DE2510926A1

DE2510926A1 - Daunomycine und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE2510926A1
Application number: DE19752510926
Authority: DE
Inventors: Federico Arcamone; Aurelio Dimarco; Sergio Penco
Original assignee: Farmaceutici Italia SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1974-03-20
Filing date: 1975-03-13
Publication date: 1975-09-25
Also published as: GB1457559A; SE7503084L; ATA202875A; AU7919775A; DK109275A; CA1046508A; DK146541B; SU589926A3; SE434843B; FR2264554B1; NL176636C; NL176636B; BE826848A; JPS5833880B2; DE2510926B2; AT338419B; SE7503084A; DK146541C; NL7503079A; JPS50126657A

Description

DIpL-lng. P. WIRTH · Dr. V. SCHMIED-KOWARZ1K Dlpl.-lng. G. DANNENBERG · Dr. P. Vn/EINHOLD - Dr. D. GUDEL

■" 281134 6 FRANKFURT/M.

TELEFON (0611) _2g70}4 Ga ESCHENHEIMER STB.39

Case: G-524
wd/um

SOCIETA FARMACEÜTICI ITALIÄ. S.p.A. 1/2 Largo Guido Donegani
1-20121 Mailand
Italien

"Daunomycine und Verfahren zu deren Herstellung"

509839/0906

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur chemischen Synthese von Daunomycin und dessen p-Anomer, der 4'-epi-Daunomycinmischung von cc- und ß-Anomer sowie jedes einzelnen Anomers und auf die dabei erhaltenen neuen Produkte.

Daunomycin und Daunomycinon sind in der GB-PS 1 033 383 beschrieben und beansprucht.

Der vollständige Name von 4'-epi-Dsunoinycin-a-anomer ist 7-0-(3'-AmInO-Z",3',6'-trideoxy-a-L-arabinohexopyranosyl)-daunomycinon.

Der vollständige Name von 4'-epi-Daunomycin-ß-anomer ist. 7-0- (3 '-Ämino-2 ' ,3 ' ,6 '-trideoxy-3-L-arabinohexppyranosyl) daunomycinon.

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß Daunomycinon der Formel

CGCH,

{1}

(ebenfalls beschrieben und beansprucht in der GB-PS 1 033 383) mit einem Derivat von Daunosamin (3-Amino-2,3,6-trideoxy-L-lyxohexose) der Formel

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o^ih⁰¹

(H)

oder von 4'-epi-Daunosamin (3-Amino-2,3,6-trideoxy-L-arabinohexose) der Formel

(III)

unter Bildung der pharmakologisch aktiven Glycoside der Formeln

OCH.

(IV) (Daunomycin),

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- Tf

O OH

COCH.

(VI) und

COCH.

(VII)

HO

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kondensiert wird. In der Praxis muß die Hexose (II) oder (III) geschützt und in ein 1-Derivat, wie ein Halogenid, übergeführt werden, das für die Kondensation mit Daunomycinon geeignet ist. Nach der Kondensation werden die Schutzgruppen entfernt.

Die 3-Aminogruppen in der Hexose (II) und (m) müssen mit Gruppen geschützt werden, deren Entfernung ohne weitere Zersetzung der Produkte, die unterschiedlich chemisch empfindliche Gruppen enthalten, durchgeführt werden kann. Die N-Trifluoracetylgruppe kann durch milde alkalische Behandlung zufriedenstellend entfernt werden.

Die Hexosen (II) und (III) müssen in Derivate übergeführt werden, die eine ausreichende .Stabilität besitzen, um bei der Synthese verwendet zu werden. Die Instabilität von 1-Halogenderivaten von 2-Deoxyzuckern ist wohl bekannt (W.W.Zorbach et al., Advances in Carbohydrate Chemistry, 1966, 21_, 273) .

Die Tri-trifluoracetylderivate der Hexosen (II) und (III) werden erfindurrsgemäß mit trockenem Chlorwasserstoff umgesetzt, wobei die entsprechenden 1-Chlorhexosen erhalten werden. Diese sind feste Verbindungen, die mehrere Tage unter wasserfreien Bedingungen gelagert werden können.

Was geeignete Reaktionsbedingungen für die Synthese der Glycosidbindung betrifft, ermöglicht die wohlbekannte Koenigs-Knorr-Reaktion (J.Conchie, G.A.Lewy und C.A.Marsh, Advances in Carbohydrate Chemistry, 1957, V2, 157) einen Bereich unterschiedlicher Bedingungen, die Modifikationen des Lösungsmittels, der Temperatur, des Katalysators

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sowie des Chlorwasserstoff- oder Bromwasserstoffakzeptors einschließen. Die Modifikationen sind deshalb wichtig, als gewöhnlich ein Optimum an Einzelbedingungen notwendig ist, um eine annehmbare Reaktionsgeschwindigkeit zu erzielen.

Die Anwendung von Standardbedingungen auf die

1-Halogenderivate der 2-Deoxyzucker führt zu den entsprechenden Glycalen (Zorbach et al., siehe oben). Das erfindungsgemäße Verfahren besteht in einer milden Behandlung von Daunomycinon (I) mit 1-Chlor-N,0-di-trifluoracetylderivat.:der Hexose (II) oder (III) in einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform oder Methylendichlorid, in Anwesenheit eines Katalysators, wie einem Quecksilberhalogenid (z.B. Quecksilberbromid), und eines Chlorwasserstoffakzeptors (z.B. Quecksilberoxyd). Die Endprodukte können durch Entfernen des N-Trifluoracetyls mit verdünntem Alkali erhalten werden.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern, ohne daß diese jedoch hierauf beschränkt sein soll.

Beispiel 1: 1g Hydrochlorid von Daunosamin (II) wird im wasserfreien Diäthyläther suspendiert und bei O⁰C mit 8 ml Trifluoressigsäureanhydrid behandelt. Nach Stehenlassen während 2 Stunden bei 0⁰C und 1 Stunde bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt und der Rückstand aus Dichlormethan kristallisiert, wobei 1,1 g Tri-trifluoracetyldaunosamin erhalten werden, Fp. 132 bis 134°C, Massespektrum m/e 391 (M-44), 322 (M-113).

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- ir -

0/5 g dieses Produktes werden in wasserfreiem Diäthyläther bei O⁰C mit wasserfreiem Chlorwasserstoffgas behandelt. Nach Stehenlassen über Nacht bei 5°C wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, wobei 1-Chlor-N_fO-di-trifluoracetyldaunosamin als öliges Produkt erhalten wird (es kann auch 1-Chlor-2,3/6-trideoxy-3-trifluoracetamido-4-trifluoracetoxy-L-lyxohexopyranose genannt werden).
NMR (CDCl₃): 1,22 6 (Duplett, J=6,5 Hz, 3H, CH₃),

2,05 bis 2,70 6 (Multiplett, 2H, C(2)H₂),

4,46 δ (Duplett-Quartet, J=6,5 Hz und J-iiHz,

1H, C(5)H),

4,60 bis 5,10 δ (Multiplett, 1H, C(3)H),

5,37 δ (C, W= 6,0 Hz, "1H, C(4)H) , rl

6,29 δ (Multiplett, W= 6,5 Hz, 1H, C(I)H) und

rl

6,37 δ (breites Singlett, 1Η, NH).

300 mg (0,75 mMol) fein pulverisiertes Daunomycinon (I) werden in 75 ml wasserfreiem Chloroform gelöst und mit 600 mg Quecksilberoxyd, 150 ml Quecksilberbromid und einem Molekularsieb (3$, Merck) behandelt.

Die Suspension wird 1 Stunde lang gerührt, worauf 600 mg 1-Chlor-N,0-trifluoracetyldaunosamin zugesetzt werden. Die Mischung wird 64 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert. Die Lösung wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 200 ml Methanol aufgenommen und 15 Minuten lang am Rückfluß erhitzt. Der Rückstand, der nach

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Entfernung des Lösungsmittels verbleibt, wird auf einer Kieselsäuresäule unter Verwendung einer Mischung von ChloroforrniBenzoltMethanol 100:20:3 (bezogen auf das Volumen) als Eluierungsraittel chromatographiert.

Außer nichtumgesetztem Daunomycinon werden 220 mg N-Trifluoracetyldaunomycin, Fp. 169 bis 171⁰C (nach Umkristallisieren aus Tetrahydrofuran und Hexan) und 20 mg N-Trifluoracetyldaunomycin (3-Isomer), Fp. 138 bis 140⁰C, [ctC + 440° (c = 0,1 in Chloroform) erhalten.

0,20 g N-Trif luoracetyldaunomycin v/erden in 20 ml 0/1N wässerigem Natriumhydroxyd gelöst. Die erhaltene Lösung wird nach 30 Minuten Stehenlassen bei Raumtemperatur mit O,1N wässerigem Chlorwasserstoff behandelt, um den pH-Wert auf 8,6 zu bringen, und wiederholt mit Chloroform extrahiert.

Die Extrakte werden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, auf ein kleines Volumen eingeengt und mit 0,1N methanolischem Chlorwasserstoff auf einen pH-Wert von 4,5 angesäuert, um die Kristallisation von Daunomycinhydrochlorid zu ermöglichen. Dieses ist in jeder Hinsicht mit dem durch Fermentation erhaltenen Produkt (siehe F.Arcamone et al., Gazzetta Chimica Italiana, 1970, 100, 949) identisch.

Die Ausbeute ist praktisch quantitativ.

Beispiel 2: 1g 2,3,6-Trideoxy-3-trifluoracetamido-L-arabinohexose wird in 20 ml wasserfreiem Diäthyläther suspendiert und bei O⁰C mit Trifluoressigsäureanhydrid behandelt.

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-JT-

Die Mischung wird weiter, wie im Beispiel 1 beschrieben, behandelt, wobei eine quantitative Ausbeute an 2,3,6-Trideoxy-N,O-di-trifluoracetyl-L-arabinohexopyranosylchlorid erhalten wird. *
NMR (CDCl₃): 1,30 δ (Duplett, J = 6,0 Hz, 3H, CH₃),

2,25 bis 2,80 δ (Multiplett, 2H, C(2)H₂), 4,20 bis 4,65 δ (Multiplett, 1H, C(5)H), 4,65 bis 5,15 δ (Multiplett, 2H, C(3)H und C(4)H), 6,25 6 (Multiplett, W_H=6,0 Hz, 1H, C(I)H) und 6,45 δ (breites Singlett, 1H, NH).

Eine Lösung von 0,5 g Daunomycinon in wasserfreiem Chloroform wird mit 1 g Quecksilberoxyd, 0,25 g Quecksilberbromid und 10 g Molekularsieb (3Ä, Merck) sowie O,5 g 2,3,6-Trideoxy-N,O-di-trifluoracetyl-L-arabinchexopyranosylchlorid behandelt. Die Mischung wird 24 Stunden lang . gerührt, die Feststoffe werden abfiltriert und es wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Methanol aufgenommen, 15.Minuten lang am Rückfluß gehalten, zur Trockene eingedampft und auf einer Kieselsäuresäule unter Verwendung einer Mischung von Chloroform:Benzol:Methanol 10:20:3 als Eluierungsmittel chroraatographiert. Das Hauptprodukt, das erhalten wird, ist eine Mischung im Verhältnis von 70:30 α- und 3-7-0-(N-Trif luoracetyl-4*-epi-daunosaminyl) -daunomycinon (Ausbeute nach Kristallisation, aus Chloroform 0,3 g) . Dieses Material wird nach Behandeln mit O,1N Natriumhydroxyd, wie oben beschrieben, quantitativ in eine Mischung der entsprechenden α- und 3-Glycoside in Form freier Baen übergeführt.

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Das Produkt wird durch Silikagelchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Chloroform:Methanol: Wasser 135:20:2 (bezogen auf das Volumen) als Eluierungsmittel in die α- und 3-Anomeren getrennt. Es werden

23° ο 0,16 g a-Anomer (4'-epi-Daunomycin (VI)) /äJ_D + 320 (c = 0,045 in Methanol), Fp. 199 bis 201°C, und 0,06 g ß-Anomer (VII), Fp. 182 bis 184°C erhalten.

Biologische Wirksamkeit der Verbindungen (VI) (4 '-epi-Daunomyciri^ und (VII) (4'-epi-Daunomycin, 3-Anomer)

Die Verbindungen (VI) und (VII)' zeigen hervorragende biologische Eigenschaften als starke Inhibitoren von Zellrai.tose und proliferative Wirksamkeit in Kulturellen in vitro. Sie zeigen auch eine wesentliche Wirksamkeit auf durch.onkogene Viren induzierte ZeHtransformationen. Sie besitzen bei Mäussn eine Antituniorwirksamkeit, wie durch eine Zunahme der mittleren Überlebenszeit bei nichttoxischen Dosen bei Tieren, die eine Anzahl von experimentellen Tumoren aufwiesen, gezeigt (Tabellen 1 bis 4).

Die cardiotoxische in vitro-Aktivität der Verbindung (VI) ist sehr gering (niedriger als jene von Daunomycin), wie aus dem folgenden Versuch hervorgeht*

Das Vorfahren besteht in der Kultivierung einzelner Herzzellen, die durch Tripsinisierung vom Herzen neugeborener Mäuse isoliert wurden. Nach 3 bis 4 Tagen konnten die Kulturen, die Anhäufung schlagender Zellen zeigten, sowohl vom Gesichtspunkt der Frequenz als auch des Rhythuxs studiert werden (Necco A., Dasdia T. IRCS, 2_: 1293, 1974).

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Tabelle 1

Wirkung der Verbindungen (VI) und (VII) auf den mykotischen Index und proliferative Wirksamkeit von kultivierten HeLa-Zellen bei verschiedenen Expositionszeiträumen.

Die Ergebnisse sind als Prozentsatz unbehandelter Kontrollen ausgedrückt.

Verbindung

Dosis
^ug/ml)

M^kotischer Index

4 Std.

8 Std.

137
95
52

103
67
40

85
88
0

Kolcniezählungen

8 Std.

24.Std

86
37"
17

70
18
6

VI

0,025
0,05
O,1

2 Std.

100
103
140

117
122
0

2 Std.

88
56
23

48
23
3

>1 0,47 0,33

■ VII

^ID50

226^
189⁺
79

113
115
77

0,16 0,056 0,027

0,098 O,O36 0,021

Dauno
mycin

0,25
0,5
1

108 ·
101
98

¹⁰SO

metaphasischer Block

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Tabelle 2

Wirkung der Verbindungen (VI) und (VII) auf die Foci-Bildung und auf die Zellprolxferation in kultivierten Mäusefibroblasten, die mit dem Moloney-Sarkom-Virus infiziert waren. (3 tägige Behandlung).

Verbindung	Dosis	Foci-Bildung	( .ug/ml)	Zeilproliferation	^ID50	-	0,0086	B/A
	(.ug/ml)	(% Kontrollen) ID₅₀	' (A)	(% Kontrollen)	(.ug/ml) ' (B)

			0,006		0,013
VI	0,0062	51		75
	0,025	0		23		2,1
	0,1	0		14
	0,4	0	0,01	1	0,064
VII	0,0062	48		87
	0,025	44		80	6,4
	0,1	5		28
Dauno	0,4	0	0,006	14
mycin
			1,4

Tabelle 3

Wirkung der Verbindungen C7I) und (VII) auf de mittlere Überlebenszeit und auf die Anzahl der überlebenden bei weiblichen Mäusen (Swiss CDI), denen intraperitoneal Sarkom 180-Bauchwassersucht (1 χ 10 Zellen/Maus) eingeführt worden war. Die Verbindungen wurden an dem der Transplantation des Tumors folgenden Tag verabreicht.

Verbindung	Dosis (mg/kg)	mittlere Überlebenszeit (% Kontrollen)	Anzahl der überlebenden am 60. Tag
VI	0,22 1,1 5,7	111,1 120,8 174,5	1/10 1/10 0/10
VII	0,26 1,3 6,7	96,6 114,8 118,6	0/10 1/10 1/10

6/10 Tiere starben als Folge von Drogentoxizität

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Tabelle 4

Wirkung der Verbindungen (VI) und (VII) auf verpflanzbare Gross-Leukämie. Mittlere Überlebenszeit von C₅H weiblichen Mäusen, die intravenös mit einer Suspension von leukämischen Lymphknoten und Milz geimpft worden waren (2,5 χ 1O⁶ Zellen/ Maus). Die Verbindungen wurden einmal täglich während 5 -Tagen beginnend ^m^^t dem der Transplantation des Tumors folgenden Tag verabreicht.

Verbindung	tägliche Dosis	mittlere Überlebenszeit
	(mg/kg)	(% Kontrollen)
	1,5	115
	2,25	143
VI	3	162
	3,75	122
	4,5	120
	1,5	106
VII	2,25	102
	3	121

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung der neuen 1~Chlor-2,3,6-tri-

deoxy-3-trifluoracetamido-4-triflupracetoxy-L-lyxohexopyranose und der neuen 1-Chlor-2 ,3,6--tridepxy-3-trif luoracetamido-4-

das ist

trxfluoracetoxy-L-arabinohexopyranose, dadurch gekennzeichnet, daß 2_/3,6-Trideoxy-3-amino-L-lyxohexopyranose oder 2,3,6-Trideoxy-3^amino-L-arabinohexopyranose bei 0°C mit Trifluor-„essigsäureanhydrid unter Bildung der neuen Tri-trifluoracety1derivate umgesetzt wird, welche nach Behandlung mit wasserfreiem Chlorwasserstoffgas bei O⁰C i-Chlor-2,3,6-trideoxy-3-trifluoracetamido-4-trifluoracetoxy-L-lyxohexopyranose und i-Chlor-2,3,6-trideoxy-3-trifluoracetamido-4-trifluoracetoxy-L-arabinohexopyranose ergeben.

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Claims

Patentansprüche :

1. Verfahren zur Herstellung von Daunomycin und von 4'-epi-Daunomycin sowie den entsprechenden ß-Anomeren, dadurch gekennzeichnet, daß Daunomycinon mit einer 1-Chlor-2,3,6-trideoxy-3-trifluoracetamido-4-trifluoracetoxyhexose mit L-Lyxo- oder L-Arabino-Konfiguration in einem geeigneten organischen Lösungsmittel in Anwesenheit eines Quecksilbersalzes als Katalysator und eines geeigneten Chlorwasserstoffakzeptors umgesetzt und danach die Trifluoracetylschutzgruppen in den gebildeten Glycosidverbindungen entfernt und die α- und ß-Anomere getrennt werden.

2. 7-0-(3'-Amino-2',3',6'-trideoxy-ß-L-lyxohexopyranosyl)-daunomycinon.

3. 7-0-(3'-Amino-2',3',6'-trideoxy-a-L-arabinohexopyranosyl) daunomycinon.

4., 7-0-(3'-Amino-2',3',6'-trideoxy-ß-L-arabinohexopyranosyl) daunomycinon.

5. Mischung von 7-0-(3'-Amino-2',3·,6'-trideoxy-ß-L-lyxohexopyranosyl)-daunomycinon, 7-0-(3'-Amino-2',3',6'- -trideoxy-a-L-arabinohexopyranosyl)-daunomycinon und 7-0-(3'-Amino-2¹ ,3',6'-trideoxy-ß-L-arabinohexopyranosyl)-daunomycinon.

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- Vr -

6. i-CHbr-2,3,6—trideoxy-3-trifluoracetamido-4-trifluoracetoxy-L-lyxohexopyranose.

7. i-Chlor-2,3,e-trideoxy-3-trifluoracetamido-4-trifluoracetoxy-L-arabinohexopyranose.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung _f insbesondere zur Behandlung von Viruserkrankungen und Karzinomen,dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine Verbindung gemäß Anspruch 2, 3 bzw. 4 enthält.

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