DE2618822C3

DE2618822C3 - Anthracyclin-Glycoside und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE2618822C3
Application number: DE2618822A
Authority: DE
Inventors: Alberto Bargiotti; Sergio Milano Penco
Original assignee: Farmitalia Carlo Erba SpA 20159 Milano; Farmitalia Carlo Erba SRL
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1975-04-30
Filing date: 1976-04-29
Publication date: 1983-04-28
Also published as: SU728719A3; ES447433A1; SE436884B; US4112076A; DK150203B; ZA762562B; DE2618822B2; ATA302676A; DE2618822A1; DK189676A; DK150203C; NL179587B; CA1061335A; AU500439B2; SE7604908L; CH541176A4; AT345457B; CH624125A; JPS51133262A; GB1506200A

Description

in der R' Methyl oder Hydroxymethyl bedeutet und die Bedeutungen von R und X wie folgt zuzuordnen sind: :o

R: Methoxy

25

NH₂

O OH

COCH₃

OH

(D

worin R Methoxy oder Wasserstoff bedeutet, mit geschützten 1-Halogenderivaten eines Aminodeoxyzukkers in Methylenchlorid, in Gegenwart von Silbertrifluormethansulfonat (AgOjSCF₃) und Molekularsieben als Dehydratisierungsmitteln. Die Löslichkeit des Silbersalzes ermöglicht, daß die Kondensation in einer homogenen Phase stattfindet, wobt' die wohlbekannten Komplikationen der Königs-Knorr-ixeaktion in Anwesenheit von unlöslichen Silber- oder Quecksilberverbindungen vermieden werden (G. Wulff und G. Röhle, Ang. Chem. Int. Ed. 13, 157 [1974]). Die Reaktion ist nach kurzer Zeit beendet (im allgemeinen 1 bis 8 Stunden) und die geschützten Glycoside können in hoher Ausbeute erhalten werden. Außerdem ist es sehr wichtig und überraschend, daß die Reaktion stereospezifisch ist: es werden lediglich die «-Anomeren gebildet.

Das reaktive geschützte Derivat des Aminodeoxyzuckers, das mit dem Aglycon der Formel I (R = Methoxy) unter Bildung des geschützten Glycosids der allgemeinen Formel

2.4-Demethoxy-4'-epidaunomycin (α-Anomer).

3.4-Demethoxy-4'-epiadriamycin (a-Anomer).

4. Verfahren zur Herstellung der Anthracyclin-Glycoside nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Daunomycinon oder 4-Demethoxydaunomycinon, gelöst in wasserfreiem Methylenchlorid mit einem geschützten l-Halogen-3',4'-epoxy-6'-hydroxydaunosamin, -3',4'-epidaunosamin oder -4'-epidaunosamin in Gegenwart von Silbertrifluormethansulfonat und eines Molekularsiebes umsetzt, die Schutzgruppen aus dem so erhaltenen Glycosid durch 0,1 η Natriumhydroxyd entfernt, und die so erhaltenen Daunomycinanaloga entweder als Hydrochloride isoliert oder, gelöst in Dioxan/Methanol, mit in Chloroform gelöstem Brom umsetzt, das so erhaltene 14-Bromderivat mit wäßriger Natriumformiatlösung bei Raumtemperatur hydrolysiert und die entsprechenden Adriamycinahaloga als Hydrochloride isoliert.

COCH₃

(Ii)

worin

r3==r^j=—O —CO-

-NO₂

3 4

kondensiert wird, ist das neue Zwischenprodukt 2,3-Di- nämlich 3', 4'-Epi-6'-r.ydroxyadriamycin, das ebenfalls

deoxy^o-di-o-ip-nitrobenzoyOO-N-trifluoracelyl-u-L- als Hydrochlorid isoliert wird.

yp
ribohexopyranosylchlorid der allgemeinen Formel

(IH)

Das geschützte Derivat des Aminodcoxyzuckers, das mit dem Aglycon der Formel I (R = Methoxy) unter Bildung des geschützten Glycosids der allgemeinen Formel

O OH

3=r2=_O —CO

13

das von der 3-Amino-2,3-dideoxy-L-ribohexose (3,4-Epi-6-hydroxydaunosamin) der Formel

HO

H, OH

(IV)

COCH₃

(VII)

stammt, welche bisher in der L-Reihe unbekannt war. Aus dem geschützten Glycosid Il wird nach basischer Entfernung der Schutzgruppen das Endprodukt der Formel O OH

COCH₃

worin

R¹=—O — CO-

(V)

kondensiert wird, ist das neue Zwischenprodukt 2,3.6-3-, Trideoxy-3-N-trinuoracetyl-4-O-(p-nitrobenzoyl)-rt-L-ribohexopyranosylchlorid der allgemeinen Formel

40

(VIII)

erhalten, nämlich das 3', 4'-Epi-6'-hydroxydaunomycin, das als Hydrochlorid isoliert wird. Die nachfolgende Behandlung der Verbindung V gemäß dem in der US-PS 38 03 124 beschriebenen Verfahren ergibt die Verbindung der Formel

worin

O OH

R³=—O — CO^f >—NO₂
welches von der 3-Amino-2,3,6-trideoxy-L-ribohexose

(VI)

O |H
OCH₃ OH

60

H, OH

(IX)

65 stammt, die ebenfalls bisher in der L-Reihe unbekannt war.

Aus den geschützten Glycosidcn VII wird nach Entfernung der Schulzgruppen das Endprodukt der Formel

OH

(X)

erhalten, aus dem nach Entfernung der Schutzgruppen zuerst mil Methanol, wobei das N-Trifluoracetylderivat erhalten wird, und anschließend inil verdünnter NaOH das Endprodukt 4-Demethoxy-4'-epidaunomycin der Formel

OH

COCH₃

OH

nämlich 3', 4'-Epidaunoniycin erhalten, das als Hydrochlorid isoliert wird. Die nachfolgende Behandlung der Verbindung X gεmäß dem in der US-PS 38 03 124 beschriebenen Verfahren ergibt die Verbindung der Formel

OH

COCH₂OH

OH

(XI)

OH

nämlich 3', 4'-Epiadriamycin, das als Hydrochlorid isoliert wird. \νεηη die Kondensation durch Umsetzen des Aglycons der Formel I (R = Wasserstoff) mit είηεηι geeigneten geschützten Derivat von 4-Epidaunosamin, nämlich 1 -Chlor-N^O-iJi-trifluoracetyM-epidaunosamin (dieses Zwischenprodukl ist in der BE-PS 8 26 848 beschrieben), durchgeführt wird, wird das geschützte Glvcosid der Formel

O OH

CF,- CO

COCH₃

(XIl)

OH

(XIIl)

OH

NH,

als Hydrochlorid isoliert wird.

Aus der Verbindung XIII wird nach dem in der US-PS 38 03 124 beschriebenen Verfahren 4-Demethoxy-4'-epiadriamycin der Formel

OH

COCH₂OH

OH

(XIV)

OH

NH₂

als Hydrochlorid erhalten.

Das Zwischenprodukt 2,3-Did8oxy-4,6-di-O-(p-nitrobenzoyl)-3-N-trinuoracetyl-ff-L-ribohexo-pyranosylchlorid III. das zur Herstellung der Verbindung II verwend8t wird, wurde ausgehend von Methyl-4,6-O-benzyliden-2-deoxy-ff-L-erythroh8xopyranosid-3-ulose der Formel

NH-COCF,

OCH₃

(XV)

(E. I I.Williams et al.. Canad. J. Chcm. 47,4467 [1969]) erhalten. Diese Verbindung wurde nach dem aus der Literatur für das D-Isomcr bekannten Verfahren von P.J.Beynon et al., J.Chem.Soc.(C), 272 (1969), in das Methyl-2,3-dideoxy-3-N-trifluoracetyl-ir-L-ribohexopyranosid der Forme!

OCM.,

(XVl)

deoxy-3-N-trifluoracetyl-4-O-(p-nitrobenzoyl)-ff-L-ribohexopyranose der Formel

IO

H, OH

(XIX)

worin R³=—O —CO-

-NO₂

15

übergeführt. Die Verbindung XVI wird anschließend mit p-Nitrobenzoylchlorid in trockenem Pyridin und dann mit trockenem ChlorwasserstofTbei O⁰C reagieren gelassen, wobei 2,3-Dideoxy-4,6-di-0-p-nitrobenzoyl-3-N-trifluoracetyl-ff-L-ribohexopyranose der Formel

H. OH

(XVIl)

V=R²=- 0 — CO-

erhalten wird. Durch Umsetzen der Verbindung XVII mit p-Nitrobenzoylchlorid in trockenem Pyridin wird 1,4,6-Tri-O-p-nitrobenzoat isoliert, aus welchem nach Behandlung während einer Stunde mit trockenem Chlorwasserstoff bei O⁰C in Methylenchiorid die gewünschte neue Verbindung III erhalten wird.

Die Herstellung des anderen neuen Zwischenproduktes 2,3,6-Trideoxy-3-N-trifluoracetyl-4-O-(p-nitrobenzoyl)-tt-L-ribohexopyranosylchlorid VIII erfolgt ausgehend von der Verbindung XVI und entsprechend dem von S. Hanessian et al. (Carb. Res. 24, 45 [1972]) für die Synthese von 6-Deoxyzuckern beschriebenen Verfahren. Durch Umsetzen der Verbindung XVI mit N-Bromsuccinimid und Triphenylphosphin in wasserfreiem Dimethylformamid wird das 6-Bromderivat hiervon erhalten, aus welchem durch katalytische Reduktion in Anwesenheit von Pd/C (20%) und BaCO₃ das Methyl-2.3,6-tr:deoxy-3-trifluoracetamido-ix-L-ribohexopyranosid der Formel

25

30

35

40

45

50

55

HO

OCH₃

CH₃
NHCOCF,/

(XVIU)

isoliert wird.

Die Umsetzung der Verbindung XVIlI mit p-Nitrobenzoylchlorid in trockenem Pyridin ergibt das 4-O-p-Nitrobenzoylderivat hiervon, aus welchem nach Behandlung mit trockenem Chlorwasserstoffdie 2.3,6-Trierhalten wird. Durch Umsetzen der Verbindung XIX mit p-Nitrobenzoylchlorid in trockenem Pyridin wird das 1,4-Di-p-nitrobenzoylderivat hiervon isoliert, aus welchem nach Behandlung mit trockenem Chlorwasserstoff in Methylenchlorid bei 0⁰C die gewünschte neue Verbindung VIII erhalten wird.

Herstellung des Zwischenproduktes 2,3-Dideoxy-

4,6-di-O-(p-nitrobenzoyl)-3-N-trifluoracetyl-

Λ-L-ribohexopyranosylchlorid III

Eine methanolische Lösung von Hydroxylamin wurde durch Behandeln von 835 g (0,12 Mol) Hydroxylaminhydrochlorid mit 4,92 g (0,12 Mol) Natriumhydroxid in 215 ml Methanol und Abfiltrieren des gebildeten Natriumchlorids hergestellt. Dieser frisch hergestellten Lösung wurden 5,35 g 4,6,O-Benzyliden-2-deoxy-a-L-erythro-hexopyranosid-3-ulose (XV) (E. H. Williams et al, Canad. J. Chem. 1969, 47, 4467) zugesetzt. Nach 15 Stunden bei Raumtemperatur wurden 5,25 g (93%)

MethyMAO-benzyliden^-deoxy-a-L-erythro-hexopyranosid-3-uloseoxim abfiltriert und getrocknet, Fp. 211 -213°C; [«]_D= -201,6° (c=0,5 in CHCl₃); m/e 247 (M +-32). Das NMR-Spektrum stimmte mit der Struktur überein.

5,0 g des so hergestellten Oxims in 600 ml Diäthyläther, enthaltend einen Überschuß an Lithiumaluminiumhydrid (2,15 g) wurden gerührt und 18 Stunden lang am Rückfluß erhitzt. Dünnschichtchromatographie (Lösungsmittelsystem CHCl₃-MeOH 6 :1 V/V) zeigte an, daß die Reduktion beendet war. Durch Zusetzen von Äthylacetat, Filtrieren und Eindampfen wurden 4,05 g (85%) kristallines Methyl-S-aminoAe.O-benzyliden-^- dideoxy-ot-L-ribohexopyranosid erhalten, Fp. 120-121°C; [a]o= -145° (c=0,5 in CHCl₃); m/e 265 (M⁺). 4 g dieser Verbindung in 75 ml 0,5 N methanolischem Chlorwasserstoff wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Lösung wurde mit Amberlite IR 45 auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt und unter verminderte^ Druck zur Trockene eingedampft Der Rückstand, in 70 ml Diäthyläther suspendiert, wurde bei 0°C über Nacht mit Trifluoracetanhydrid behandelt. Das durch Eindampfen zur Trockene unter Vakuum bis zur vollständigen Entfernung von Acidität erhaltene Rohmaterial wurde über Nacht mit Methanol bei Raumtemperatur behandelt und ergab nach Abdampfen des Lösungsmittels 334 g (82%) Methyl-^-dideoxy-S-N-trifluoracetyl-a- L-ribohexopyranosid (XVI).[«]_D= -71,35° (c=0,7 in CHCl₃); m/e 242 (M⁺ -31). Dieser Schritt entspricht dem Verfahren von P. J. Beynon et al, J. Chem. Soc. (C), 1969. 272.

2,5 g Pyranosid XVl, gelöst in 45 ml wasserfreiem Pyridin, wurden mit 4,25 g p-Nitrobenzoylchlorid bei 0⁰C behandelt. Nach 2 Stunden wurde die Reaktionsmischung in Eis gegossen. Der Niederschlag wurde abfiltriert und mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen. Durch Kristallisieren aus CHCI₃-Diäthyläther wurden 4,95 g (95%) Di-p-nitrobenzoatderivat erhalten, Fp. 180-182⁰C; [α]_ο=-127° (c=0,48 in CHCI₃). 4 g dieser Verbindung, gelöst in einer Mischung aus 15 ml Chloroform und 10 ml Essigsäure, wurden mit trockenem Chlorwasserstoff bei 0⁰C gesättigt. Nach einer Stunde wurde die Lösung unter Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde, um Acidität vollständig zu eliminieren, in Benzol gelöst und mehrere Male zur Trockene eingedampft. Durch Reinigung des Rohproduktes durch Chromatographie auf einer Silikagelsäule unter Verwendung von Chloroform als Lösungsmittel wurden 3,15 g (80%) reine 2,3-Dideoxy-4,6-di-0-(p-nitrobenzoyl)-3-N-trifluoracetyl-a-L-ribohexopyranose (XVII) erhalten, Fp. 114—116°C; [ä]d= -124° (c=0,43 in CHCl₃). Das NMR-Spektrum zeigte Absorption bei 3,83 (d, C-IOH), 5,26 (dd, J' 4Hz, J" 10,5Hz, C-4H) und 5,39 <5 (s, breit, W_H 6Hz, C-1 H).

2,5 g Pyranose (XVII) in 40 ml wasserfreiem Pyridin wurden bei 0°C mit 1,25 g p-Nitrobenzoylchlorid behandelt.

Nach 14 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsinischung in Eis gegossen. Das gebildete ausgefällte Tri-O-p-nitrobenzoylderivat wurde abfiltriert, mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das NMR-Spektrum des Produktes (2,6 g, 92%), kristallisiert aus CHCl₃-At₂O, Fp. 168- 170^cC, zeigte u. a. Absorption bei 6,72 (s, breit, W_H, 6Hz, C—IH), was eine axiale Konfiguration in C 1 -Stellung der p-Nitrobenzoylgruppe anzeigt.

2 g Tri-O-p-nitrobenzoylderivat, gelöst in 60 ml Methylenchlorid, wurden 1 Stunde lang bei O⁰C mit trockenem Chlorwasserstoff gesättigt. Die ausgefällte p-Nitrobenzoesäure wurde abfiltriert und die Lösung im Vakuum bis zur vollständigen Entfernung von Acidität zur Trockene eingedampft. Das erhaltene rohe 2,3-Dideoxy-4,6-di-0-(p-nitrobenzoyl)-3-N-trifluoracetyI-a-L-ribohexopyranosylchlorid (III) (1,6 g, 95%) wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Das NMR-Spektrum zeigte u.a. Absorption von C—IH bei 6,45 <5 (dd, J' 3,5Hz, J" 1,0Hz).

Herstellung des Zwischenproduktes 2,3,6-Trideoxy-

3-N-trifluoracetyl-4-0-(p-nitrobenzoyl)-

nt-I.-ribohexopyranosylchlorid (VIII)

Eine Lösung von 0,6 g Methyl-23-dideoxy-3-N-trifluoracetyl-flc-L-ribopyranosid (XVI) in 14 ml wasserfreiem Dimethylformamid wurde mit 0,37 g N-Bromsuccinimid und 0,6 g Triphenylphosphin gemischt Die Reaktionsmischung wurde eine Stunde lang bei 50° C behandelt und die Lösung im Vakuum eingedampft Der Rückstand, gelöst in 50 ml Chloroform, wurde mit Wasser gewaschen, um das Succinimid zu entfernen. Der durch Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene rohe Rückstand wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselsäure unter Verwendung von Diäthyläther als Eluierungsmittel gereinigt 0,4 g so erhaltenes 6-Bromderivat, gelöst in 40 ml Methanol, wurden in Anwesenheit von 0,5 g 20% Palladium-auf-Kohle und 2,0 g Bariumcarbonat bei 10 atm. reduziert, wobei in quantitativer Ausbeute MethyI-23.6-trideoxy-3-trifluoracetamido-a-L-ribohexopyranosid (XVlII) erhalten wurde: Dünnschichtchromatographie auf Merck-Kieselgel 60 F₂54 unter Verwendung eines CHCI₃-MeOH-Losungsmittelsystems (6 :1 V/V): Rf 0,4. Das NMR-Spektrum stimmte mit der Struktur überein. Dieser Schritt entspricht dem Verfahren von S. Hanessian et al., Carbohyd. Res., 1972,24,45.

Eine Lösung von 0,24 g Pyranosid (XVIlI) in 4 ml wasserfreiem Pyridin wurde mit 0,24 g p-Nitrobenzoylchlorid gemischt. Die Reaktionsmischung wurde 3 Stunden lang bei 0°C gerührt und dann in Eis gegossen. Das so gebildete 4-O-p-Nitrobenzoylderivat wurde abfiltriert und zur Neutralität gewaschen. Diese Verbindung, mehrere Stunden lang über Phosphorpentoxyd getrocknet, wurde in einer Mischung aus 1 ml Eisessig und 5 ml wasserfreiem Methylendichlorid gelöst und bei 0⁰C mit trockenem Chlorwasserstoff gesättigt. Durch Abdampfen der Lösungsmittel wurden 0,22 g 2,3,6-Trideoxy-3-N-trifluoracetyl-4-O-(p-nitrobenzoyl)-L-ribohexopyranose (XIX) erhalten: Dünnschichtchromatographie auf Merck-Kieselgel 60 F_2M unter Verwendung eines Benzol-Äthylacetat-Lösungsmittelsystems (20 : 1 V/V) Rf 0,18.
Eine Lösung von 0,18 g Pyranose (XIX) in wasserfreiem Pyridin wurde mit 0,13 g p-Nitrobenzoylchlorid gemischt.

Die Reaktionsmischung wurde 3 Stunden lang bei 0°C gerührt und in Eis gegossen. Das so gebildete Di-p-nitrobenzoylderivat wurde abfiltriert und zur Neutralität gewaschen. Diese Verbindung wurde getrocknet, in 5 ml Dichlormethan gelöst und bei 0°C mit Chlorwasserstoff gesättigt. Durch Abdampfen der Lösungsmittel wurde in quantitativer Ausbeute das gewünschte Produkt 2,3,6-Trideoxy-3-N-trifluoracetyl-4-0-(p-nitrobenzoyl)-«-L-ribohexopyranosylchlorid
(VIII) erhalten, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1
3',4'-Epi-6'-hydroxydaunomycin(V)

1,1g Daunomycinon (I, R = Methoxy) in 110 ml wasserfreiem Methylenchlorid wurden mit 0,8 g l-Chlor-23-dideoxy-3-N-trifluoracetyl-4,6-di-0-p-nitrobenzoyl-a-L-ribohexopyranose (III) in Anwesenheit von 12 g Molekularsieb (4 A) gemischt und mit 037 g AgO₃SCF₃ unter starkem Rühren über Nacht bei

Raumtemperatur behandelt Die Reaktionsmischung wurde mit einer gesättigten wässerigen Natriumbicarbonatlösung neutralisiert Die organische Phase wurde abgetrennt und im Vakuum eingedampft Der Rückstand wurde durch Chromatographie auf einer Kiesel-

säuresäule unter Verwendung von Benzol-Äthylacetat (2 :1 V/V) als Eluierungssystem gereinigt; dabei wurden

13 g (80%) Produkt (II) erhallen, Fp. 241-243°C;

[<x]d= +241° (C= 0,07 in CHCI₃).

0,7 g Verbindung (II), gelöst in 45 ml Aceton, wurden

mit 50 ml 0,2 η wässerigem Natriumhydroxyd bei 0⁰C gemischt Nach 40 Minuten wurde die Lösung mit 1 N Chlorwasserstoff auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und mit Chloroform extrahiert um die Aglycone zu entfernen. Die auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellte wässerige Lösung wurde wiederholt mit Chloroform extrahiert Die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und auf 10 ml eingedampft Durch Zusetzen einer stöchiometrischen

Menge an wasserfreiem methanolischen Chorwasserstoff und Diethylether im Überschuß wurden 0,36 g (83%) S'.'T-Epi-ö'-hydroxydaunomycinhydrochlorid (V)

erhalten, Fp. 183-185°C; [«]d=+215° (c=0,02 in (I' MeOH). Dünnschichtchromatographie auf einer Kiesel-

j- gel HF-Platte, gepuffert mit M/15 Phosphat auf pH 7,

unter Verwendung eines Chloroform-Methanol-Was-

■λ ser-Lösungsmittelsystems (13:6:1, bezogen auf das

' Volumen): Rf 0,43.

Beispiel 2
Ϊ " 3',4'-Epi-6'-hydroxyadriamycin(Vl)

ι 0,3 g des Endproduktes von Beispiel 1, gelöst in einer

Ϊ Mischung von 4,2 ml wasserfreiem Methanol und 12 ml

j Dioxan, wurden mit 0,3 ml Äthylorthoformiat und 1,1 ml

einer Lösung von 0,93 g Brom .in 10 ml Chloroform gemischt. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung in eine Mischung aus 60 ml Diäthyläther und 30 ml Petroläther (Kp. 40—70⁰C) gegossen. Es bildete sich ein roter Niederschlag, der filtriert und mehrere Male mit Diäthyläther gewaschen wurde, um Acidität vollständig zu entfernen, '' worauf er in einer Mischung aus 6 ml Aceton und 6 ml

0,25 N wässerigem Bromwasserstoff gelöst wurde. Nach 15 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Mischung :;) mit 6 ml Wasser gemischt und wiederholt mit ': Chloroform extrahiert, um die Aglycone zu entfernen.

■ Die wässerige Phase wurde mit n-Butanol extrahiert, bis

;■ die Extrakte keine Farbe mehr aufwiesen. Durch

Abdampfen des organischen Lösungsmittels im Vakuum ! auf ein kleines Volumen (etwa 5 ml) wurden 0,26 g

14-Bromderivat als rotes kristallines Produkt erhalten. 0,26 g 14-Bromderivat wurden in 6 ml 0,25 η wässerigem Bromwasserstoff gelöst und mit 0,45 g Natriumformiat in 4,5 ml Wasser gemischt. Die Reaktionsmischung wurde 100 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der in 120 ml einer Mischung von Chloroform und Methanol (2:1 V/V) gelöste Rückstand wurde zweimal mit je '£ 50 ml 2,5^o/oiger wässeriger Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die wässerige Phase wurde mit Chloroform extrahiert bis die Extrakte keine Farbe mehr aufwiesen. Die organische Phase wurde mit den Chloroformextrakten vereinigt über wasserfreiem Natriumcarbonat getrocknet und im Vakuum auf ein kleines Volumen eingedampft (etwa 30 ml). Die mit wasserfreiem methanolischen Chlorwasserstoff auf pH 3,5 (Kongorot) eingestellte rote Lösung wurde mit überschüssigem Diäthyläther gemischt wobei 0,12 g 3',4'-Epi-6'-hydroxyadriarriycin (VI) als Hydrochloric erhalten wurden, Fp. 158-16O⁰C (Zers.); [afc= +178° (_c,=0,01 in MeOH). Dünnschichtchromatographie auf einer Kieselgel-Platte, mit M/15 Phosphat auf pH 7 gepuffert, unter Verwendung eines Chloroform-Methanol-Wasser-Lösungsmittelsystems (13:6:1, bezogen auf das Volumen): Rf 032. Dieser Schritt entspricht dem Verfahren dGBFSmzm

Beispiel 3
3',4'-Epidaunomycin (X)

0,29 g Daunomycinon (I, R=Methoxy) in 30 ml wasserfreiem Methylendichlorid, gemischt mit 0,15 g Pyranosylchlorid (VIIIX wurden unter starkem Rühren über Nacht bei Raumtemperatur mit 0,1 g AgSO₃CF₃ in Anwesenheit von 3 g Molekularsieb behandelt Das Produkt wurde wie in Beispiel 1 aufgearbeitet und es wurden 0,185 g (65"/o) geschütztes Produkt (VIl) erhalten, Fp. 245⁰C. Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel-Platten 60 F254 unter Verwendung eines Benzol-Äthylacetat-Lösungsmittelsystems (2 :1 V/V): > Rf 0,3. Durch basische Behandlung zwecks Entfernung der Schutzgruppen wie in Beispiel 1 wurde das gewünschte Produkt (X) in quantitativer Ausbeute erhalten, Fp. 180-181⁰C; [ot] =+243,5° (c=0,50 MeOH). Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel-Platten, mit M/15 Phosphat auf pH 7 gepuffert, unter . Verwendung eines Chloroform-Methanol-Wasser-Lösungsmittelsystems (13:6:1, bezogen auf das Volumen): Rf 0,55. Daunomycin unter den gleichen Bedingungen: Rf 0,43.

BeispielΊ
3',4'-Epiadriamycin(XI)

0,5 g Produkt (X) wurden wie in Beispiel 2 in das Μ Adriamycinanalogon (XI) übergeführt, Ausbeute 0,28 g; Fp. 168-170°C; [x] =+284° (c=0,044 in MeOH). Rf=0,3 unter Verwendung eines Chloroform-Methanol-Wasser-Lösiingsmittelsystems (14:6:1, bezogen auf das Volumen).

Beispiel 5
4-Demethoxy-4'-epidaunomycin (XIlI)

1 g 4-Demethoxydaunomycinon (I₁ R = Wasserstoff)

ι» (beschrieben in der BE-PS 8 37 758) gelöst in 100 ml wasserfreiem Methylenchlorid, enthaltend 1,2 g 1 -Chlor-N.O-trifluoracetyl^-epidaunosamin (beschrieben und beansprucht in der BE-PS 8 26 848) wurde in Anwesenheit von 10 g Molekularsieben (4Ä) mit 0,86 g

J5 AgO₃SCF₃, gelöst in 40 ml Diäthyläther, behandelt. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung mit gesättigter wässeriger NaHCOj-Lösung neutralisiert und die organische Phase abgetrennt and im Vakuum eingedampft. Der N,O-geschützte Rückstand (XII) wurde mit 200 ml Methanol 15 Minuten lang bei Raumtemperatur behandelt und das Rohprodukt (13 g), erhalten durch Abdampfen des Lösungsmittels, auf einer Kieselsäuresäule unter Verwendung einer Mischung aus Chloroform, Benzol und Methanol (100:30:4, bezogen auf das Volumen) als Eluierungsmittel chromatographiert. Es wurden 0,55 g reines N-Trifluoracetyl-4-demethoxy-4'-epidaunomycin erhalten. NMR (CDCl₃-DMSO-d₆ 1 :1 V/V): 138 (d, CH3-C-5'), 5,23(breites s, W_H 7.5Hz, C-7H).5,5 (dd, 1'-2,5Hz₁ J"~lHz, C-1'H), 7,7-8,0 und 9,15-8,50 (zwei symmetrische m, aromatischer H), 13,18 und 13,45 (zwei s, C-6OH und C-1 lOH). Dünnschichtchromatographie auf Merck-Kieselgel F^-Platten unter Verwendung eines Chloroform-Benzol-Methanol-Lösungsmittelsystems (100 :30 :4 V/V): Rf 0,17.

Das N-Trifluoracetylderivat wurde in 5 ml Aceton gelöst und bei 0⁰C mit 50 ml 0,1 N NaOH behandelt Nach 20 Minuten wurde die Lösung auf einen pH-Wert von 8,2 eingestellt und wiederholt mit Chloroform extrahiert Die vereinigten Extrakte, getrocknet und auf ein kleines Volumen eingeengt (etwa 15 ml), wurden mit wasserfreiem methanolischen Chlorwasserstoff auf pH 3,5 angesäuert (Kongorot). Durch Zusetzen von überschüssigem Diäthyläther wurden 035 g 4-Demethoxy-4'-epidaunomycin (XIII) als Hydrochlorid erhalten. Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel F254-Platten unter Verwendung eines Chloroform-Methanol-Wasser-Lösungsmittelsystems (120 :20 :2): Rf 0,25.

Beispiel 6
4-Demethoxy-4'-epiadriamycin(XlV)

0,35 g 4-Demethoxy-4'-epidaunomycinhydrochlorid (XIII), gelöst in einer Mischung aus 5 ml wasserfreiem Methanol, 14 ml Dioxan, 0,35 ml Äthylorthoformiat, wurden mit 1,4 ml einer Lösung aus Brom in Chloroform (0,93 g Br₂ auf 10 ml CHCI₃) behandelt. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung in eine Mischung aus 70 ml Äthyläther und 35 ml Petroläther gegossen. Der rote Niederschlag, filtriert und mehrere Male mit Äthyläther gewaschen, um Acidität vollständig zu entfernen, wurde in einer Mischung aus 7 ml Aceton und 6 ml 0,25 N wässerigem Bromwasserstoff gelöst. Nach 15 Stunden bei Raumtemperatur wurden der Mischung 6 m! Wasser zugesetzt und durch mehrmaliges Extrahieren mit Chloroform wurden die Aglycone entfernt. Dann wurde die wässerige Phase mit n-Butanol extrahiert, bis ungefärbte Extrakte vorhanden waren. Durch Abdampfen des organischen Lösungsmittels im Vakuum (bis auf ein kleines Volumen von etwa 6 ml) wurden 0,26 g 14-Bromderivat erhalten. Diese Verbindung wurde in 6,7 ml 0,25 η Bromwasserstoff gelöst und mit 0,5 g Natriumformiat in 5 ml Wasser behandelt. Die Reaktionsmischung wurde 48 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand, gelöst in 120 ml einer Mischung aus Chloroform und Methanol (2 :1 V/V), wurde zweimal mit je 50 ml einer 2,5%igen wässerigen NaHCCb- Lösung gewaschen. Die wässerige Phase wurde mit Chloroform extrahiert, bis die Extrakte keine Farbe mehr aufwiesen, über Na2SC>4 getrocknet und im Vakuum auf ein kleines Volumen (etwa 30 ml) eingedampft Der roten Lösung, mit wasserfreiem methanolischen Chlorwasserstoff auf pH 3,5 eingestellt (Kongorot), wurde überschüssiger Äthyläther zugesetzt, wobei 0,17 g 4-Demethoxy-4'-epiadriamycin (XIV) als Hydrochlorid erhalten wurden, das durch Chromatographie auf einer Zellulosepulversäule unter Verwendung eines Chloroform-Methanol-Wasser-Lösungsmittelsystems (140:20:2 V/V) als Eluierungsmittel gereinigt wurde. Das Rohprodukt schmolz unter Zersetzung bei 178° C. Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel F₂s4-Platten, mit M/15 Phosphat auf pH 7 gepuffert, unter Verwendung eines Chloroform-Methanol-Wasser-Lösungsmittelsystems (130 : 60 :10 V/V): Rf 0,54.

Biologische Wirksamkeit

Die Antitumorwirksamkeit der neuen, erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen, d. h. 3\4'-Epidaunomycin, 3',4'-Epi-6'-hydroxydaunomycin. 3',4'-Epi-6'-hydroxyadriamycin, 4-Demethoxy-4'-epi-adriamycin, wurde an mehreren transplantierten Tumoren bei Mäusen und bei in vitro-Versuchen festgestellt Die Ergebnisse dieser Versuche sind in den folgenden Tabellen angegeben.

Tabelle IH

3',4'-Epidaunomycin

in vitro-Test der Klonierungswirksamkeit von
Heia-Zellen

Nach Behandlung während 2, 8 oder 24 Stunden wurden Heia-Zellen (200 Zellen pro Platte) angeimpft und die Anzahl der Kolonien 8 Tage später bestimmt. Die Hemmungsdosis (ID50) stellt die Dosis dar, welche eine 50%ige Hemmung der Kolonien ergibt.

Tabelle I (Wirkung auf Heia-Zellen)	ID₅₀ (;j.g/ 2 Stunden	^rml) 8 Stunden	24 Stunden
Verbindung	17 270	8,5 220	6,8 190
Daunomycin 3',4'-Epidaunomycin

in vitro-Test auf die Bildung von Foci durch
das Moloney-Sarkomvirus (MSV)

Die Testverbindung wurde an Mäuseembryofibroblast (MEF)-Kulturen, die mit MSV infiziert waren, und an ähnlichen nicht-infizierten Kulturen geprüft. Nach einer 3tägigen Behandlung wurde die Hemmungsdosis (ID50) an Hand von Zellenproliferation in nicht-infizierten Kulturen (cytotoxische Wirkung) und MSV-Focibildung in infizierten Kulturen (antivirale Wirkung) festgestellt.

Tabelle II	antivirale Wirkung ID₅₀ (ng/ml)	cytotoxische Wirkung ID50 (ng/ml)
Verbindung	3 45	16 90
Daunomycin 3',4'-Epidaunomycin

Das 3',4'-Epidaunomycin zeigte im Vergleich zu Daunomycin weniger cytotoxische Wirksamkeit in vitro.

Bei tumortragenden Tieren zeigte es jedoch eine deutliche Antitumorwirksamkeit, wie in Tabelle III gezeigt.

Lymphocytische Ascites P 388-Leukämie

Männliche CDFi-Mäuse wurden intraperitoneal mit 6 bis 10⁶ Leukämiezellen pro Maus angeimpft und dann vom 1. bis zum 9. Tag nach der Animpfung intraperitoneal mit verschiedenen Dosen der zu prüfenden Verbindung behandelt Die Bewertung erfolgte am 20. Tag.

Dosis	Toxizilät	Heilungen	Gewichts	Tumor	T/C
	(Überlebende		differenz	bewertung	%
	am 5. Tag)			mittlere Über
				lebenszeit
(mg/kg)				(Tage)*)
25	6/6	1	-0,8	28	231
12.5	6/6	_	-0.1		-. -;"» ι :j

Forlscl/unu

·) Kontrolle = 12,1 Tage.

Dosis	Toxi/iläl	Heilungen	Gewichts	Tumor-	T/C
	(Llbcrlebcnile		differenz	bcwcrlung	%
	am 5. Tag)			mitllere Über-
				lebcnszeit
(mg/kg)				(Tage)*)
6,25	6/6	-	+ 0,7	18,8	155
3,13	6/6	-	+ 0,3	17,3	142
1,56	6/6	-	+ 1,0	15,7	129

3\4'-Epi-6'-hydroxydaunomycin Die Verbindung zeigt eine bemerkenswerte Wirk-

Mäuse zeigt

BDF-Mäuse wurden intraperitoneal mit 1.1O⁵ Leukä miezellen pro Maus angeimpft und dann mit der zu

samkeit in vivo, wie in Tabelle IV gezeigt, welche die 20 prüfenden Verbindung behandelt. Es erfolgte eine Wirkung des Heilmittels auf L 1210- Leukämie tragende einzige Behandlung i. p. am ersten Tag.

Tabelle IV (Wirk;ng auf L 1210-Leukämie)	Dosis (ng/kg)	T/C %
Verbindung	7,5 11,5 17,25	150 150 150
3\4'-Epi-6'-hydroxydaunomycin

3',4'-Epi-6'-hydroxyadriamycin

Die Verbindung ist bei Versuchtstumoren wirksam. In Tabelle V ist ihre Wirksamkeit auf Ascites-Sarkom 180 bei Mäusen angegeben. Der Versuch wurde an Gruppen zu 10 Mäusen (Swiss CDI) durchgeführt. Die geprüfte Verbindung wurde den Versuchstieren einen Tag nach intraperitonealer Animpfung mit 1.1O⁶ Tumorzellen prc Maus in variierenden Dosen intraperitoneal verabreicht

Die mittlere Oberlebenszeit ist als Prozentsatz dei Überlebenszeit unbehandelter Tiere, die willkürlich mil 100% angenommen wird, angegeben. Die Anzahl dei lange Zeit überlebenden Tiere ist ebenfalls angegeben.

Tabelle V

(Wirkung auf Ascites-Sarkom 180)

Verbindung	Dosis	T/C	*LTS)**
	(ng/kg)	%
3',4'-Epi-6'-hydroxy adriamycin	3 4,5 6,7 10,5	123 226 138 138	1/10 2/10
Adriamycin	4,5	250	1/10
*) Lange Zeit Überlebende.

4-Demethoxy-4'-epiadriamycin

Diese Verbindung wurde im Vergleich mit Adriamycin auf mehreren in vitro-Systemen und Mäuseversuchstumoren getestet. Die in vitro-Ergebnisse sind in Tabelle VI angegeben. Die geprüfte Verbindung war deutlich wirksamer als Adriamycin.

Die mit Mäuseversuchstumoren erhaltenen Ergebnis se sind in den Tabellen VII, VIII und IX angegeben.

Bei jedem getesteten System zeigte 4-Demethoxy-4' epiadriamycin eine bemerkenswerte Antitumorwirk samkeit in zehnmal niedrigeren Dosen als Adriamycin

Bei L 1210- und P 388-Leukämie war die Antitumor Wirksamkeit bei der optimalen (nicht giftigen) Dosis mi

308117/14

jener von Adriamycin vergleichbar. Bei festem Sarkom war die Hemmung des Tumorwachstums am 11. Tag etwas geringer als jene von Adriamycin bei gleich toxischen Dosen. Bei Gross-Leukämie (welche ein i. v. transplantierter syster.ischer Tumor ist) war die Zunahme der Lebenszeit von mit den beiden Verbin-18

düngen in gleich toxischen Dosen behandelten Mäusen ähnlich.

Daraus folgt, daß 4-Demethoxy-4'-epiadriamycin bei Mäusen eine starke Antilumorwirksamkeit aufweist, welche in lOmal niedrigerer Dosis ähnlich jener von Adriamycin ist.

Tabelle VI

In vitro-Wirkung von 4-Demethoxy-4'-epiadriamycin im Vergleich mit Adriamycin, ID₅₀ (ng/ml)

Verbindung

Hcla^a) MSV^b)

72

MEP-)
72

Adriamycin	125	28	12,5	0,01	0,026
4-Demethoxy-4'-epiadriamycin	0,35	0,1	0,03	< 0,003	< 0,003

^a) Klonierungswirksamkeit von Hela-Zellcn.

^b) Hemmung der MSV-Focibildung.

^c) Hemmung der Mäuseembryofibroblastproliferation.

Tabelle VII

Wirksamkeit von 4-Demethoxy-4'-epiadriamycin auf ascitische Leukämie. Behandlung i. p.

am 1. Tag

Leukämie Verbindung

Dosis (mg/kg) T/C")

LTS^b)

Tod durch
Toxizität

L 1210 Adriamycin

4-Demethoxy-4'-epiadriamycin

P 388 Adriamycin

4-Demethoxy-4'-epiadriamycin

^a) Mittlere Überlebenszeit, % gegenüber unbehandelten Kontrollen.

^b) Lange Zeit Überlebende in 60 Tagen.

2,5	155	4/11	0/11
5	166	1/11	1/11
10	155	3/11	7/11
0,25	155	0/11	0/11
0,5	166	2/11	0/11
1	133	0/11	11/11
2,5	150	0/10	0/10
5	162	0/10	0/10
10	200	1/10	0/10
0,25	143	0/10	0/10
0,5	162	1/10	1/10
1	162	0/10	8/10

Tabelle VIII

Wirksamkeit von 4-Demethoxy-4'-epiadriamycin auf festes Sarkom 180. Behandlung i. v.

am 1. bis zum 5. Tag. Mittlere Daten von zwei Versuchen

Verbindung

Dosis (mg/kg) T/C^a)

Tod durch
Toxizität

Adriamycin

4-Demethoxy-4'-epiadriamycin

2	22,2	3/19
2,5	13,5	11/18
0,06	87,3	0/10

19 20

Fortsetzt! η c

fi Verbindung Dosis T/C^a) Tod durch

,f. . (mg/kg) "U Toxiziläl

U ' . — —

I 0,12 85,1 2/16

I 0,25 41,9 4/19

% 0,5 - 9/9

■': ^a) Tumorgewicht am 11. Tag, % gegenüber unbchandellcn Kontrollen.

Tabelle IX

Wirksamkeit von 4-Demethoxy-4'-cpiadriamycin auf Groß-Leukämie. Behandlung i. v.

am 1. bis zum 3. Tag. Mittlere Daten von zwei Versuchen")

Verbindung Dosis T/C LTS Tod durch

(mg/kg) % Toxizität

Adriamycin 4-Demethoxy-4'-epiadriamycin

3,5	164	0/20	0/20
4,5	182	0/20	0/20
5,5	200	1/10	1/10
6	214	0/10	3/10
0,35	153	11/20	0/10
0,45	196	0/20	0/20
0,55	186	0/10	0/10
0,6	214	0/10	1/10
0,65	207	0/10	0/10

^a) Siehe Legende zu Tabelle VII.

Claims

Patentansprüche:

1. α-Anomere Anthracyclin-Glycoside der allgemeinen Formel A

OH

COR¹

(A)

10

Die Erfindung betrifft Anihracyclin-Glycoside. Sie betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der neuen Anthracyclin-Glycoside:

3',4'-Epi-6'-hydroxydaunomycin,

2\4'-Epi-6'-hydroxyEdriamycin,

3',4'-Epidaunomycin,

3\4'-Epiadriamycin,

4-Demethoxy-4'-epidaunomycin und

4-Demethoxy-4'-epiadriamycin.

Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen sind zur Behandlung von bestimmten Tumoren bei Tieren wertvoll.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Kondensation eines tetracyclischen Aglycons mit einem Hydroxy-Anthrachinon-Chromophorsystem der allgemeinen Formel