschen. Der gewaschene Niederschlag wird in 600 ml destilliertem Wasser suspendiert und die Suspension mit 10%obigem Natriumhydroxyd bis PH 9, 0 versetzt und dann wieder filtriert. Der Niederschlag wird mit 400 ml destilliertem Wasser, das einen PH von 9, 0 bis 10, 0 hat, gewaschen. Die Filtrate werden vereinigt, mit 10' iger Salzsäure bis pH 7, 5 ange- säuert und hierauf werden 60 g Ammonchlorid zugesetzt.
Dann werden noch 160 ml einer 20% gen Lösung von Calciumchlorid und 10 ml einer l%oigen alkoholischen Lösung von Dodecylcarbamylmethyl- - benzyl-dimethyl-ammonium-chlorid und tropfenweise eine 10% igue Lösung von Natriumhydroxyd bis pH 8, 0-8, 2 zugesetzt. Das ausgeschiedene Calciumsalz des Tetracyclins wird mit Hilfe von 50 g Dicalit filtriert. Der Niederschlag wird mit 80 ml destilliertem Wasser mit einem Gehalt von 1 g Calciumchlorid gewaschen.
Das Filtrat wird zur Regenerierung von Wolframat verwendet. Das gewaschene Calciumsalz des Tetracyclins wird im Vakuum bei 30 mm Hg bei einer Temperatur von 40 bis 450 C getrocknet. Das trockene Calciumsalz wird allmählich mit 2 1 Methanol, der 25 ml konz. Salzsäure enthält, extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und filtriert. Der filtrierte Extrakt wird mit 5 g Aktivkohle versetzt, auf 400 C erwärmt und schnell filtriert. Der Niederschlag von Aktivkohle wird mit 100 ml angesäuertem
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Methanol gewaschen. Die Filtrate werden vereinigt und das Methanol im Vakuum abdestilliert. Es wird so lange destilliert, bis 1, 5 I Methanol abdestilliert sind. Danach fügt man 200 ml destilliertes Wasser zu und destilliert weiter, bis 600 ml Methanol abdestilliert sind.
Der Destillationsrückstand wird mit 100bigem Natriumhydroxyd bis zum Vorliegen eines pH-Wertes von 3, 8 bis 4, 0 versetzt und mit Kristallen von isoelektrischem Tetracyclin angeimpft. Das erhaltene Gemisch wird 2 h gemischt und 14 h im Kühlschrank zur Kristallisation stehengelassen. Die ausgeschiedenen Kristalle von Tetracyclinbase werden mit n-Butanol und Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet.
Die Ausbeute beträgt 92%, der Reinheitsgrad 860 y/mg.
B e i s p i e l 11: 5 l Fermentationsflüssigkeit gemäss Beispiel 10 werden auf die in diesem Beispiel beschriebene Weise behandelt, jedoch mit der Abweichung, dass man das Gewichtsverhältnis von Na- trium-Parawolframat, welches zur Fällung notwendig ist, berechnet als NazWO". 2 HzO, zu Tetracyclin von 0, 5 : 1 auf 4, 0 : 1 ändert.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben.
EMI10.1
<tb>
<tb> Na2WO4 <SEP> . <SEP> 2 <SEP> H2O <SEP> Tetracyclin <SEP> Ausbeute <SEP> % <SEP> Reinheitsgrad <SEP> y/mg <SEP>
<tb> 0, <SEP> 5- <SEP> 1 <SEP> 38, <SEP> 5 <SEP> 890
<tb> 0, <SEP> 7 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 59, <SEP> 4 <SEP> 870
<tb> 0,9 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 75,4 <SEP> 820
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 80, <SEP> 2 <SEP> 840
<tb> 192-1 <SEP> 9115 <SEP> 860 <SEP>
<tb> 1, <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 92, <SEP> 0 <SEP> 840
<tb> 1, <SEP> 5 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 89, <SEP> 0 <SEP> 870
<tb> 1, <SEP> 7 <SEP> 1 <SEP> 78, <SEP> 0 <SEP> 710
<tb> 2, <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 76, <SEP> 0 <SEP> 730
<tb> 2, <SEP> 4 <SEP> :
<SEP> 1 <SEP> 72, <SEP> 0 <SEP> 700
<tb> 2, <SEP> 8 <SEP> 1 <SEP> 77, <SEP> 0 <SEP> 650 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 70. <SEP> 2 <SEP> 690
<tb> 3, <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 65, <SEP> 0 <SEP> 700
<tb> 4, <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 63, <SEP> 5 <SEP> 700
<tb>
Die Ausbeute ist auf das Endprodukt und nicht auf das aus Fermentationsflüssigkeit isolierte Tetracyclin bezogen.
B e i s p i e l 12: 2 l Fermentationsflüssigkeit nach Beispiel 10 werden auf die im Beispiel 10 beschriebene Weise behandelt, wobei jedoch abweichend davon der pH-Wert der Lösung vor der Fällung mit Natrium-Parawolframat von 0, 5 bis 7, 0 beträgt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angeführt :
EMI10.2
<tb>
<tb> PH <SEP> Ausbeute <SEP> % <SEP> Reinheitsgrad <SEP> y/mg <SEP>
<tb> 0,5 <SEP> 95,0 <SEP> 880
<tb> 0, <SEP> 7 <SEP> 94, <SEP> 3 <SEP> 890
<tb> 0,9 <SEP> 93,5 <SEP> 870
<tb> 1,1 <SEP> 95,0 <SEP> 800
<tb> 1, <SEP> 3 <SEP> 93, <SEP> 0 <SEP> 850
<tb> 1,5 <SEP> 92,0 <SEP> 860
<tb> 1, <SEP> 7 <SEP> 93, <SEP> 0 <SEP> 850
<tb> 2, <SEP> 0 <SEP> 92, <SEP> 0 <SEP> 840
<tb> 2,5 <SEP> 89,0 <SEP> 820
<tb> 3, <SEP> 5 <SEP> 70, <SEP> 0 <SEP> 700
<tb> 4, <SEP> 0 <SEP> 70, <SEP> 0 <SEP> 750
<tb> 4, <SEP> 5 <SEP> 58, <SEP> 0 <SEP> 700
<tb> 5, <SEP> 0 <SEP> 40, <SEP> 0 <SEP> 700
<tb> 6, <SEP> 0 <SEP> 40, <SEP> 0 <SEP> 580
<tb> 7, <SEP> 0 <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP> 380
<tb>
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Beispiel 13 :
101 einer unreinen wässerigen Lösung, die 800 γ/ml Brometetracyclin enthält, werden mit lomiger Salzsäure bis pH 2,0 angesäuert und mit 12 g Na2 WO 4'2 H20 versetzt und dann wird 1/2 h stark gemischt.
Der abgeschiedene Niederschlag von Wolframat-Komplex mit Bromtetracyclin wird 2 h lang stehengelassen und hierauf wird filtriert. Der Niederschlag wird in 300 ml Wasser suspendiert, die Suspension mit 10%obigem Natriumhydroxyd bis PH 9, 0 versetzt und danach schnell filtriert. Das Filtrat wird mit 10% figer Salzsäure bis PH 2, 0 versetzt, 4 h stehengelassen und hierauf wird filtriert. Der Niederschlag wird mit 400 ml Wasser, welches mit 10% iger Salzsäure angesäuert wurde, gewaschen.
Der gewaschene Niederschlag wird durch Zusatz von 10% gem Natriumhydroxyd bis zum Erreichen eines PH von 9, 5 gelöst ; dann werden 20% ige Salzsäure bis PH 7, 6 und 20 g Ammonchlorid und sofort danach 150 ml einer 20% igen Lösung von Calciumchlorid zugesetzt.
Unter Mischen wird 10% igues Natriumhydroxyd bis PH 8, 5 zugegeben und es wird noch eine weitere halbe Stunde gemischt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit 200 ml destilliertem Wasser gewaschen und im Vakuum bei 30 mm Hg bei 30 - 450 C getrocknet. Der Niederschlag wird mit 800 ml Methanol, der mit 20 ml konz. Salzsäure angesäuert wurde, extrahiert.
Der Extrakt wird filtriert und im Vakuum bei 30 mm Hg bei einer Temperatur von 300 C auf ein Volumen von 200 ml eingeengt. Der Abdampfrückstand wird mit 100 ml destilliertem Wasser verdünnt und unter starkem Mischen noch mit 10% igem Natriumhydroxyd bis PH 4. 5- 5, 0 versetzt ; dann wird die Mischung 1 h lang stehengelassen. Der abgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit destilliertem Wasser gewaschen und durch Lyophilisation getrocknet.
Die Ausbeute beträgt 86%, der Reinheitsgrad von Bromtetracyclinbase 750 y/mg.
Beispiel 14 : 101 einer unreinen Lösung, welche 1000 γ/ml Bromtetracyclin enthält, wird auf die gleiche Weise wie es in Beispiel 13 beschrieben ist, behandelt, jedoch mit dem Unterschied, dass
EMI11.1
aus der das Mycel auf die Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, entfernt wurde, werden mit 12 g Kalium-Parawolframat versetzt. Nach Zugabe vonKalium-Parawolframat wird der PH-Wert mit 10% iger Salzsäure auf 1, 5 eingestellt. Es wird 4 h stehengelassen und danach filtriert.
Der Niederschlag wird mit 200 ml angesäuertem Wasser von PH 1, 5 gewaschen,'in 300 ml destilliertem Wasser suspendiert und langsam mit 10% igem Natriumhydroxyd bis pH 8, 5 versetzt und filtriert ; dem Filtrat werden 10% igue Salzsäure bis PH 7,5, 30 g Ammonchlorid und 65 ml einer 20% igen Lösung von Calciumchlorid zugefügt. Dann wird unter starkem Mischen 20% ige Salzsäure bis pH 6, 5 zugegeben.
Das abgeschiedene Calciumsalz des Demethylchlortetracyclins wird filtriert und mit 40 ml Wasser gewaschen. Die Filtrate werden für eine spätere Zurückgewinnung von Wolframat aufbewahrt. Das gewaschene Calciumsalz wird im Vakuum getrocknet, dann allmählich mit 1, 5 1 Methanol, welchem 20 ml konz. Salzsäure zugefügt wurden, extrahiert. Die Filtrate werden vereinigt, mit 8 g Aktivkohle versetzt, auf 400 C erwärmt und schnell filtriert. Der Niederschlag von Aktivkohle wird mit 50 ml angesäuertem Methanol gewaschen. Der methanolische Extrakt wird mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 10 ml/min durch eine Säule, die Amberlite IRC 50 enthält, geschickt. Die Säule wird mit 100 ml angesäuertem Methanol ausgewaschen.
Nach dem Ausfliessen aus der Säule wird die Flüssigkeit im Vakuum auf ein Volumen von 400 ml eingeengt ; dann werden 10 ml konz. Salzsäure zugefügt und die Mischung wird auf ein Volumen von 100 ml eingeengt und 24 h lang stehengelassen.
Die abgeschiedenen Kristalle von Demethylchlortetracyclin-Hydrochlorid werden mit Methanol gewaschen und abfiltriert.
Die Ausbeute beträgt 86%, der Reinheitsgrad 680 γ/mg.
Beispiel 16 : 51 einer unreinen wässerigen Lösung, welche 1200y/mlDesoxytetracyclin enthält, werden auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 15 beschrieben ist, behandelt, jedoch mit der Abweichung, dass man zur Fällung des Wolfram-Komplexes mit Antibiotikum 16 g NaWC. 2 H20ver- wendet.
Die Ausbeute beträgt 91%, der Reinheitsgrad 740 y/mg.