DE2437832C2

DE2437832C2 - Phospholipide, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung

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Publication number: DE2437832C2
Application number: DE2437832A
Authority: DE
Inventors: Walter Dipl.-Chem. Diembeck; Hansjörg Dipl.-Chem. Dr. 3406 Bovenden Eibl; Stefan Dipl.-Chem. 3400 Göttingen Kovatchev
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1974-08-06
Filing date: 1974-08-06
Publication date: 1986-04-10
Also published as: GB1522664A; IE41597L; CH615191A5; AU8370575A; CA1063615A; IE41597B1; DE2437832A1; NL7509359A; IT1044020B; FR2372631A1; JPS5143723A; BE832182A; DK355575A; FR2372631B1; LU73148A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung synthetischer Phospholipide, die nicht in der Natur vorkommen, mit variiertem Phosphor-Stickstoff-Abstand, die erfindungsgemaess hergestellten Phospholipide und ihre Verwendung. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine Polyhydroxylverbindung mit einer freien Hydroxylgruppe, deren weitere Hydroxylgruppen gesch tzt sind, mit einem Omega-Halogenalkylphosphorsaeuredichlorid der angegebenen Formel umsetzt und das erhaltene Reaktionsprodukt mit einem Amin gemaess der angegebenen Formel reagieren laesst. Die Erfindung betrifft weiterhin die nach dem neuen Verfahren hergestellten synthetischen Phospholipide und die Verwendung der neuen Verbindungen als Stabilisatoren fuer Enzympraeparationen als Emulgatoren und als Arzneimittel. Die Verbindungen koennen ueberall dort eingesetzt werden, wo auch die natuerlichen Phospholipide verwendet werden. Die lecithinanalogen Verbindungen besitzen als starhalten werden kann, beispielsweise zwischen Motornenndrehzahl

Description

ei I

worin X Fluor, Chlor, Brom oder Jod und Alk einen Alkyl- oderCycloalkylrest mit mindestens 3 C-Ato-15 men bedeuten, umsetzt und

B) das erhaltene Reaktionsprodukt mit einem Amin der Formel

Ri

20 N-R₂ ÖD

R₃

worin R₁, R₂ und R₃ Wasserstoff oder Methylgruppen bedeuten, reagieren läßt.
25

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung A) in Anwesenheiteines inerten Lösungsmittels durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung A) unter Feuchtigkeitsausschluß durchgeführt wird.

30 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung A)

in Anwesenheit einer Base durchgeführt wird.

5. Phospholipide, erhältlich nach einem Verfahren der vorhergehenden Ansprüche.

6. SN-l^-Dipalmitoylglyzerin-S-phosphorsäure-S-trimethylaminopentylester.

7. SN-l-Palmitoylglyzerin-S-phosphorsäure-S-trimethylaminopentylester.

35 8. l^AS-Pentamyristoyl-D-mannit-ö-phosphorsäure^-trimethylaminoheptylester.

9. l-PainiiioyW-nexadecylsi.hörglyzcrin-S-phosphorsäure^-trirr.ethylaminQnonylester.

10. l^-Dioctylätherglyzerin^-phosphorsäure-o-trimethylaminohexylester.

11. l^-DipentadecylketonglyzerinO-phosphorsäure-o-trimethylaminohexylester.

12. l-Myristoyl-propandiol^-phosphorsäure-^-trimethylaminobutylester.

40 13. l-TetradecylätherpropandioW-phosphorsäure^-trimethylaminobutyiester.

14. Verwendung der Verbindungen nach einem der Ansprüche 5 bis 13 zur Herstellung von Arzneimitteln.

15. Verwendung der Verbindungen nach einem der Ansprüche 5 bis 13 als Emulgatoren.

16. Verwendung der Verbindungen nach einem der Ansprüche 5 bis 13 zur Herstellung von Waschmitteln, Salben, Cremes, Zahnpasta und Seifen.

45 17. Verwendung der Verbindungen nach einem der Ansprüche 5 bis 13 bei der Herstellung von Margarine.

50 Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung synthetischer Phospholipide, die nicht in der Natur vorkommen, mit variiertem Phosphor-Stickstoff-Abstand, die erfindungsgemäD hergestellten Phospholipide und ihre Verwendung.

Natürlich vorkommende Phospholipide sind fettähnliche Triglyceride, die zwei langkettige Fettsäuren und einen Phosphorsäurerest, an den noch eine Base gebunden ist, enthalten. Sie kommen in allen tierischen und

55 pflanzlichen Zellen, vor allem im Gehirn, im Herz, in der Leber, im Eidotter sowie in der Sojabohne vor. Die wichtigsten natürlich vorkommenden Phospholipide sind die Kephaline und Lecithine, in denen als Base Colamin bzw. Cholin auftritt.

Lecithine und Kephaline finden vielfach Verwendung, da sie kolloidale, oberflächenaktive, emulgierende, weichmachende, antioxidative, reinigende und physiologische Eigenschaften aufweisen. Als Naturprodukte

60 sind sie ernährungsphysiologisch unbedenklich und damit vielen ähnlich wirkenden synthetischen Stoffen überlegen. Sie werden zur Margarine zugesetzt, um eine bessere Wasserbindung zu erreichen, in Schokolade und Überzugsmassen bewirkt die Verwendung von Lecithin eine schnellere und bessere Benetzung der Mischungsbestandteile, eine Verringerung der Viskosität und damit eine erhebliche Einsparung an teurer Kakaobutter. Gleichzeitig wird die Ranzidität und der »Fettreif« beim Lagern verhindert.

65 In Süßwaren verwendet man Lecithin zur Emulgierung von Sirup mit Fett. Es verhindert gleichzeitig das Ranzigwerden des Fetts und die Kristallisation des Zuckers. Backwaren lassen sich durch die verbesserte Benetzung beim Mischen leichter verarbeiten. Mari kann bis zu 20% des sonst benötigten Fetts einsparen und die Ausbeute durch bessere Wasserbindung bis zu 2% erhöhen.

Große Mengen an Sojalecithin werden auch Futtermitteln zugesetzt, da dadurch die Resorption der Nahrungsmittel im Darmkanal gefördert und zusammen mit Fisch und Heischmehl der schädlichen Wirkung von Cholesterin entgegengewirkt wird.

In der Kosmetik und Seifenherstellung verbessern geringe Zusätze die Geschmeidigkeit und Resorption von Salben, Cremes, Zahnpasta, Seifen usw.

In der Leder- und Textilindustrie benutzt man Lecithinemulsionen wegen ihrer Antioxidanzwirkung als Hilfsmittel bei der Verarbeitung. In Anstrichmitteln verhindert das Lecithin das Absetzen der Pigmente und die Viskosität wird erniedrigt, wodurch sich eine bessere Verarbeitung ergibt Es ist auch möglich, Druckfarben für Papier und Stoffe mit Lecithin zu verbessern. Bei Schädlingsbekämpfungen werden Lecithinemulsionen eingesetzt, da diese eine gute Stabilität und Haftfestigkeit besitzen.

Besondere Bedeutung haben die Lecithine und Kephaline kürzlich erlangt, da festgestellt wurde, daß sie bei der Zelloxidation und anderen Zellvorgängen wichtige Funktionen ausüben. Die Funktion der Phospholipide im Zellstoffwechsel ist jedoch noch wenig aufgeklärt und deshalb besonders schwierig, da die isolierten Verbindungen nur in geringen Mengen erhalten werden und ihre Synthese mit großen Schwierigkeiten verbunden ist Die Synthese von Phospholipiden verläuft oft vielstufig ur d man erhält die gewünschten Produkte nur mit geringen Ausbeuten (vgl. A. J. Slotboom und P. P. M. Bonsen, Chem. Phys. Liquids (1970), S. 301).

Lecithin und Kephalin werden aus Naturprodukten, z. B. aus Eigelb, Hirnsubstanz, Rückenmark und Sojabohnen gewonnen. Die Handelsprodukte besitzen sehr unterschiedliche Eigenschaften und dadurch wird der Einsatz des Lecithins und Kephalins bei den verschiedenen Anwendungen oft durch den unterschiedlichen Gehalt an Phospholipiden schwierig.

Der vorliegenden Eröndung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Syntheseverfahren für Phospholipide zu schaffen, das einfach und leicht durchzufühlen ist, ohne daß teure Ausgangsmaterialien eingesetzt werden müssen. Der Erfindung liegt außerdem die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen zu schaffen, die ähnlich wie die natürlich vorkommenden Phospholipide gebaut sind und durch eine Kombination von lipophilen und hydrophilen sowie von sauren und basischen Gruppen im gleichen Molekül ähnliche oder bessere Eigenschaften wie die natürlich vorkommenden Phospholipide besitzen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung synthetischer Phospholipitie, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

Λ) eine Polyhydroxyverbindung mit einer freien Hydroxylgruppe, deren weitere Hydroxylgruppen geschützt sinci mit einem (u-Halogenalkylphosphorsäuredichlorid der allgemeinen Formel

Cl O

Ml

P—O —Alk—X (D

CI

worin X Fluor, Chlor, Brom oder Jod und Alk einen Alkyl- oder Cycloalkylgruppe mit minderfins 3 Γ-Ato-

*· men bedeuten, umsetzt und

Ii) das erhaltene Reaktionsprodukt mit einem Amin der Formel

Ri

N-R₂ (D)

R₃

worin R₁, R₂ und R-. Wasserstoff oder Methylgruppen bedeuten, reagieren iäßt.

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind neue synthetische Phospholipide, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind.

Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen können überall dort eingesetzt werden, wo auch die natürlichen Phospholipide verwendet werden, z.B. als Stabilisatoren Tür Enzympräparationen, als Emulgatoren, in der Kosmetik, Lederverarbeitung und zur Verwendung in Arzneimitteln. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch die Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 17.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben wertvolle pharmakologische Eigenschaften. Die lecithinanalogen Verbindungen besitzen als stark oberflächenaktive Stoffe einen großen Einfluß auf natürliche Zellmembranen und auf die Permeabilitätsverhältnisse in Biomembranen. Durch eine gezielte Variation des Phosphat-Trimethylammonium-Abstands lassen sich mit den erfindungsgemäßen Verbindungen die Eigenschaften der Zeilmembranen gezielt beeinflussen; auf diese Weise läßt sich z. B. durch Beeinflussung der Grenzflächenaktivität von Zellmembranen die Wirksamkeit von Arzneimitteln verändern, z. B. ihre Wirksamkeit als immunologische Adjuvantien; durch die erfindungsgemäßen synthetischen Phospholipide können außerdem delipisierte En-/ympräparationen in ihrer enzymatischen Aktivität wieder reaktiviert werden:

Beeinflußt man die Grenzflächenaktivitäl von Zellmembranen mit Hilfe der erfindungsgemüßen Verbindungen, ändert sich die Wirksamkeit von Pharmaka, d. h. die Resorbierbarkeit und Verteilung im Organismus werden geändert.

Bedingt durch die ausgeprägte Grenzflächenaktivität verursachen die erfindungsgemäßen Verbindungen bei

ψ. peroraler oder intraperitonealer Gabe an Warmblüter eine Änderung der Eigenschaften von Zellmembranen.

|i Bei höheren Konzentrationen werden zytolytische Phänomene beobachtet

!' Bei sublytischen Dosen werden Änderungen von Zellmembranen hervorgerufen. Verbindungen mit gesättig-

S? ten Fettsäureestern von 16 und mehr Kohlenstoffatomen, beispielsweise Palmitinsäure, sind immunologische

p 5 Adjuvantien, während bei Kettenlängen von weniger als 14 Kohlenstoffatomen eine Hemmung (Imuno-Suppre-

p sant-Action) des Imunoapparats beobachtet werden konnte. Diese Ergebnisse wurden mit Phosphorsäure-

I' cholinestern beobachtet Die immunologische Adjuvanswirkung äußert sich in einer generellen Erhöhung des

ft Antikörperspiegels.

& Die umfassenden Strukturvarianten, die am Lysophospholipidmolekül vorgenommen wurden, führten zu

ff 10 wirksameren Adjuvantien.

Phospholipidabhängige Enzyme in Zellmembranen enthalten natürliche PhosphoHpidgemische mit einer .großen Anzahl ungesättigter Fettsäuren. Die Stabilisierung solcher Enzympräparationen ist wegen derlnstabilität der ungesättigten Fettsäuren in Gegenwart von Sauerstoff schwierig.

Solche Enzympräparationen können jedoch delipidisiert werden, wobei sie ihre enzymatische Aktivität ver-

) Heren. Die Reaktivierung der Enzyme kann mit den erfindungsgemäßen Phospholipiden erreicht werden, die

Il keine ungesättigten Fettsäurereiste enthalten. Die Reaktivierung ist möglich, wenn das Phospholipid in einem

lg geeigneten Verhältnis mit der erfindungsgemäßen Verbindung vermischt wird. Es ist somit möglich, phospho-

Il lipidabhängige Enzyme zu reaktivieren und zu stabilisieren.

Jj Nach Auffassung verschiedener Autoren werden die Hybridbildung und die Zellfusionen durch Lysolecithin

|j 20 induziert. So können ähnlich wie mit Sendai Virus Zeilhybride erzeugt werden. Nachteilig ist dabei die große

pf zyioiylische Aktivität der bei diesen Untersuchungen verwendeten Lysolecithine aus Eileciuun. Durch die

jj| erfindungsgemäßen Verbindungen mit fein LJgestufter zytolytischer Aktivität können Zeilfusionsexperimente

fi optimiert werden, d. h. die Zytolyse kann vermieden werden.

j| Wesentlich für die überraschend besseren pharmakologischen Wirkungen der erfindungsgemäßen Phospbo-

I 25 lipide muß die Veränderung des P-N-Abstandes im Aminoalkylphosphatrest der Phospholipide angesehen wer-

g| den, der in den erfindungsgemäßen Verbindungen mindestens drei C-Atome beträgt (vgl. Formei I, wonach Alk

|: eine Alkylengruppe mit mindestens drei C-Atomen bedeutet).

I Darüber hinaus zeigen die erfindungsgemäßen Phospholipide aufgrund ihres P-N-Abstandes von mindestens

II drei Kohlenstoffatomen überraschenderweise auch noch ein anderes metabolisches Verhalten als die bekannten H 30 Phospholipide: In den bekannten Phospholipiden mit einem P-N-Abstand von zwei C-Atomen erfolgt die Spal- M tung durch Phospholipase C und D wesentlich rascher als bei den erfmdungsgemäßen Verbindungen; so zeigen ;ii z. B. die erfindungsgemäßen Verbindungen mit einem P-N-Abstand von sechs C-Atomen, wie z. B. die Verbin- \}, düngender Ansprüche 8 bis 11, eine um das lOOOfache langsamere Spaltung durch Phospholipase C und D.Aul 1-i diese Weise ist es möglich, mit den erfindungsgemäßen Verbindungen als Liposomen Depots anzulegen, die Si 35 über wesentlich längere Zeiträume allmählich den eigentlichen Wirkstoff abgeben. Da sie von Phospholipase C ■ und D praktisch nicht mehr angegriffen werden, wird ihre bactericide und bacteriostatische Wirksamkeit durch

i diese zelleigenen Enzyme nicht zerstört. ■

;.' Weiters wurde festgestellt, daß erfindungsgemäße Lysoverbindungen der allgemeinen Formel FV oder V nicht

I -': mehr reacyliert werden: Während bekannte Verbindungen mit einem P-N-Abstand im Aminoalkylphosphatresl

'■■ 40 von zwei C-Atomen reacyliert werden, tritt bei einem P-N-Abstand von mindestens drei C-Atomen, wie

\f ihn die erfindungsgemäßen Verbindungen aufweisen, üben ischenderweise überhaupt keine Reacylierung

¹ mehr auf. Dies führt dazu, daß diese erfindungsgemäßen Verbindungen in der Zellmembran lytisch wirken,

i Diese Tatsache begründet ihre Eigenschaft als Antitumormitiel: Eine erfindungsgemäße Verbindung mii zwei

j Acylgruppen ist völlig untoxisch und wird in die Zellmembran eingebaut. Nach Abspaltung einer der Acylgrup-

; 45 pen durch Phospholipase A 2 ist keine Reacylierung mehr möglich, wodurch die Zellmembran zerstört wird and

!,■ damit auch die entsprechende Tumorzelle. Dies gilt auch dann, wenn in der 1-Stellung des Glycerins eine Äther-

ί gruppierung steht, weil auch der weitei e Abbau des bei der Abspaltung der Acylgruppe in Position 2 entstehen-

; den Lysolecithins verhindert wird.

t; Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind - wie oben bereits angegeben wurde - durch die Kombination

Γ, 50 von lipophilen und hydrophilen sowie von sauren und basischen Gruppen im gleichen Molekül gute Emulga-

s^s toren und bilden stabile Emulsionen zwischen pH 0 und 11 Sie können daher mit Vorteil in Waschmitteln ver-

I^:: wendet werden. Sie besitzen zusätzlich den weiteren Vorteil, daß sie aufgrund ihrer engen Verwandtschaft mit

ν; natürlichen Phosphatiden auf biologische Weise abgebaut werden können und daß so UmweUverschmutzungs-

;■ probleme vermieden werden.

*' 55 Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Polyhydroxyverbindungen mit einer freien Hydroxylgruppe mit einem Halogenalkylphosphorsäuredichlorid umgesetzt. Der Schute der Hydroxylgruppen in den Polyhydroxyverbindungen kann durch Ätherbildung, Esterbildung, Ketalbildung usw. erfolgen. Bei dem erfindungs-

k gemäßen Verfahren kann man als Polyhydroxyverbindungen 1,2-oder 1,3-Diglyceride und andere Glyzerinderi-

ψ. vate allgemein mehrwertige aliphatisch^ Alkohole, wie Erythrit, Pentite urJ Hexite, einsetzen. Beispiele für

|_ä 60. Polyhydroxyverbindungen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren umgesetzt werden können, werden später im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Verbindungen näher erläutert.

Die Polyhydroxyverbindungen werden mit einem Halogenalkylphosphorsäuredichlorid der allgemeinen Formel

Cl O

Ml

P—G—Alk —X (T)

Cl

umgesetzt, worin in der Formel X Fluor, Chlor, Brom oder Jod und Alk eine Alkyl- oder Cycloalkylgruppe mit mindestens 3 C-Atomen bedeuten. Bevorzugt verwendet man <y-Bromalkylphosphorsäuredichloride. In der obigen Formel enthält Alk vorzugsweise 3 bis 25 C-Atome, mehr bevorzugt 3 bis 16 und am meisten bevorzugt 3 bis 12 C-Atome bei Alkylgruppen bzw. 6 C-Atome bei Cycloalkylgruppen (Cyclohexyl). Die Halogenalkylphosphorsäuredichloride gewünschter Kettenlänge erhält man durch Umsetzung von Halogenalkoholen der folgenden Formel:

HO —Alk —X

entsprechender Kettenlänge, d. h. Alk besitzt die oben aufgeführte Bedeutung, mit Phosphoroxytrichlorid. Die genannten Halogenalkohole können aus den entsprechenden Ionen erhalten werden. Beispielsweise wurden die SfumaiRühüie durch Einführung eines Brornatornsj-c Molekül Die! nach einem vereinfachten. Verfahren hergestellt. Das einfach-bromierte Reaktionsprodukt wird hierbei durch Extraktion aus dem Reaktionsmedium entfernt und so wird eine weitere Bromierung ausgeschlossen.

Die Umsetzung des Halogenalkylphosphorsäuredichlorids mit der Polyhydroxyverbindung erfolgt bevorzugt in einem inerten organischen Lösungsmittel. Als inerte organische Lösungsmittel können beispielsweise halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Benzol, Toluol, Petroläther usw., verwendet werden. Die Umsetzung sollte möglichst unter Feuchtigkeitsausschluß durchgeführt werden. Allgemein werden bei der Umsetzung Temperaturen im Bereich von -10 bis 50⁰C, bevorzugt im Bereich von 0 bis 20⁰C, verwendet. Bevorzugt wird die Umsetzung in Anwesenheit einer inerten Base, wie beispielsweise Triäthylamin oder Pyridin, durchgeführt. Allgemein löst man das Halogenaf/.J'lphosphorsäuredichlorid in dem inerten Lösungsmittel und gibt dazu die Base. Unter Rühren tropft man die Polyhydroxyverbindung, ebenfalls gelöst in einem inerten Lösungsmittel, möglicherweise unter Kühlen zu dem Phosphorylierungsmittel.

Dabei verläuft die Umsetzung glatt und eindeutig. Im allgemeinen ist die Umsetzung nach kurzer Zeit beendigt. Es empfiehlt sich jedoch, noch einige Zeit weiterzurühren, um eine vollständige Umsetzung sicherzustellen. Reaktionszeiten im Bereich von einer halben Stunde bis 5 Stunden sind üblich.

Der Reaktionsverlauf kann beispielsweise dünnschichtchromatographisch verfolgt werden. Nach Beendigung der Umsetzung werden das Lösungsmittel und die überschüssige Base bei niedriger Temperatur entfernt und das Reaktionsprodukt kann nach üblichen Verfahren, beispielsweise durch Extraktion, abgetrennt werden. Es ist im allgemeinen nicht erforderlich, das Reaktionsprodukt zu reinigen, sondern man kann es sofort ohne weitere Reinigung mit der gewünschten Aminbase umsetzen.

Dazu wird das Reaktionsprodukt in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst und dazu wird eine äthanolische oder wäßrige Lösung der entsprechenden Aminobase gegeben. Die Umsetzung wird bei Zimmertemperatur oder leicht erhöhten Temperaturen, beispielsweise bei 55°C, 5 bis 20 Stunden bzw. 1 bis 6 Stunden duirchgeführt. Der Verlauf der Umsetzung kann dünnschichtchromatographisch verfolgt werden.

Man sollte beachten, daß die notwendige Reaktionszeit nicht überschritten wird, da sich nach Beendigung der Umsetzung das Reaktionsprodukt zersetzt.

Nachdem festgestellt wurde, daß die Umsetzung beendigt ist, wird das Reaktionsprodukt aufan sich bekannte Weise isoliert. Beispielsweise kann man durch Säulenchromatographie reinigen.

Die Ausbeuten der analysenreinen Produkte liegen im allgemeinen zwischen 10 und 25% der Theorie, bezogen auf die eingesetzten Diglyceride oder die anderen entsprechenden Ausgangsmaterialien.

Im folgenden werden Beispiele für Verbindungen aufgeführt, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden können.

50 1. Lecithine und Kephaline der folgenden Formeln:

Ii

H₂C — O —C —Rt

Il

HC — O — C-R₂ (IV)

O X₁

Il e/

; — 0-P-O-AIk-N-X₂

ι \

Ο^θ Xj

Il

H₂C-O-C-R,

0 Xi

HC-O-P-O-AIk-N-X₂ (V)

le \

0 X₃

Il

H₂C-O-C-R₂

Ausgangsmaterialien sind racemische oder optisch aktive 1,2- oder 1,3-Diglyceride mit ungesättigten, gesättigten oder verzweigten Fettsäuren oder mit Fettsäuren, die einen Cycloalkan- oder aromatischen Ring enthalten.

In den obigen Formeln bedeuten X,, X₂ und Xj unabhängig voneinander je ein Wasserstcffatom oder eine Methylgruppe, Alk hat die zuvor gegebene Bedeutung.

Ri und R₂ bedeuten geradkettige oder verzweigte gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppen, die gegebenenfalls auch durch einen Cycloalkylring oder eine aromatische Gruppe substituiert sein können. Die Alkylgruppen enthalten 9 bis 25 C-Atome, bevorzugt 12 bis 18 C-Atome und am meisten bevorzugt 14 bis 18 C-Atome. Die Cycloalkylgruppen können 5 bis 7, bevorzugt 5 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten. Als aromatische Gruppen können beispielsweise Phenylgruppen oder substituierte Phenylgruppen auftreten. Bevorzugt sind R, und R₂ Fettsäurereste, wie beispielsweise Reste der Palmitinsäure, Stearinsäure.

2. Lysoverbindungen von Verbindungen der allgemeinen Formel IV oder V

Als Ausgangsmatenalien zur Herstellung der Lysoverbindungen der allgemeinen Formel IV oder V verwendet man beispielsweise l-Acyl-2-benzylglyzerin bzw. l-Benzyl-2-acylglyzerin. Biochemisch lassen sich die Ausgangsmaterialien auch aus Lecithinen und Kephalinen durch enzymatische Spaltung mit Phospholipase Aj und A₃ herstellen.

3. Analoge mit Zuckeralkoholen

Il

H₂C-O-C-R O

Il

H —C —0 —C —R O

Il

H —C —0 —C —R (Vl)

O H—C—O—C—R

Il

H—C —O —C —R

O Xi

Il a/

H₂C—O—P-O-AIk-N-X₂

I \

Ο^θ X₃

wobei in der Formel VI Alk, X₁. X₂ und X₃ die zuvor gegebenen Bedeutungen besitzen und R die gleiche Bedeutung besitzt, wie sie zuvor für Ri und R₂ angegeben wurde. Als Ausgangsmatenalien verwendet man acylierte Zuckeralkohole, die bei τ Hydroxylgruppen z-\ Acylreste enthalten, ζ ist eine ganze Zahl von 2 bis 7, bevorzugt 3 bis 6, am meisten bevorzugt 4, 5 oder 6. Man kann auch cyclische Zuckeralkohole einsetzen.

IO

4. Ätheranaloge und Ätheresteranaloge der Verbindungen der Gruppen \ bis 3 z.B.

H₂C-O-Ri

H-C-O-R₂ (VH)

O Xi

Il ./

H₂C-O-P-O-AIk-N-X₂

I \

O^e X₃

H₂C-O-Ri

H-C-O-C-R₂ (VIII)

O Xi

H₂C-O-P-O-AIk-N-X₂

I \

0^Θ X₃

wobei in den obigen Formeln VII und VIII R|, R₂, Alk, X₍, X₂ und X₃ die zuvor gegebene Bedeutung

besitzen.

Ausgangsmaterialien sind die 1,2- und 1,3-Dialkylglyzerinäther bzw. Acylglyzerinalkyläther.

5. Diiilkylketonglyzerinphophatide

25

30

H₂C-O

H —C —O

Ri

R₂

H₂C-O-P-O—AIk-N-X₂ O^s

H₂C-O

Ri

H-C — O

(X)

H₂C — O—P—O—AIk-N-X₂ Ο^θ X₃

In den obigen Formeln IX und X besitzen R₁, R₂₅ Alk, X₁, X₂ und X₃ die zuvor gegebene Bedeutung. Ausgangssubstanzen sind 1,2- und 1,3-Dialkylketonglyzerine oder entsprechende Acetale, die aus Glyzerin oder2-Benzylglyzerin durch Umsatz mit dem entsprechenden Keton oder Aldehyd erhalten werden können. Das Keton oder der Aldehyd können ebenfalls Cycloalkan oder aromatische Ringe in der Seitenkette enthalten.

35

40

45

50

55

60

6. Cycloalkylketonglyzerinphosphatide

C (CH₂)_V

H —C —O

IO

(XD

20 25 30

% 35

it ⁴⁰

H₂C-O-P-O-AIk-N-X₂
0^Θ X₃

H₂C-O

H C--O

H₂C-O

(XII)

Ρ—Ο —Alk—Ν —X₂
0^Θ X₃

7.

In den obigen Formeln XI and XII besitzen Alk, X₁, X₂ und X₃ die zuvor gegebenen Bedeutungen..y bedeutet eine ganze Zahl von 5 bis 3-2, bevorzugt 5 bis 18, mehr bevorzugt 5 bis 16, am meisten bevorzugt 5 bis 12. y kann somit 5,6,7,8,9,10,11,12 usw. bedeuten. Tn den obigen Formeln kann Alk auch 2 C-Atome enthalten.

Ausgangssubstanzen sind 1,2- und 1,3-Cycloalkylketonglyzerine, die aus Glyzerin oder 2-Benzylglyzerin durch Umsatz mit dem betreffenden Cycloalkanon erhalten werden können.

Desoxylysolecithine und -kephaline
O

Il

H₂C-O-C-R

, (xm)

i?⁴⁵	0 X, Il _β/	H₃C
[■	H₂C-O-P-O-AIk—N-X₂
	I \	I
h ΐ	0^θ X₃
\; ⁵⁰
ι
ι

60 65

Il

Η—C — 0 — C-R 0

(XIV)

Xi

H₂C-O—P-O—Alk—N-X₂

	0	ρ -t- q = m	\
O ίΐ	Ii		X₃
Η —C—O —C-R r		Xi
(CHb),	β/
	H₂C — O—Ρ—O—Alk—N—X₂
	I

ο^θ

H₃C

(CH₂),

(XV)

10 15

In den obigen Formeln besitzen Alk, Xi, X₂, X₃, R die zuvor gegebenen Bedeutungen, m ist eine ganze Zahl von 0 bis 14. bevorzugt 1 bis 8_% am meisten bevorzugt 2, 3, 4, 5 oder 6.

Dit Summe von ρ und q ergibt m.

Ausgangssubstanzen für Verbindungen der allgemeinen Formeln XIII, XIV und XV sind die entsprechenden Monoacylalkandiole, bevorzugt aber (u-ö'-Monoacylalkandiole. Die Alkandiole können gesättigt, ungesättigt oder verzweigt sein und auch ein Cycloalkan oder aromatischen Ring enthalten.

8. Ätheranaloge der Verbindungen der Gruppe 7

Die obigen Klassen von Verbindungen sind Beispiele für das erfindungsgemäße Verfahren. Das erfindungsgemäße Verfahren ist allgemein anwendbar und kann zur Synthese vieler Verbindungen eingesetzt werden. Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Verbindungen können allgemein durch Säulenchromatographie auf Kieselgel erhalten werden. Die analysenreinen Produkte sind weiße amorphe Pulver mit einem uncharakteristischen Schmelzverfahren. Die Charakterisierung erfolgt daher im allgemeinen durch Dünnschichtchromatographie und Elementaranalyse.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

35 Beispiel 1

Darstellung von Bromalkoholen verschiedener Kettenlänge nach einem vereinfachten Verfahren: Verbindungen folgender Art werden synthetisiert:

AO

Br-(CHj)_n-OH mit η = 4 bis 10

Ausgangsprodukte sind Diole entsprechender Kettenlänge mit endständigen Alkoholfunktionen. Da nur icweils ein Bromatom je Diolmolekül eingeführt werden soll, muß ein Verfahren Anwendung finden, bei dem das Reaktionsprodukt sofort aus dem eigentlichen Reaktionsmedium entfernt und damit eine weitere Reaktion ausgeschlossen wird. Hierzu bietet sich die Extraktion an.

In einem Rundkolben werden Diol und Bromwasserstoffsäure vorgelegt. Die Ausgangsprodukte werden mit l'ctroleumbenzin bzw. Bcnzol/Petroleumbenzin überschichtet. Ausschlaggebend für die Wahl des Extraktionsmittels ist die Unlöslichkeit des Diols und die gute Löslichkeit des Reaktionsprodukts hierin. Der Rundkolben wird mit einem Rückflußkühler versehen. Unter sehr starkem Rühren mit einem Magnetrührer wird anschließend unter Rückfluß bis zur vollständigen Umsetzung des Ausgangsproduktes mit einem Heizpilz erhitzt. Das Fortschreiten der Reaktion wird mit Hilfe von Dünnschichtchromatogrammen ermittelt.

Anschließend wird die Extraktionsmittelp^hase abgetrennt und mit Calciumsulfat getrocknet. Nach dem Ab- !Titrieren des Trockenmittels wird das Extraktionsmittel am Rotationsverdampfer abgezogen. Der Rückstand wird im Ölpumpenvakuum fraktioniert destilliert.

Die Ausbeuten betragen ca. 80 bis 95". der Theorie, bezogen auf den eingesetzten Diol.

4-Brom-bufanol-(l) und 5-Brom-pentanoKl) werden folgendermaßen dargestellt:

22.5 g (0,25 Mol) 1,4-ButandioI bzw. 26 g 1,5-Pentandiol (0,025 Mol) werden zusammen mit 80 g Bromwasserstoffsäure 47%ig (0,48 Mol), 500 m! Benzol und 50 ml Petroleumbenzin (Kp. 100 bis 140⁰C) 6,5 bzw. 6 std am Rückfluß erwärmt.

Die übrigen Bromalkohole werden folgendermaßen hergestellt:

29.6 g (0,25 Mol) des entsprechenden Diols werden zusammen mit 80 g (0,48 Mol) Bromwasserstoffsäure, 47%ig, 1500 ml Petroleumbenzin (Kp. 100 bis 140⁰C) am Rückfluß erwärmt.

	Reaktionsdauer	Physfkal. Konstanten
24 37 832	6,5 std	Kp₀J 58 bis 60°C
Die folgenden Reaktionsprodukte wurden hergestellt:	6 std	Kpo,s 72 bis 74°C
Reaktionsprodufct	1,5 std	Kpo,6 85 bis 87°C
4-B rombutanoH 1}	1,5 std	Kp₀₄ 87 bis 89°C
5-Brompentanol-i 1)	Istd	Kp₀^ 110bisll2°C
6-B romhexanoW I)	1 std	Kpo,4 112 bis 114°C
7-BromheptanoH 1)	30 min	Kp₀J 124 bis 126°C
8-Bromoctanoi-(l)
9-BromnonanoHl)
10-B romdecanoK 1)

Bis zum 8-Bromoctanol-(l) sind die Reaktionsprodukte farblose Flüssigkeiten. 9-Bromnonanol-(l) und 10-Bromdecanol-(l) sind bei Zimmertemperatur weiß und fest. Bromalkoholegrößerer Kettenlänge könner^nnzipiell ebenso nach diesem Verfahren hergestellt werden. Da diese Reaktionsprodukte alle fest sind, werden sie durch Umkristallisation gereinigt.

Beispiel 2
Darstellung von Lecithinen mit verändertem Phosphor-Stickstoff-Abstand im polaren Kopf: J

A. (u-Bromalkylphosphorsäuredichlorid

32 mMol = 30 ml Phosphoroxytrichlorid (frisch destilliert, Kp: 105 bis 107⁰C) in

70 ml absolutem Chloroform (90 min unter Umlauf über P₂O₅ destilliert)

werden in einem Rundkolben vorgelegt. Bei Zimmertemperatur wird zur Verdrängung von Luft kurze Zeil Stickstoff in die Lösung eingeleitet. Der Kolben wird mit einem Tropftrichter versehen und luftdicht verschlossen. Unter Rühren mit einem Magnetrührer tropft man bei Zimmertemperatur langsam unter Feuchtigkeitsaussekluß 20 mMol des Bromalkohols gewünschter Kettenlänge in 50 ml absolutem Chloroform zu. Man rührt ca. 12 std. Der bei der Reaktion entstandene Chlorwasserstoff sowie überschüssiges Phosphoroxytrichlorid und Chloroform werden bei 30⁰C am Rotationsverdampfer abgezogen. Zur Entfernung letzter Spuren von Phosphoroxytrichlorid wird Toluol zugegeben und ebenfalls abgezogen.
Der Umsatz beträgt 95 bis 100% und kann dünnschichtchromatographisch verfolgt werden.

B. Phosphorylierung

Das nach A. erhaltene (y-Bromalkylphosphorsäuredichlorid wird in 60 ml absolutem Chloroform aufgenommen und auf 0⁰C gekühlt. Unter Rühren mit einem Magnetrührer werden 10 ml Triäthylamin (getrocknet über Lithium-Aluminium-Hydrid und frisch destilliert) zugegeben. 14 mMol des entsprechenden Diglycerids, z.B.

SN-1,2-Dipalmitoyiglyzerin,

SN-l^-Dimyristoylglyzerin,
1,2-Dipentadecylketonglyzerin

oder eine andere der obengenannten Ausgangssubstanzen in 60 ml absolutem Chloroform werten bei 30 bis 35°C unter Rühren mit einem Magnetrührer und Ausschluß von Luftfeuchtigkeit langsam zugetropft.

Dünnschichtchromatographisch wird festgestellt, daß die Reaktion schon beim Eintropfen fast vollständig verläuft. Die hellgelbe Lösung färbt sich im Verlauf der Reaktion dunkelbraun. Man rührt noch 3 bis 5 std. Dann werden Chloroform und Triäthylamin am Rotationsverdampfer bei 35°C abgezogen. Das Reaktionsprodukt wird in 100 ml Tetrahydrofuran aufgenommen. Man gibt dann unter Rühren 1 m Natriumacetatlösung vom pH 8,4 solange zu, bis die Lösung schwach alkalisch bleibt. Zu dem auf diese Weise hydrolysierten Reaktionsprodukt gibt man 100 ml Diisopropyläther und rührt 1 std. Nach einer Phasentrennung extrahiert man erneut mit 50 ml Äther. Die vereinigten Ätherphasen werden 1 std über Natriumcarbonat gerührt, filtriert und dann der Äther am Rotationsverdampfer abgezogen.
Die anschließenden Umsetzungen erfolgen ohne weitere Reinigung dieses Reaktionsproduktes.

C. Umsetzung mit einer Aminobase

Das Reaktionsprodukt aus B. wird für die weitere Umsetzung zu Lecithinen in 150 ml Butanon aufgenommen. Wird ein Kephaiin dargestellt, so löst man in 50 ml Chloroform und 100 ml Methanol. Dazu gibt man 100 ml Acetonitril und 100 ml einer äthanolischen oder wäßrigen Lösung der entsprechenden Aminobase.

Das Reaktionsgefäß wird luftdicht verschlossen und entweder 1 bis 6 std bei 55°Coder 5 bis 20 std bei Zimmertemperatur gehalten. Der Fortschritt der Reaktion wird dünnschichtchromatographisch verfolgt. Wird die notwendige Reaktionszeit überschritten, so erfolgt Zersetzung des Reaktionsprodukts, was sich in einer starken Ver-

mindcrung der Ausbeute niederschlägt. Am Rotationsverdampfer werden anschließend die flüchtigen Bestandteile des Reaktionsgemisches bei 50⁰C abgezogen. Der Rückstand wird in 150 ml Chloroform aufgenommen, mit 100 ml 2% Ameisensäure und 200 ml Methanol versetzt und geschüttelt. Das Reaktionsprodukt befindet sich in derChloroformphase und wird zur Neutralisation mit 100 ml 0,1 m Natriumacetatlösung vom pH 5,6 und ml Methanol behandelt. Nach erneuter Phasentrennung wird die Chloroforrnphase über 10 gNatriumsulfat 5 getrocknet und anschließend das Chloroform am Rotationsverdampfer abgezogen.

Das so erhaltene Rohprodukt wird säulenchromatographisch gereinigt. Hierzu wird eine Säule mit einer Suspension aus 100 g Kieselgel (Mallinckrodt AR p. a.) in einem Lösungsmittelsystcm aus Chloroform : Methanol : Ammoniak = 200 : 15 :1 gefüllt. Auf diese Säule gibt man das in 10 bis 15 ml Lösungsmittel gelöste Produkt und eluiert zunächst Verunreinigungen mit dem obengenannten System. Das Reaktionsprodukt wird dann io mit Chloroform : Methanol: Ammoniak = 65 : 15 : 1 bzw. 65 : 30 :3 eluiert. Die Fraktionen werden dünnschichtchromatographiscn αϋΓ ihre Reinheit überprüft

Die Ausbeuten der analysenreinen Produkte liegen zwischen 10 und 25 % der Theorie, bezogen auf die eingesetzten Diglyceride oder andere entsprechende Ausgang* substanzen.

Es wurden die im folgenden aufgeführten Verbindungen hergestellt, wobei jeweils die Analysenwerte angege- 15 ben sind.

Gruppe 1: SN-l^-Dipalmitoylglyzerin-S-phosphorsäure-S-trirnethylarninopentylester CaHaaNOgP M : 794,15

berechnet: C 65,03 % H 11,17% N 1,76% P 3,90%
gefunden: C 64,36% H 11,04% N 1,84% P 3,91%

SN-l^-Dipalmitoylglycerin-S-phosphorsäure-o-trimethylaminohexylester M: 808,18

C₊₄H₉₀NO₉P

berechnet: C 65,39% H 11,23% N 1,73% P 3,83%

gerunden: C 66,66% H 11,45% N 1,80% P 4,08%

SN I^-Dipalmitoylglycerin^-phosphorsäure^-trimethylaminoheptylester M: 822,20 30

C₄₅H₉₂NO₉P

berechnet: C 65,74% H 11,28% N 1,70% P 3,77%

gefunden: C 64,90 ■» H 11,16% N 2,02% P 4,59%

SN-l^-Dipalmitoylglycerin^-phosphorsäure-S-trimethylaminooctylester M: 836,23

C₄₆HwNO₉P

berechnet: C66,07"O H 11,33% N 1,68% P 3,70%

gefunden: C 64,15% H 10.91% N 2,30% P 4,60% 40

SN-l^-Dipalmitoylglycerin^-phosphorsäure^-trimethylaminononylester M: 850,26

C₄₇H₉₆NO₉P

berechnet: C 66,39% H 11,38% N 1,65% P 3,64% 45

gefunden: C 66,28"«. H 11,43% N 1,85% P 3,85%

Gruppe 2: SN-l-Palmitoylglyzerin^-phosphorsäure-S-trimethyl-aminopentylester Ca₇HSgNOsP M: 537,72

berechnet: C 58,35% H 10,52% N 2,52% P 5,57% 50

Die erhaltenen Analysenwerte stimmten mit den berechneten überein.

Gruppe 3: l,2,3A5-Pentamyristayl-D-mannit-6-phosphorsäure-7-trimethy]aminoheptyIester CmHimNOmP

M: 1541,31 55

berechnet: C 71,69"» H 10,86% N 0,91% P 2,01%

Die erhaltenen Analysenwerte stimmten mit den berechneten überein.

Gruppe 4: a) l-Palmitoyl^-hexadecylätherglyzerin-S-phosphorsäure^-trirnelhylaminononylester C₄₇H₉₈NO₈PM: 836,27

berechnet: C 67,50% H 11,81% N 1,67% P 3,70%

Die erhaltenen Analysenwerte stimmten mit den berechneten überein.

11

b) l^-Dioctylätherglyzerin^-phosphorsäure-o-trimethylaminohexylester C₂₈H₆INOtP M: 555,78 berechnet: C 60,51% H 11,24% N 2,52% P 5,57% Die erhaltenen Analvsenwerte stimmten mit den berechneten überein.

Gruppe 5: l^-Dipentaderylketonglyzerin-S-phosphorsäure-o-trimethylaminohexylester C43H90NO7P M: 750,12

berechnet: C 67,25% H 11,83% N 1,87% P 4,13% gefunden: C 67,28% H 11,87% N 1,82% P 4,14%

l^-Dipentadecylketonglycerin-S-phosphorsäure-S-trimethylaminopentylester M: 736,11

berechnet: C 66,90% H 11,78% N 1,90% P 4,21% gefunden: C 67,06% H !1,78% N 2,06% P 4,22%

l^-Dipentadecylketonglycerin-S-phosphorsäure-S-trimeiiiylaminooctylester M: 778,19 C₄₅H₅₄NO₇P

gefunden: C 68,21% H 11,93% N 1,89% P 3,95%

Gruppe 7: l-Myristoylpropandioi-3-phosphorsäure-4-trimethylau5inobutylester C₂₄Hs₂NO₇P M: 497,65 berechnet: C 57,92% H 10,53% N 2,81% P 6,22% Die erhaltenen Analysenwerte stimmten mit den berechneten überein.

Gruppe 8: l-TetradecylätherpropandioW-phosphorsäare^-trfmethylaminobutylester C₂₄Hs₄NOeP M: 483,67 berechnet: C 59,60% H 11,25% N 2,90% P 6,40% Die erhaltenen Analysenwerte stimmten mit den berechneten überehi.

12

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung synthetischer Phospholipide, dadurch gekennzeichnet, daß man

5 A) eine Polyhydroxyverbindung mit einer freien Hydroxylgruppe, deren weitere Hydroxylgruppen geschützt sind, mit einem o-Halogen.alkylphosphorsäuredichlorid der allgemeinen Formel

Cl O

Ml
10 P—O—Alk—X Q)